细胞分离与培养技术ppt课件.ppt

临床药理研究所 细胞分离与培养技术 1 现代生物技术 基因工程技术 细胞工程技术 酶工程技术 发酵工程技术 细胞培养 2 细胞分离技术 从血液 体液中分离细胞从原代组织中分离细胞从原培养容器中分离细胞 传代培养 原代培养 3 细胞分离技术 从血液 体液中分离细胞 采血方法 人静脉穿刺 耳垂或手指针刺采血 小动物 大鼠 小鼠 剪尾法 眼眶采血 心脏穿刺法 断颈取血或股动脉放血 兔耳静脉或动脉穿刺取血 4 细胞分离技术 从血液 体液中分离细胞 血液抗凝方法 肝素法 按每ml血液约用0 1 0 2mg肝素 即5 肝素溶液2 4 l 草酸盐法 取草酸钾0 2g 草酸铵0 3g 加双蒸水10ml溶解后 取0 2ml放入5ml的试管中 使其干燥 若采用5ml以下的血液可直接注入此试管中 轻轻摇晃 枸橼酸钠法 先配制2 枸橼酸钠 取0 15 0 2ml加于1ml血液中即可抗凝 EDTA法 186 1 每ml血液中加0 5mmol LEDTA2 l 5 细胞分离技术 从血液 体液中分离细胞 体液标本采集 在局部70 酒精消毒灭菌后 用灭菌注射器穿刺入体腔 如胸腔 腹腔 关节腔等 抽取液体样品 膝关节腔穿刺 胸腔穿刺 6 细胞分离技术 从血液 体液中分离细胞 血样中红细胞和白细胞的分离 利用细胞的相对密度或大小不同而沉降速度不同的原理 以自然沉降法结合不同速度的离心沉降法将不同的细胞分离 抗凝血 室温或37 下直立静置30 60min 红细胞沉降至下层 中间乳白色薄膜层为白细胞及血小板 上层为淡黄色血浆 也可将抗凝血与3 明胶 经灭菌消毒 等量或3 l量混合于离心管中 直立静置30 60min 红细胞沉于管底 上层乳白色混浊液含白细胞 7 细胞分离技术 从血液 体液中分离细胞 血中单个核细胞的分离 单个核细胞包括淋巴细胞和单核细胞 其相对密度在1 050 1 077之间 采用速度沉降法原理使其分离 淋巴细胞分离液 8 细胞分离技术 从血液 体液中分离细胞 血中单核细胞的分离 利用细胞在培养过程中贴壁时间的早晚不同进行细胞分离 单个核细胞悬液 多将悬液放入12cm直径的培养皿中 于37 培养箱中静置30 60min 此时单核细胞贴壁 而淋巴细胞尚未贴壁 倾出未贴壁细胞 并用Hanks液轻轻冲洗培养皿以尽量洗下未贴壁细胞 淋巴细胞 用Hanks液强力冲洗吹打与震荡 将贴壁的单核细胞冲落或用刮刀轻刮 收集贴壁的单核细胞 计数后分别制备所需浓度的细胞悬液 9 细胞分离技术 从血液 体液中分离细胞 黏附法分离血中单核细胞 T B淋巴细胞 因B淋巴细胞和单核细胞能黏附于尼龙纤维柱上 聚酰胺纤维柱 所以可将其与T淋巴细胞分离 10 具体步骤 单个核细胞用含20 小牛血清RPMI 1640制成 2 5 3 107 ml的细胞悬液 先用Hanks液 再用含20 小牛血清的RPMI 1640液冲洗平衡尼龙纤维柱 冲洗液尽量流净 将尼龙柱预温37 再用配制的单个核细胞悬液2ml装入尼龙纤维柱 不使流出 37 温箱内静置l小时 取下注射针头 用预温37 含20 小牛血清的RPMI 1640培养液冲洗尼龙纤维柱 洗出者即为未黏附的T淋巴细胞 从注射器内取出尼龙纤维 在4 的RPMI 1640液内漂洗 并轻轻挤压 将黏附的B细胞洗脱收集 B淋巴细胞中混有的单核细胞可用贴壁法将其分离 收集的T B淋巴细胞可分别用Hanks液悬浮 洗涤 离心 250g 7min 并重复洗涤3次 计算活细胞 计数悬液中的细胞数后制备所需浓度的T和B淋巴细胞悬液 11 细胞分离技术 从血液 体液中分离细胞 免疫磁珠法 MACS 分离T B淋巴细胞 磁性微珠是20世纪80年代初以高分子材料和金属离子 如Fe3O4 为原料聚合而成的一种以金属离子为核心 外层均匀地包裹高分子聚合体的固相微粒 即磁性微珠 在液相中 受外加磁场的吸引作用 磁性微珠可快速沉降 以磁性微珠为载体 包被上针对某种细胞表面抗原的特异性抗体即可制成免疫磁性微珠 12 细胞分离技术 从血液 体液中分离细胞 免疫磁性微珠用于细胞的分离和纯化的基本原理及步骤是 首先将抗特异细胞表面抗原的抗体致敏到磁珠上 待它与混合体系中的细胞反应后 利用磁力的作用 使与致敏结合的细胞与其它物质分离 达到纯化 分离的目的 通常有二种分离方式 阳性分离和阴性分离 阳性分离是直接从细胞混合液中分离出靶细胞 阴性分离是利用磁珠去除无关细胞 使靶细胞得以分离 13 细胞分离技术 从血液 体液中分离细胞 免疫磁珠分离细胞已被广泛应用于人类各种细胞的分离 如T CD3 B CD19 淋巴细胞 内皮细胞 CD34 造血祖细胞 CD34 单核 巨噬细胞 CD14 胰岛细胞 胰岛GK和GLUT2 葡萄糖转运子 多种肿瘤细胞等 14 细胞分离技术 从血液 体液中分离细胞 15 细胞分离技术 从血液 体液中分离细胞 16 细胞分离技术 从血液 体液中分离细胞 17 细胞分离技术 从血液 体液中分离细胞 MACS技术优点 稳定 高质量的分选 纯度 90 99 对细胞无损伤操作简便 快速 消毒方便 手动分选30分钟内完成 autoMACS分选2 5 10分钟之内完成 从实验室到临床 MACS技术可以实现105 1011个细胞分选 有autoMACS和CliniMACS 分选后细胞适用于后续实验 分选后适用于细胞培养和体内实验 分选得到的标记和未标记细胞组分均可回收利用 从细胞到分子分选 不仅可以分选各种细胞 还可以分选转染细胞 亚细胞物质 蛋白质 DNA RNA及mRNA MACS技术缺点 分离效率较流式细胞仪分选略低且耗材相对较贵 适合无大型流式细胞仪设备且对分选细胞纯度要求不高的分选 只适用于简单标记的细胞分离 18 细胞分离技术 从血液 体液中分离细胞 流式细胞术分离法分离T B淋巴细胞 密度梯度离心法分离单个核细胞 用RPMI 1640培养基配成1 107 ml 加适量FITC 抗CD3或FITC 抗CD19 4 孵育30min 用RPMI 1640培养基洗2次 用流式细胞仪进行分析 在散射光参数图上选取淋巴细胞群 在荧光参数图上选取绿色荧光阳性的细胞进行分选 19 细胞分离技术 从血液 体液中分离细胞 注意事项 分选细胞常用于细胞亚群进一步的功能研究 因此 整个过程均需要严格无菌操作 流式细胞仪进行无菌冲洗 此法分离得到的T细胞纯度可达到99 收获率可达到90 由于喷嘴孔很小 约70 100 m 分选前用30 40 m孔径的滤网过滤细胞悬液 以免堵塞喷嘴 20 细胞分离技术 从血液 体液中分离细胞 优缺点 流式细胞仪分选纯度较高 回收率高 分选一些具有比较复杂细胞标记的细胞时相当有用的 例如要分选出白血病人骨髓中某些CD34 CD13 CD45dim的幼稚细胞 只需要在流式上简单地逻辑设门就可以了 而且流式可以双通道分选 也就是同一时间分选出两种细胞 流式分选成本比磁珠低 流式分选最致命的缺点就是污染 且设备昂贵 技术复杂 需专业技术人员操作 操作费时 适合对细胞纯度和回收率要求较高的分选 21 细胞分离技术 二 从原代组织中分离细胞组织和器官采集 人标本 可采取无菌手术法切取少量所需的组织或器官 活检和手术 大量的动物组织 先麻醉或处死 浸入70 酒精中 使毛皮全部浸湿 从腹中线剪开皮肤 注意不要剪开胸腔或腹腔 将皮肤向上 下撕开分离并向上 下翻开 暴露胸腹部的筋膜 用生理盐水洗净黏于筋膜上的断毛 以碘酒和70 酒精消毒后 更换一套消毒灭菌的器械 剪开胸腔或腹腔 无菌采取所需器官 动物的骨髓 可以无菌手术采取一段股骨 用灭菌注射器 将小牛血清或培养液从断端一端加压注射以从另一断端出骨髓 22 细胞分离技术 从原代组织中分离细胞 制备细胞悬液方法 将组织块分离 散 成细胞悬液的方法有多种 最常用的是机械解离细胞法 酶学解离细胞法以及螯合剂解离细胞法 从原代组织中获得单细胞悬液的一般方法是酶解聚 细胞暴露在酶中的时间要尽可能的短 以保持最大的活性 包括胰蛋白酶 胶原酶和中性蛋白酶等 23 细胞分离技术 从原代组织中分离细胞 1 胰蛋白酶 Trypsin 在去除不需要的组织后 使用无钙镁的平衡盐溶液清洗组织块 重复清洗2到3次 用无菌的解剖刀和剪子把组织切成1 2mm3小块 将盛有组织碎片的容器置于冰上 加入0 25 溶解在无钙镁的平衡盐溶液中的胰蛋白酶 100mg组织加入1ml胰蛋白酶 24 细胞分离技术 从原代组织中分离细胞 在4 孵育6到18小时 使胰蛋白酶尽可能渗透进去 移弃组织碎片中的胰蛋白酶 在37 孵育包含残留胰蛋白酶的组织碎片20到30分钟 在组织碎片加入热的完全培养基 用移液管轻轻地分散组织 如果使用无血清培养基 要加入大豆胰蛋白酶抑制剂 通过无菌不锈钢丝网 100 200目 过滤 计数和接种细胞 进行培养 25 细胞分离技术 从原代组织中分离细胞 2 胶原酶 Collagenase 用无菌解剖刀和剪子把剩余组织切成1 2mm3小块 用Hanks 平衡液 HBSS 清洗组织碎片几次 加入胶原酶 50 200单位 ml 溶解在HBSS中 在37 孵育4到18小时 加入3mMCaCl2增加解离效率 26 细胞分离技术 从原代组织中分离细胞 通过离心在HBSS中清洗悬液几次 再一次在培养基中悬浮细胞 计数和接种细胞 进行培养 通过无菌不锈钢丝网或尼龙网过滤细胞悬液 分离分散细胞 组织碎片和较大的碎片 如需进一步的解聚 在碎片中加入新鲜的胶原酶 27 细胞分离技术 从原代组织中分离细胞 3 中性蛋白酶 Dispase 用无菌解剖刀和剪子把剩余组织切成1 2mm3小块 用不含钙镁的平衡盐溶液清洗组织碎片几次 加入Dispase 0 6 2 4单位 ml溶解在无钙镁的平衡盐溶液 在37 孵育20分钟到几个小时 28 细胞分离技术 通过无菌不锈钢丝网或尼龙网过滤细胞悬液 分离分散细胞 组织碎片和较大的碎片 如需进一步的解聚 在碎片中加入新鲜的Dispase 通过离心在平衡盐溶液中清洗悬液几次 再一次在培养基中悬浮细胞 计数和接种细胞 进行培养 29 细胞分离技术 从原代组织中分离细胞 举例 滑膜细胞的胶原酶 胰蛋白酶消化分离法 无菌取滑膜组织 去除脂肪 纤维等 用D Hank s液 无Ca2 Mg2 含青霉素200kU L 1 链霉素200mg L 1 反复冲洗后剪成1 2mm3小块 离心洗涤2次 置于加入2ml含10 胎牛血清 0 4 型胶原酶的DMEM培养液的培养瓶中 在37 5 CO2培养箱中消化2h 每隔10min吹打1次 30 细胞分离技术 从原代组织中分离细胞 再加入含0 25 胰蛋白酶的D Hank s液4ml 培养消化30min 将培养液移至离心管中 1200rpm离心10min 弃上清 200目尼龙网纱过滤 1200rpm离心10min 弃上清 将获得的细胞在37 5 CO2培养箱中培养24h 弃去未黏附细胞 如淋巴细胞 红细胞 此时的贴壁细胞即为原代滑膜细胞 31 细胞分离技术 从原代组织中分离细胞 4 组织块培养法举例 成纤维样滑膜细胞组织块培养法 无菌取滑膜组织 去除脂肪 纤维等 用不含钙镁的D Hank s液 含青霉素200kU L 1 链霉素200mg L 1 反复冲洗后剪成1 2mm3小块 用吸管吸取均匀排列于培养瓶 预先用含20 胎牛血清DMEM培养液湿润 的底壁 瓶底朝上 37 5 CO2培养箱中培养3h 使其贴壁 32 细胞分离技术 从原代组织中分离细胞 待细胞快长满时用0 25 胰蛋白酶消化细胞并传代培养 取第3 5代细胞用于实验 观察到有大量成纤维细胞长出后轻轻去除组织块 继续培养 轻轻翻转培养瓶 使培养液刚刚覆盖组织块 每隔2 3天换一次培养液 33 成纤维样滑膜细胞组织块培养法 培养24h 培养96h 培养120h 34 细胞分离技术 从原代组织中分离细胞 举例 初步淋巴细胞分离法 放血处死动物 无菌取胸腺和脾组织 去除脂肪和结缔组织 放入盛有含5 小牛血清的D Hank s液 不含钙镁 含青霉素200kU L 1 链霉素200mg L 1 平皿的网纱中 200目 用注射器针芯轻轻碾碎胸腺和脾组织 使单个细胞经网进入溶液中 溶液移入离心管中 1200rpm离心10min 弃上清 D Hank s液洗涤细胞 加入DMEM培养液计数和调节细胞浓度 进行培养 35 细胞分离技术 从原代组织中分离细胞 举例 乳鼠原代心肌细胞培养法 基本原理 心肌细胞培养方法有离体心脏灌注法 酶消化法和组织块法 将心肌组织分离成单个细胞 用培养基制成心肌细胞悬液 在体外适宜条件下使之生长繁殖 并保留其结构与功能特性 36 细胞分离技术 从原代组织中分离细胞 评价 离体心脏灌注法对乳大鼠来说实施难度大 酶消化法操作流程长 细胞对消化酶浓度及作用时间要求严格 但是能得到大量单细胞 组织块法操作简单 实验成本低 可得到具较高纯度的心肌细胞 因此 心肌细胞原代培养常用的方法多用酶消化法和组织块法两种 37 细胞分离技术 从原代组织中分离细胞 心肌细胞的酶消化培养法 1 心肌组织的选择 生后1 4天的Wistar乳鼠心脏等 2 心肌组织块的制备 乳鼠用75 乙醇 1 新洁尔灭消毒皮肤 无菌开胸 暴露心脏 于心脏收缩期剪下心脏 置于盛D Hank s液的培养皿中 剪开心脏 清洗三次 以去除血污 38 细胞分离技术 从原代组织中分离细胞 3 心肌细胞悬液的制备 取心尖部组织 心室 剪为1mm3碎块 在大离心管中放入组织碎块 加入0 06 0 25 的胰蛋白酶溶液8 15ml 在磁力搅拌器上 37 水浴消化10min 自然沉淀后弃上清 剩余组织块中再加入新胰蛋白酶 消化10min 静置后将上清液移入盛有15 新生牛血清培养液的离心管中终止消化 并以1000rpm离心10min 弃上清 用培养液充分吹打成单细胞悬液 剩余沉淀用同样条件及方法反复消化 直至将组织基本完全消化为止 分次收获心肌细胞 39 细胞分离技术 从原代组织中分离细胞 4 心肌细胞悬液的接种 将分次收获的心肌细胞用Hank s液离心清洗1 2次 弃上清液 将沉淀细胞定量加入培养基3 5mL 吹打混匀 制成细胞悬液 应用白细胞计数板计数细胞 调整至所需浓度 37 5 CO2培养箱培养 5 细胞纯化 培养2h 将细胞悬液进行换瓶培养 去除瓶底的贴壁细胞 2h后 去除瓶底的贴壁细胞 重复一次 方法同前 以去除成纤维细胞 纯化心肌细胞 40 细胞分离技术 从原代组织中分离细胞 心肌细胞的贴块培养法 1 取材 按前述方法取出心脏 置于盛Hank s液的培养皿中 清洗三次 2 贴块 将心脏剪为1mm3大小的小块 移入培养瓶底面 用无菌牙科探针将其均匀铺开 3 干固 盖上瓶盖 37 烤箱培养瓶翻转干固1 1 5h 4 接种培养 添加少量培养基 以恰好盖住组织块为佳 次日加足培养液 41 42 细胞分离技术 三 从原培养容器中分离细胞 传代培养 贴壁细胞