基因文库

第九章基因文库第一节基因组文库第二节cDNA文库第三节基因文库筛查 将某种生物细胞的基因组或染色体DNA的所有限制酶切片断 或机械剪切片段 随机地连接到基因载体上 然后转移到适当的宿主细胞中 通过细胞增殖而构成含各个随机片段的一系列无性繁殖系 DNA克隆 当DNA克隆数目足以包括该种生物的全部基因时 这些克隆的总体就称为该种生物的基因文库 每一DNA克隆内所包含的靶DNA片段既可能是一个或几个基因 也可能是一个基因的一部分 或完整基因及其两侧的邻近序列 或非编码序列 基因文库与基因库的概念不同 基因库是指某种生物的全部基因 是基因的总和 而基因文库是某种生物基因组DNA的全部随机片段 是序列信息的总和 第一节基因组文库基因文库是整个基因组的不同DNA片段的集合体 每个片段被分别构建成为DNA克隆 这些克隆的总体称为基因文库 由基因组DNA为起始材料所构建的基因文库称为基因组文库 由cDNAs为起始材料所构建的基因文库称为cDNA文库 好的基因文库相对于起始材料应有足够的代表性 也即是在DNA的分离提取及克隆操作过程中不会丢失某些必要的序列 由于cDNA文库来源于总mRNA 所以基因组文库包含的序列信息远远大于cDNA文库 基因组DNA 随机片段 重组体DNA 基因组文库 宿主基因组DNA 1 代表性文库理论上 一个基因组文库应包括基因组DNA的全部序列 一个高质量的基因组文库应包含尽可能多的起始基因组DNA序列 若一个基因组文库所包含的克隆数目不够多 就有可能使某些序列丢失 基因组文库所需的克隆数与文库含有各个序列片段的概率之间关系可用下列公式表示 N ln 1 P ln 1 f N 所需克隆数 P 文库含各序列的概率f 随机片段占基因组的比例 如果E coli随机片段的大小为20kb 要求含有各序列的概率为0 99 其基因库的克隆数应为 N ln 1 0 99 ln 1 2 104 4 6 106 1100若以同样的片段大小和概率构建人类的基因文库 则所需克隆数为 N ln 1 0 99 ln 1 2 104 3 109 690000减少所需克隆数的方法是增加克隆片段的长度 因此 应根据起始基因组的大小 选容量合适的基因载体 即大的基因组应选用容量较大的基因载体 如BACs和YACs 小的基因组可选用容量较小的基因载体 如质粒 噬菌体载体 Cosmids等 2 构建基因组文库的程序 基因组DNA分离提取组织细胞 研磨萃取 分离基因组DNA DNA纯化 重组体DNA制备与转化基因组DNA 随机片段 重组体DNA限制性内切酶 基因载体 转化 细胞培养 液体 基因组文库 平板培养 基因组DNA 酶切DNA 酶切载体 转化 筛选转化子 基因组文库 第二节cDNA文库 cDNA文库是cDNA克隆的集合体 每个cDNA克隆的靶DNA来自总mRNA反转录产生的一个随机cDNA分子 这些cDNA克隆构成文库 总mRNA是基因组转录的产物 有时空特性 即特定组织细胞在特定生长发育阶段或特定环境中的基因表达 故cDNA文库也称表达文库 特定组织细胞在特定发育时期或特定环境条件下的总mRNA也称为转录组 transcriptome 理论上 一个cDNA文库应该对应于一个转录组 一个生物体或一种生物的基因组文库是相同的 但其cDNA文库则有可能是不同 理论上 一种生物各个cDNA文库的总和应等于其基因库 1mRNA分离提取及纯化磁珠分离法磁珠 mRNA 磁铁 磁珠 纯化的mRNA 总RNA 摇晃振荡 tRNArRNA Poly T 通过寡聚T 纤维素的mRNA分离纯化 总RNA tRNArRNA mRNA 寡聚T 纤维素 吸附mRNA 洗脱mRNA Poly T 2cDNA合成mRNADNAfirststrand反转录酶活性 cDNA mRNA cDNA mRNA sscDNA dscDNAH酶活性DNA聚合酶活性纯化cDNA样品 3cDNA克隆和cDNA文库构建cDNA与适配器 人工接头 带有一个限制性内切酶的识别序列 的连接 限制酶分别切割cDNA与载体DNA分子 载体与cDNA连接构建重组体DNA分子 重组体DNA转化宿主细胞与转化细胞培养 平板培养与各个cDNA克隆分离培养 重组子筛查与cDNA文库构建 理论上 一个cDNA文库只占基因组的部分基因 也只包括基因组文库的一部分序列 而且 cDNA文库具有时空特异性 所对应的只是特定组织细胞在特定时期的基因表达 平板培养 cDNA文库 第三节基因文库筛查1 文库筛查方法 基因文库筛查是从基因文库中寻找出含有所需靶DNA片段或靶基因的特定DNA克隆 靶DNA克隆可用DNA探针通过分子杂交方法来筛选 靶基因克隆可通过文库的各个DNA克隆的相关蛋白质的检测来筛选 其他方法还包括 表达筛查 菌落或噬菌斑杂交和染色体步移等 DNA探针杂交各DNA克隆的DNA样品 NC膜 含标记探针的缓冲液 靶DNA克隆 菌落杂交或噬菌斑杂交 平板培养 NC膜转移 碱变性烤膜 探针杂交 显示标记 查出所需DNA克隆 染色体移步从S基因开始查找O基因染色体片段三套不同酶切片段所构建的文库基因S为探针筛查 QRS RST STU以QRS为探针筛查 OPQ PQR QRS RST STU以PQR为探针筛查 NOP OPQ PQR QRS RST以OPQ为探针筛查 MNO NOP OPQ PQR QRS从OPQ再克隆O基因或DNA片段 2表型克隆筛选表型克隆策略不依赖于基因的序列信息 只比较突变型DNA与野生型DNA的差异 直接对变异的DNA进行分离 它的特点是从表型差异入手 克隆突变基因相关的DNA 表型克隆研究的主要技术方法有 差异显示反转录PCR differential displayRT PCRDDRT PCR 消减杂交 subtractivehybridization SH 抑制性消减杂交 suppressionsubtractivehybridization SSH 等 2 1DDRT PCR两个有表型差异的同种生物必然存在着某些基因转录水平的差异 转录水平的差异导致mRNA在质 种类 和量上的差异 通过反转录和PCR可将其间的差异扩大而易被检测出来 有差异的cDNA带可能与性状变异相关 根据差异cDNA带设计探针可用于筛查含有相关基因的克隆 DDRT PCRmRNA dscDNA randomprimerand poly A 10 12NN PCR 电泳及电泳图谱成像 寻找差异cDNA带 设计探针 分子杂交筛查DNA克隆 反转录 2 2消减杂交 以两个表型差异明显的个体提取两个基因组DNA样品 或突变型与野生型 进行限制酶切 两个DNA样品的ssDNA片段除了个别差异 绝大多数可以互补配对 只有差异的片段或基因片段才必须与原样品的互补单链配对 通过载体连接将差异片段 互补配对后产生粘性末端 形成重组体DNA 扩增差异DNA片段设计探针可筛查出含有特异基因DNA克隆 克隆筛选 NormalDNAsample Restrictiondigest DriverDNA Randomshearing MutantDNAsample TargetDNA 200 1 探针 对照 待测 3DNA克隆分析寻找出目标DNA克隆之后