荧光法测定药片中维生素B2含量总论ppt课件.pptVIP

荧光分光光度法测定药片中维生素B2的含量 1 荧光分光光度法测定药片中维生素B2的含量 实验目的 学习荧光分光光度法测定药片中维生素B2的分析原理 掌握荧光分光光度计的操作技术和测定药片中维生素B2的方法 掌握Origin绘图软件的使用方法 2 实验原理 常温下 处于基态的分子吸收一定的紫外可见光的辐射能成为激发态分子 激发态分子通过无辐射跃迁至第一激发态的最低振动能级 再以辐射跃迁的形式回到基态 发出比吸收光波长长的光而产生荧光 3 实验原理 在稀溶液中 荧光强度IF与物质的浓度c有以下的关系 当实验条件一定时 荧光强度与荧光物质的浓度成线性关系 这是荧光光谱法定量分析的理论依据 4 a 与紫外 可见分光度法比较 荧光分析法具有更高的灵敏度 b 选择性好 荧光法既能依据发射光谱 又能依据吸收光谱来鉴定物质 c 所需试样量少 操作方法简便 5 激发光谱 固定测量波长 选最大发射波长 化合物发射的荧光强度与激发光波长的关系曲线 激发光谱曲线的最高处 处于激发态的分子最多 荧光强度最大 激发光谱 6 发射光谱 固定激发光波长 选最大激发波长 化合物发射的荧光强度与发射光波长关系曲线 固定发射光波长进行激发光波长扫描 找出最大激发光波长 然后固定激发光波长进行荧光发射波长扫描 找出最大荧光发射波长 激发光波长和发射荧光波长的选择是本实验的关键 发射光谱 7 常用的荧光分析仪器由激发光源 单色器 液槽 检测器和显示记录器五部分构成 如下图所示 8 荧光分析仪器与分光光度计比较主要差别有两点 a 荧光分析仪器采用垂直测量方式 以消除透射光的影响 b 荧光分析仪器有两个单色器 能够获得单色性较好的激发光并消除其它杂散光干扰 9 a 光源 在荧光计中常用卤钨灯作光源 荧光分度计常采用高压汞灯或氙弧灯做光源 b 单色器 荧光计的单色器是滤光片 只能用于定量分析 荧光分光光度计采用两个光栅单色器 可获得激发光谱和荧光光谱 c 检测器 荧光计采用光电管作检测器 荧光分光光度计采用光电倍增管作检测器 仪器部件 10 维生素B2 又叫核黄素 VB2 是橘黄色无臭的针状结晶 其结构式为 维生素B2易溶于水而不溶于乙醚等有机溶剂 在中性或酸性溶液中稳定 光照易分解 对热稳定 11 维生素B2溶液在430 480nm蓝光的照射下 发出绿色荧光 其峰值波长为525nm VB2的荧光在pH 6 7时最强 在pH 11时消失 维生素B2在碱性溶液中经光线照射会发生分解而转化为光黄素 光黄素的荧光比核黄素的荧光强的多 故测VB2的荧光时溶液要控制在酸性范围内 且在避光条件下进行 12 光黄素 13 实验预习 预习荧光分光光度法测定维生素B2的分析原理 了解荧光光度计的操作步骤和测定维生素B2的方法 14 F 4500型荧光光度计 日本日立公司 10mL具赛试管10只 移液枪1只 100mL容量瓶2只5 10 5g mL 1VB2标准溶液 置阴暗处保存 冰乙酸 AR 药用VB2试样 5 10 4g mL 1 仪器与试剂 15 1 打开计算机 先接通电源开关 POWER 5秒钟后再按下XeLAMP按钮 再接通主开关 MAIN 此时主开关上方绿色指示灯连续闪动三下 然后打开操作软件 2 仪器初始化完毕后 在工作界面上选择测量项目 设置适当的仪器参数 激发波长 发射波长 3 样品测定 4 关机顺序 逆开机顺序实施操作 基本操作 16 1 标准系列溶液的配制及标准溶液荧光强度的测定 在10个干净的10mL具赛试管中 分别吸取25 50 75 100 125 150 175 200uLVB2标准溶液 用石英亚沸水稀释至刻度 摇匀 从稀到浓测量系列标准溶液的荧光强度 实验步骤 17 2 未知试样的测定 在两支10mL具赛试管中 分别移取100uL试样 用石英亚沸水稀释至刻度 摇匀 用测定标准系列时相同的条件 测量其荧光强度 实验步骤 18 1 用标准系列溶液的荧光强度绘制标准工作曲线 2 根据待测液的平均荧光强度 从标准工作曲线上求得其浓度 计算出试样中VB2含量 数据处理 19 1 解释荧光光度法较吸收光度法灵敏度高的原因 2 维生素B2在pH 6 7时荧光最强 本实验为何在酸性溶液中测定 注意事项和问题 20 1 波长扫描 WavelengthScan 对样品进行激发波长或发射波长的扫描 点击快捷栏 Method 显示出 AnalysisMethod 的五个命令 分别为General 常规 Instrument 仪器条件 Monitor 模拟监测 processing 处理方法 Report 报告格式 输入相应数据 附录 仪器操作软件有关说明 21 1 1GeneralMeasurement 选择Wavelength1 2InstrumentScanmode 输入扫描方式Datamode 输入数据采集方式EMWL 输入发射波长EXStartWL 输入激发起始波长EXEndWL 输入激发终止波长EXWL 输入激发波长EMStartWL 输入发射起始波长EMEndWL 输入发射终止波长 附录 仪器操作软件有关说明 22 Scanspeed 扫描速度选择Delay 延迟时间EXSlit 激发单元狭缝EMSlit 发射单元狭缝PMTVoltage 光电管负高压Response 响应速度Correctedspectra 光谱校正Shuttercontrol 光闸控制Replicates 重复次数Cycletime 循环周期 附录 仪器操作软件有关说明 23 1 3MonitorY AxisMax 纵轴标尺上限值Y AxisMin 纵轴标尺下限值2 时间扫描 TimeScan 此扫描方式是EX EM的波长均固定 仅观察样品随时间的变化 模拟画面的横坐标为时间单位 进入方法与波长扫描相同 2 1GeneralMeasurement 选择TimeScan2 2InstrumentDatamode 数据采集方式EXWL 设定激发波长EMWL 设定发射波长Timeunit 时间单位Scantime 扫描周期 附录 仪器操作软件有关说明 24 2 3其它与波长扫描相同 从略 3 光度法 Photometry 也称工作曲线法 是定量测量方法 有六个子命令 分别为General Quantitation Instrument Standards Monitor Report 输入相应测量条件后进行测量 3 1GeneralMeasurement 选择Photometry 附录 仪器操作软件有关说明 25 3 2QuantitationQuantitationtype 选测量类型Calibrationt