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图解微流控芯片实验室 读书报告 1 内容提要 绪论芯片材料与制作技术表面改性技术微流体驱动与控制技术进样与预处理微混合与微反应微分离技术液滴技术检测技术应用 核心技术 2 一 认识微流控芯片实验室 3 1 什么是微流控芯片实验室 微流控芯片实验室又叫微流控芯片或芯片实验室 它将生物和化学领域所涉及的基本操作单元集成在一块几平方厘米的芯片上 操作单元尺寸在微米量级 4 如图所示 微流控芯片的基本构成是各种储液池及联接他们构成体系的微通道网络 5 2 微流控芯片实验室的优势 将多种单元技术在整体可控的微小平台上灵活组合 规模集成 大幅缩短样品处理时间 显著提高分辨率 灵敏度 大幅降低消耗和成本 6 3 微流控芯片实验室的最终目标 使实验设备小型化 家庭化 最终实现检测等仪器的普及化 从根本上改善人类生存质量 7 二 微尺度下的流体 8 1 微尺度下流体的特征 微尺度下流体的最主要特征是层流和电渗 9 2 层流 判断流体流动是层流还是湍流要看雷诺系数Re Re小于2000是层流 大于4000是湍流 在微流体流动过程中 惯性力影响很小 黏性力起主导 Re大约在10 6 10 远小于2000 所以是典型的层流 10 层流提供了在微小空间内控制样品浓度 宽度 温度等指标的可能性 是微流控芯片得以实现强大功能并且具有宽广应用面的重要原因 11 3 传质 由于流体在微通道中以层流形式运动 层与层之间的质量传递主要依靠扩散 扩散传质的公式为 2t l2 D t为达到稳态的时间 l为传质距离 D为扩散系数 12 4 电渗 电渗是一种流体相对于带点管壁移动的现象 电渗的产生和偶电层有关 在pH 3的条件下 微通道内壁通常带负电 表面电离或吸附 于是表面附近的液体中形成了一个带正电的偶电层 stem层和扩散层 在平行于内壁的外电场作用下 偶电层中的溶剂化阳离子或质子引起微通道内流体朝着负极方向运动 13 14 电渗流速计算公式 是zeta电势 是介电常数 是外电场 是流体粘度 15 电渗驱动的特点 流速大小可由外电场线性调节外加电场电极可以集成在芯片上 从而缩小了芯片流体驱动系统体积各种芯片材料都可以诱导电渗流流体前沿为扁平状 16 三 芯片材料和芯片制作技术 17 1 制作材料 常用的芯片材料有单晶硅片 石英 玻璃和有机聚合物如PMMA PDMS PC以及水凝胶 他们具有良好的生化相容性 光学性能 其表面具有良好的可修饰性 下表为常见芯片制作材料的基本性能 18 19 2 芯片的制作 玻璃等芯片制作的主要步骤包括 涂胶 曝光 显影 腐蚀和去胶 高分子聚合物芯片的制作技术主要包括热压法 模塑法 注塑法 激光烧蚀法 LIGA法和软刻蚀法等 20 四 表面改性技术 21 1 为什么要表面改性 微流控芯片中比表面积大 表面效应显著 表面重要性被强化 微流控芯片材质多样 增加了芯片表面的复杂性 微流控芯片中的芯片分离 反应和细胞培养等单元技术对表面性质的需求不同 22 2 改性目的 减小表面非特异性作用增强表面特异性作用提高表面稳定性 23 3 表面改性的方法分类 24 4 不同材质芯片的改性方法分类 1 玻璃 石英 动态改性 静电引力 静态改性 硅烷化反应 聚丙烯酰胺 聚乙烯醇 常用于核酸 蛋白质电泳 常用于小分子快速分析 25 2 PDMS a 本体掺杂 在预聚体中引入特殊性质分子 b 共价偶联 利用等离子体 紫外 臭氧等物理方法完成如下反应 26 c 聚合诱导接 d 吸附 交联 27 5 表面改性的表征技术 表面红外漫反射吸收光谱 可以快速测量表面化学组成变化 原子力显微镜 直接观察表面分子 考察表面欧联的聚合物分子层状况 荧光照片 可测试表面连接聚合物涂层对表面蛋白的吸附情况 电渗流测定 可反映表面的电荷情况 28 五 微流体驱动与控制技术 29 1 常见流体驱动技术分类 30 机械驱动包括 离心力驱动 气动微泵驱动 压电微泵驱动 PDMS气动微泵驱动 常规状态下 阀门敞开施加动力鼓入空气 薄膜在气体压力下发生形变 堵塞通道 撤销压力 恢复原状 三个阀依次如图顺序开启闭合便可驱动流体流动 31 压电微泵驱动 向压电双晶片施加方波信号时 压电双晶片在电场的作用下发生周期性弯曲变形 进而驱动PDMS泵膜改变腔体的容积 当压电双晶片带动泵膜向上移动时 泵腔体积增大 腔内流体的压强减小 使入口阀打开 同时出口阀关闭 流体在压差的作用下流入泵腔 32 非机械驱动包括 电渗驱动 热气微泵驱动 光学捕获微泵电渗驱动 电渗驱动是当前微流控芯片中应用最广泛的一种流体驱动技术 优势 构架简单 操作方便 流行扁平 无脉动等 劣势 易受外加电场强度 通道表面 微流体性质及传热效率等因素影响 稳定性相对较差 33 2 微流体控制 微流体控制是微流控芯片实验室的操作核心 在微流控芯片实验室所涉及的进样 混合 反应 分离 检测等过程都是在可控流体的运动中完成的 微流体控制主要包括电渗控制和微阀控制 34 微阀控制 特征 低泄露 低功耗 速度快 线性范围广 适应面广 举例 双晶片单向阀原理图 35 六 进样和样品预处理技术 36 1 芯片实验室各种进样方式一览 37 38 A 简单进样 39 B 悬浮进样 40 C 压缩进样 41 D 门进样 42 2 样品预处理 43 七 微混合和微反应技术 44 1 微混合 由于一般微流控装置流体状态以层流为主 因此微流控的微混合主要依靠扩散 45 提高层流条件下混合效率的主要原则为 拉伸或折叠流体以增大流体的接触面积 利用分散混合设计 通过管路几何交叉设计将大的液流拆分并重新组合 从而减小液流厚度 实现更有效混合 46 微混合器的分类汇总 47 2 微反应和微反应器 微反应技术是一种将微结构内在的优势应用到反应过程的技术 体现这种技术的设备或器件被称为微反应器 微反应器是一种单元反应界面尺度为微米量级的微型反应器 48 微反应器分类 49 微型生物反应器主要的应用对象有 聚合酶链反应 PCR 免疫反应 各类酶反应及DNA杂交反应等 50 八 微分离技术 51 早期的微流控芯片 在某种意义上说就是一种微分离器件 电泳是芯片微分离中采用最普遍的一种形式 52 自由溶液区带芯片电泳 自由溶液区带电泳是在开关通道中直接利用物质的质荷比差异实现分离的一种电泳模式 它也是各种电泳分离中最基本的一种 影响因素相对较少 容易在芯片上实现 53 介质筛分芯片电泳 筛分电泳是利用生物大分子和筛分介质 高分子溶胶或凝胶 之间的动态交缠作用 把被分离物质按照分子质量大小分开的一种技术 它是传统的平板电泳和毛细管电泳中研究最多 应用最广的一种电泳分离模式 54 电色谱 基于被分离物荷质比差异的自由溶液区带电泳分离 对一些强疏水物质不是很有效 这就需要在电泳过程中引入色谱分配的概念 利用不同组分分配系数的差异强化分离 芯片电动色谱就是芯片电泳和液相色谱在某种程度的结合 充分利用了MEMS技术的高精确度 设计灵活等优势 突破了某些传统电色谱加工模式的束缚 以电渗驱动代替压力驱动 芯片电色谱有几种基本模式 开管电色谱 填充电色谱和整体电色谱 55 胶束电动芯片色谱 在含有胶束的缓冲溶液中 实际上存在着类似于色谱的两相 一是流动的水相 另一相是起到固定作用的胶束相 溶质在两相之间分配 由其在胶束中不同的保留能力而产生不同的保留值 56 芯片自由流电泳 自由流电泳是指在样品随缓冲液连续流动的正交方向加一直流电场 使被分离物质在流动的同时顺电场方向作电迁移 按电泳倘度大小分离 并在流体末端被接取的一种技术 图7 22 其分离度取决于流体向下流动的速度和电场的大小 57 介电电泳 电中性颗粒被放置于非均匀电场下时 会产生诱导极化并与电场相互作用而产生介电泳动现象 58 九 液滴技术 59 1 液滴的形成 水溶液和油同时从不同的微通道中流出 当通道疏水时 油浸润通道 包裹水溶液形成油包水 W O 型液滴 若通道亲水 过程相反 形成水包油 O W 型液滴 60 2 液滴的优点 1 体积小所需样品微量 适合高通量筛选反应和某些样品来源有限的反应2 样品无扩散 61 3 反应条件稳定除了消除样品分子的扩散之外 水分子的蒸发也因油相的包围而受到抑制 液滴内的反应条件几乎不受外界影响4 样品间的交叉污染得以避免 62 5 混合迅速 液滴在通道中运动时 在液滴内部将以运动方向为轴 形成两个循环回流 63 3 液滴的操控技术 1 反应物的引入A 直接进样当反应比较简单时 可用注射泵直接将反应物包入液滴 64 B 毛细管进样高通量筛选需不断改变液滴的组成和浓度 为实现此目标 可将不同的待测样品预先吸入毛细管中 形成一系列体积较大的液滴 然后将该毛细管与微流控芯片连接在注射泵的推动下与反应物形成小液滴并开始反应 65 2 液滴的融合和分裂 A 液滴融合两种液滴融合的思路 现在芯片的不同位置平行的形成不同的液滴 控制好各液滴生成的速度 在芯片特定的位置汇合 在表面张力或静电力的作用下 两液滴融合 66 B 液滴的分裂液滴分裂主要依靠通道结构实现 67 5 液滴的应用 随着液滴技术的发展成熟 对液滴的研究逐步转向应用 比较成功的例子包括 蛋白质结晶研究 酶分析 细胞分析 材料制备和复杂过程模拟等 68 十 检测技术 69 1 微流控芯片对检测器的特殊要求 灵敏度高响应速度快体积小 70 2 激光诱导荧光检测 基本原理 71 优点 是最灵敏的检测方法之一 其检测限可达到10 9 10 13mol L 对于某些高荧光产率的物质甚至可以达到单分子检测 缺点 分析物需要具有荧光或含有可通过衍生反应得到荧光信号的官能团 荧光标记有可能会造成分析物质生化学活性的改变 影响结果的可信度 72 3 质谱检测 优势 能够提供试样组分中生物大分子的基本结构和定量信息 在涉及蛋白质组学研究中有难以替代的作用 劣势 现行仪器体积庞大 价格昂贵 不符合芯片微型化的特点 只能用于芯片外检侧 芯片同质潜的接口仍然是发展的重点与难点 73 4 电化学检测 电化学检测是通过电极将溶液中的待测物的化学信号转变为电信号以实现对待测组分检测的分析方法 微流控芯片电化学检测可分为安培法 电导法和电势法 74 优势 灵敏度高 选择性好 装置简单 成本低 可以与微加工技术兼容 具有微型化和集成化的前景 劣势 被检测物质需要有电化学活性 安培检测 重现性较差 75 十一 微流控芯片的应用 76 1 在核酸研究中的应用 核酸研究的技术如DNA萃取 纯化 PCR扩增 分子杂交 电泳分离和检测等都可以在微流控芯片上实现 如今已有的应用包括 基因突变检测 基因分型和DNA测序 就对象而言 病原体的基因检测应用尤为广泛 77 2 在蛋白质研究中的应用 78 1 微流控芯片上的蛋白质样品与处理技术 样品预处理 蛋白质纯化 微渗析 液 液萃取 蛋白 蛋白质富集 等速电泳富集 固相萃取富集 多孔膜富集 纳米通道富集 蛋白质衍生 在线衍生 柱后衍生 蛋白质酶解 固定化酶反应器 芯片内壁固定化胰蛋白酶 微珠固定化胰蛋白酶 原位聚合整体柱 溶胶凝固固定化胰蛋白酶 膜固定化胰蛋白酶 79 蛋白质分离 芯片电泳 芯片色谱 芯片二维分离 芯片区带电泳分离 芯片筛分电泳分离 2 蛋白质分离 80 3 在离子和小分子研究中的应用 1 离子分离微流控芯片离子分离分析现阶段多以芯片电泳为分离手段 以电化学检测作为主要检测方式 离子分离模式包括 区带电泳 等速电泳 等速电泳 区带电泳 离子色谱 81 2 手性分子 A 手性拆分目前在微流控芯片上有所尝试的拆分方法有 酶法拆分 色谱拆分 电泳法拆分 其中电泳法是采用最多的一种方法 就拆分方式而言 以直接法居多 82 B 手性合成微流控芯片进行手性合成的研究处于研究阶段 报道较少但前景光明 C 手性合成 手性拆分集成手性合成与手性拆分集成使反应和评估系统处于同一量级 具有发展高通量的潜力 目前已报道的集成模式有游离酶水相反应与区带电泳手性拆分的集成 83 4 代