dna分子标记原理与技术.ppt

TechniquesofMolecularMarkers 分子标记技术 师丹丹 DNA分子标记技术在鱼类种质鉴定研究中的应用 分子标记技术可用于 鱼类作为实验动物 比哺乳动物等具有更多的优点 1 产卵量大2 体外受精3 体外孵化 重点研究内容 1 解以Southerblot PCR为基础 能用于遗传多样性研究的分子标记技术 包括RFLP RAPD AFLP SSR ISH DDRT PCR SNP等 2 DNA结构与功能3 PCR技术4 分子标记技术基本原理 分子标记技术基本操作方法 SSR分子标记技术的应用 实验中经常遇到的问题及解决方法 1 解以Southerblot PCR为基础 能用于遗传多样性研究的分子标记技术 包括RFLP RAPD AFLP SSR ISH DDRT PCR SNP等 2 DNA结构与功能3 PCR技术4 SSR分子标记技术基本原理 SSR分子标记技术基本操作方法 SSR分子标记技术的应用 实验中经常遇到的问题及解决方法 1 1遗传标记的类型及发展 遗传标记 geneticmarkers 是研究生物遗传变异规律及其物质基础的重要手段 遗传标记主要有4种类型 形态标记 morphologicalmarkers 细胞学标记 cytologicalmarkers 生化标记 biochemicalmarkers 分子标记 molecularmarkers 相对于其他技术 它有何优势呢 DNA分子标记的优势 形态标记 morphologicalmarkers 形态标记即鱼类的外部形态特征 形态标记简单直观 经济方便 但其数量在多数植物中是很有限的 且多态性较差 表现易受环境影响 并且有一些标记与不良性状连锁 此外形态标记的获得需要通过诱变 分离纯合的过程 周期较长 因此 形态标记在作物遗传育种中的作用是有限的 细胞学标记 cytologicalmarkers 细胞学标记即鱼类细胞染色体的变异 各个物种的染色体都有特定的特征 包括染色体核型 染色体数目 结构 随体有无 着丝粒位置等 和带型 C带 N带 G带等 的变化与形态标记相比 细胞学标记的优点是能进行一些重要基因的染色体或染色体区域定位 但细胞学标记材料需要花费较大的人力和较长时间来培育 难度很大 同时某些物种对染色体变异反应敏感 还有些变异难以用细胞学方法进行检测 因此 到目前为止 真正应用于作物遗传育种研究中的细胞学标记还很少 生化标记 biochemicalmarkers 生化标记主要包括同工酶和等位酶标记 同工酶是指一个以上基因座位编码的酶的不同形式 等位酶是指由一个基因座位的不同等位基因编码的酶的不同分子形式 分析方法是从鱼类组织的蛋白粗提物中通过电泳和组织化学染色法将酶的多种形式转变成肉眼可辩的酶谱带型 与形态标记 细胞学标记相比 生化标记具两个方面的优点 一是表现近中性 对经济性状一般没有大的不良影响 二是直接反映了基因产物差异 受环境影响较小 但目前可使用的生化标记数量还相当有限 同时有组织特异性和发育时期特异性 且有些酶的染色方法和电泳技术有一定难度 因此其实际应用受到一定限制 同工酶与等位酶电泳可区分的同一种酶 系统 的不同变化 同工酶 isozyme 广义是指生物体内催化相同反应而分子结构不同的酶 催化相同的化学反应 但其蛋白质分子结构 理化性质和免疫性能等方面都存在明显差异的一组酶 等位酶 allozyme 由同一个位点的不同等位基因编码的同种酶的不同类型 其功能相同但氨基酸序列不同 同工酶与等位酶 材料的采集 研磨和酶的提取 酶的保存 凝胶制备 电泳 凝胶切片 酶的组织化学染色 酶谱的记录与分析 数据分析 同工酶与等位酶 分析的过程 同工酶与等位酶 酶谱照片 在生物学中 同工酶可用于研究物种进化 遗传变异 杂交育种和个体发育 组织分化等 例如最原始的脊椎动物七鳃鳗 Lamprey 只有一种LDH肽链 进化到较高级的鱼类才有A B两类肽链 又如通过对地理分布不同的物种间某一同工酶谱的普查可以推测物种的地理来源 分类等 动 植物的遗传变异可通过子代和亲代同工酶谱的比较来鉴别 法医学中也可用多种同工酶谱的分析来鉴定亲子关系 细胞杂交或植物杂交育种后是否出现新品种也可用同工酶谱的比较来确定 在个体发育中 从胚胎到出生 再到成年 随着组织的分化和发育 各种同工酶谱也有一个分化转变的过程 分子标记 分子标记指能反映生物个体或种群间基因组中某种差异特征的DNA片段 它直接反映基因组DNA间的差异 与上述三种标记相比较 分子标记具有许多明显的优越性 表现为 直接以DNA的形式表现 在生物体的各个组织 各个发育阶段均可检测到 不受季节 环境限制 不存在表达与否等问题 数量极多 遍布整个基因组 可检测座位几乎无限 多态性高 自然界存在许多等位变异 无须人为创造 表现为中性 不影响目标性状的表达 许多标记表现为共显性的特点 能区别纯合体和杂合体 分子标记 广义的分子标记是指可遗传并可检测的特异DNA序列或蛋白质 狭义的分子标记仅指DNA或 RNA 标记 而这个界定现在被广泛采纳 目前 分子标记技术 这里指DNA或cDNA分子水平上的多态性检测技术 已有 RFLP RestrictionFragmentLengthPolymorphisms RAPD RandomAmplifiedPolymorphicDNA AFLP Amplifiedfragmentlengthpolymorphisms SSR Simplesequencerepeats GISH Genomicinsituhybridization mRNADD mRNADifferentialDisplay SSH SuppressionSubtractionHybridization AP PCR Arbitray primerPCR DAF DNAamplifiedfingprinting SPARs Singleprimeramplificationreactions SCARs Sequencedcharacteriedamplifiedregions AMO AnchoredMicrosatelliteOligonucleotides STS Sequenc taggedSite SNP SingleNucleotidePolymorphism 分子标记的种类与历史 蛋白质 同工酶 等位酶 上世纪六十年代以来核苷酸序列和片段 tRNA 1965 1980年以来 RFLP1984年以来 SSR1990年以来 RAPD1993年以来 AFLP1996年以来 DDRT PCR 1 2遗传物质 DNA DNA结构原理 DNA分子的结构与功能 DNA的理化性质及应用 1 2 1DNA结构原理 DNA双螺旋的发现 典型双螺旋结构 1 2 2DNA分子的结构与功能 DNA的超螺旋结构 原核生物 大部分原核生物的DNA是共价封闭的环状双螺旋 这种双螺旋还可以再次螺旋化形成超螺旋 真核生物 DNA和蛋白质组装成染色体 染色体的基本单位是核小体 核小体由DNA和组蛋白构成 组蛋白有H1 H2A H2B H3和H4 H2A H2B H3和H4各两分子构成核小体的核心 称为组蛋白八聚体 DNA双螺旋分子缠绕在八聚体上构成核小体的核心颗粒 核小体的核心颗粒之间再由DNA和组蛋白H1构成的连接区连接起来形成串珠状结构 核小体进一步旋转折叠形成棒状染色体 将近1m长的DNA分子容纳于直径只有数微米的细胞核中 DNA的功能 DNA的基本功能作为生物遗传信息复制的模板和基因转录的模板 它是遗传繁殖的物质基础 基因组 genome 一个生物体的全部基因序列 最简单的生物如SV40病毒的基因组仅含有5100碱基对 basepairbp 大肠杆菌基因组的大小为5700千碱基对 kbp 人的基因组则由大约3 0 109个bp组成 1 2 3DNA的理化性质及应用 核酸的一般理化性质 多元酸 较强的酸性 DNA为线性高分子 粘度极大 而RNA分子远小于DNA 粘度也小得多 由于碱基成分的紫外吸收特征 DNA和RNA溶液均具有260nm紫外吸收峰 DNA的变性 DNA变性 在某些理化因素作用下 DNA分子互补碱基对之间的氢键断裂 使DNA双螺旋结构松散 变成单链 监测指标为A260的变化 常用的变性方法为加热 增色效应 hyperchromiceffect DNA解链过程中 其A260增加 并与解链程度有一定的关系 解链曲线 在连续加热过程中以温度对A260的关系作图 解链温度 DNA变性从开始到完全解链是在一个相当窄的范围内完成的 这一范围内A260达到最大值的50 时的温度称为解链温度 又称为融解温度 meltingtemperature Tm Tm的大小与其所含碱基中的G C比例相关 G C比例越高 Tm值越高 DNA分子杂交 hybridization 双链DNA 单链DNA 杂交 在DNA复性过程中 双链分子的再形成可以发生在序列完全互补的核酸分子之间 也可以发生在碱基序列部分互补的不同的DNA之间或DNA与RNA之间 这种现象称为分子杂交 polymerasechainreaction 聚合酶链式反应 关于PCR 您能告诉我们 聚合酶链式反应 PolymeraseChainReaction 简称 是一项在短时间内大量扩增特定的 片段的分子生物学技术 PCR 聚合酶链反应 快速取得大量DNA片段的方法 原料 样品DNA 引物 RNA DNA聚合酶 脱氧核苷酸 dATP dCTP dGTP dTTP 步骤 变性94 95 DNA双链解旋 退火55 与引物结合 复制72 应用 生物进化和古人类学研究 法医学 预变性 92 95 C 2 5m 变性 92 95 C 30s 复性 40 60 C 30s 延伸 72 C 30 60s 总延伸 72 C 7m 25 35 PCR的一般过程 经过30次循环 扩增的DNA片段可达100万倍以上 1 3 1PCR原理 模板 PCR原理 变性 5 3 5 3 复性 PCR原理 引物 引物 5 3 5 3 延伸 PCR原理 变性 PCR原理 复性 PCR原理 延伸 PCR原理 变性 PCR原理 复性 PCR原理 延伸 PCR原理 PCR仪 PCR反应五要素 引物 酶 dNTP 模板和Mg2 TaqDNA聚合酶来源 水生栖热菌Thermusaquaticus特性 良好的耐热性Mg2 依赖性无校正功能 1 3 2PCR引物设计 引物长度 15 30bp 常用为20bp左右 引物扩增跨度 以200 500bp为宜 特定条件下可扩增长10kb的片段 引物碱基 G C含量以40 60 为宜 G C太少扩增效果不佳 G C过多易出现非特异条带 ATGC最好随机分布 避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列 避免引物内部出现二级结构 避免两引物间互补 特别是3 端互补 否则会形成引物二聚体 产生非特异扩增条带 引物3 端的碱基 特别是最末及倒数第二个碱基 应严格要求配对 以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败 引物中有或能加上合适的酶切位点 被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点 这对酶切分析或分子克隆很有好处 引物的特异性 引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性 1 3 3模板的制备 DNA 从细胞中提取DNA 动 植物细胞 绒毛 尿样 毛发 口腔上皮细胞等 固定和包埋的组织标本 脱蜡 蛋白酶K消化RNA新鲜组织或细胞所用器皿和试剂必需经高温灭菌或DEPC处理 1 3 4PCR的基本反应 以DNA为模板的反应 10 缓冲液10 l4种dNTP混合物各20 mol引物各10 100pmol模板DNA0 1 2 gTaqDNA聚合酶2 5uMg2 1 5mmol加双蒸水至100 l 以mRNA为模板的反应mRNA5 l 约500ng 5 Buffer4 ldNTPs2 l 10mmol L RNasin1 l 20U AMVRTase1 l 10U Oligo dT 12 18 或下游引物 1 lddH2O6 lTotal20 l 42 水浴1小时 95 水浴10分钟灭活逆转录酶 向上述反应体系中添加如下试剂 10 Buffer5 l25mmol LMg2 3 lTaq酶0 5 l 2 5U 上游引物1 lddH2O20 5 lTotal50 l 按PCR循环参数进行RT PCR 1 3 5PCR反应条件的控制 一 PCR反应的缓冲溶液提供合适的酸碱度和某些离子10 50mmol LTris HCl缓冲液50mmol LKClBSA或明胶 二 镁离子浓度Taq酶活性需要Mg2 Mg2 浓度过高导致非特异扩增 一般常用1 5mmol L 三 底物浓度dNTP浓度在20 200 mol L四种dNTP必须浓度相等 四 TaqDNA聚合酶TaqDNA聚合酶在70 80 具有最高聚合活性 五 引物引物浓度一般为0 1 0 5 mol L 六 反应温度和循环次数 预变性温度和时间95 5min 变性温度和时间95 30 60s 退火温度和时间45 55 30 60s 延伸温度和时间72 30 60s 循环次数25 30 1 3 6PCR中应注意的事项 PCR反应中可能出现的问题 假阴性 不出现扩增条带假阳性出现非特异扩增带 一 防止污染试剂小量分装吸头及EP管一次性使用器皿及工作区域要分开 无菌操作 二 设立对照 阳性对照 阳性模板阴性对照 阴性模板试剂对照 除模板外的所有组分 注意的事项 1 3 7PCR反应的特点 简便 快速 对标本的纯度要求低 特异性强 灵敏度高 1 3 8PCR的应用 1 被广泛地用基因克隆和制造突变 2 被用于鉴别遗传疾病和快速检测病毒 病菌感染 3 在法医上 目前已成为发现罪证的重要方法 4 利用 技术 科学家们已从林肯的头发和血液 埃及的木乃伊 琥珀中八千万年前的昆虫 恐龙的骨头等不寻常的样品中提取了足够的 进行研究 博物馆中的化石标本都有可能成为遗传学的研究对象 一门分子古生物学因此诞生 分子标记常用技术概述 限制性扩增片段长度多态性 RFLP 随机扩增多态性DNA RAPD 扩增片段长度多态性 AFLP 简单重复序列 SSR 染色体原位杂交 GISH或FISH mRNA差异显示法 mRNADD 限制性酶切片段长度多态性 RestrictionFragmentLengthPolymorphism RFLP 8kb 5kb 3kb 在个体和群体中 片段长度表现出多态性 如3kb 5kb 7kb 8kb RFLP呈现孟德尔式遗传 常用检查方法 核酸杂交 PCR 酶切等 probe 产生多态性的原因是内切酶位点的变化 原位点的消失 新位点的产生 GAATTCCTTAAG GATTTCCTAAAG 2kb 3kb 5kb 7kb 对长江 鄱阳湖和赣江的鲢鱼群体进行mtDNAND5 6区域的PCR RFLP分析 发现鄱阳湖的鲢鱼群体主要来源于赣江而非长江 根据对mtDNA Loop区域的PCR RFLP分析 推测阿拉伯湾 阿曼湾和阿拉伯海的康氏马鲛源自于单一遗传群体 应用 随机扩增多态性DNA RAPD RAPD是以基因组DNA为模板 以一个随机的寡核苷酸序列作引物通过PCR扩增反应 产生不连续DNA产物 用以检测DNA序列的多态性 该方法的优点主要是 简单易行 需要的DNA量极少 15 25ng 无放射性 实验设备简单 周期短 因此受到研究者的普遍欢迎 目前该方法已广泛用于种质资源鉴定与分类 目标基因的标记等研究上 也有人利用RAPD标记来绘制遗传连锁图 RAPD标记技术 随机扩增多态DNARandomAmplifiedPolymorphicDNA 利用随机合成的寡聚核苷酸序列 8 10bp 作为引物 对所研究的基因组DNA进行PCR扩增 扩增产物在琼脂糖凝胶或丙烯酰胺凝胶上电泳分离 并经溴化乙锭染色或银染色得到多态性的DNA图谱 该方法的缺陷 一 是多数位点的标记带表现为显性的特点 因此不能提供完整的遗传信息 二 是该方法在一些作物上扩增产物的稳定性较差 在使用这一方法时 应注意 一 尽可能地把RAPD标记转化为更有效的经典PCR标记 二 严格控制模板DNA和Mg2 浓度 严格保证反应条件 反应参数的一致性 RAPD 很难判断带的有无 背景影响严重 带的亮度差异很大 凝胶分辨率 6 50 利用RAPD研究分析鲂属团头鲂 三角鲂和广东鲂的种间亲缘关系和种内遗传差异 发现团头鲂与三角鲂的亲缘关系较近 RAPD标记在鱼类品系鉴定 遗传多样性检测等方面得到了和好的应用 用足够量的RAPD引物可以筛选到某品系在某引物扩增下产生的特征标记条带 这种条带可用于鱼类品系的快速鉴定 应用 AFLP分子标记 扩增片段长度多态性AmplifiedFragmentLengthPolymorphism 1 用成对的限制性内切核酸酶双酶切基因组DNA 2 产生的片段用接头 与酶切位点互补 连接起来 3 选择特定的片段进行PCR扩增 RFLP 实验流程DNA提取限制性内切酶消化电泳分离放射自显影检测 36 50 RFLP 显性标记or共显性标记 41 50 PCR RFLP 44 50 AFLP扩增可获得在某一品种出现而在另一品种不出现的特定的DNA谱带 因此 通过限制性酶切和PCR扩增后得到的DNA多态性可作为一种分子标记 AFLP非常适合绘制品种的指纹图谱及进行分类研究 该项技术的特点是稳定性 重复性强 该技术的缺点是技术难度大 同时成本也较高 常用于品系鉴定 近缘物种遗传变异与系统发生分析 由于其短期内产生大量的多态标记 使得AFLP在杂种 种内或种间 鉴定方面表现相当出色 尤其是在