高中生物核心概念高考复习课件-PCR技术.ppt

2020 1 3 PCR技术 聚合酶链式反应 DNA的体内复制基本过程 GGAUCG 5 AUCGCG 5 引物酶 引物酶 DNA的体内复制基本过程 GGAUCG 5 AUCGCG 5 3 DNA聚合酶 DNA聚合酶 DNA的体内复制基本过程 1985年 美国PE Cetus公司的Mullis等人发明了聚合酶链反应 PCR 基本原理是在试管中模拟细胞内的DNA复制最初采用E coliDNA聚合酶进行PCR 由于该酶不耐热 使这一过程耗时 费力 且易出错耐热DNA聚合酶的应用使得PCR能高效率的进行 随后PE Cetus公司推出了第一台PCR自动化热循环仪 KaryB Mullis 1989年美国 Science 杂志列PCR为十余项重大科学发明之首 比喻1989年为PCR爆炸年 穆利斯荣获1993年度诺贝尔化学奖 引物 引物 Mullis的构思 DNA聚合酶 DNA聚合酶 特定DNA片段 TaqDNA聚合酶 Thermusaquaticus 酶活性 温度 405060708090100 10080604020 72 94 55 PCR循环 一 PCR的基本原理 类似于DNA的体内复制 首先待扩增DNA 模板加热变性解链 随之将反应混合物冷却至某一温度 这一温度可使引物与它的靶序列发生退火 再将温度升高使退火引物在DNA聚合酶作用下得以延伸 这种热变性 复性 延伸的过程就是一个PCR循环 PCR就是在合适条件下的这种循环的不断重复 PCR技术原理和基本操作 Taq P1 P2 PCR反应体系 dATP dTTP dGTP dCTP Mg2 模板 DNA引物 P1P2DNA聚合酶 Taq原料 dNTP反应缓冲液辅助因子 Mg2 PCR技术的反应条件 DenaturetemplateDNAbyheat 95oC TargetSequence TargetSequence 模板DNA的变性 模板DNA经加热至95 左右一定时间后 使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离 使之成为单链 以便它与引物结合 为下轮反应作准备 PCRCycle Step1 PCRCycle Step2 Temperatureislowered Tm andprimersannealtotargetsequences TargetSequence TargetSequence Primer1 Primer2 5 3 5 5 3 5 3 3 模板DNA与引物的退火 复性 模板DNA经加热变性成单链后 温度降至55 左右 引物与模板DNA单链的互补序列配对结合 PCRCycle Step3 At72oCTaqDNApolymerasecatalysesprimerextensionascomplementarynucleotidesareincorporated TargetSequence TargetSequence Primer1 Primer2 5 3 5 5 3 5 3 TaqDNAPolymerase 引物的延伸 DNA模板 引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下 以dNTPs为反应原料 靶序列为模板 按碱基配对与半保留复制原理 合成一条新的与模板DNA互补链 3 Endofthe1stPCRCycle Resultsintwocopiesoftargetsequence TargetSequence TargetSequence 每完成一个循环需2 4分钟 2 3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍 TargetAmplification No ofNo AmpliconCyclesCopiesofTarget122438416532664201 048 576301 073 741 824 1cycle 2Amplicon 2cycle 4Amplicon 3cycle 8Amplicon 4cycle 16Amplicon 5cycle 32Amplicon 6cycle 64Amplicon 7cycle 128Amplicon 2020 1 3 18 1缓冲液 10mmol LTris HCl 50mmol LKCl pH 8 3 9 0 室温时约为7 2 还可有添加剂 共溶剂等 Mg2 是DNA聚合酶的激活剂 Mg2 浓度过低会使Taq酶活性丧失 PCR产量下降 Mg2 过高影响反应特异性 二 有关PCR反应体系常识 2 脱氧三磷酸核苷 dNTPs dATP dGTP dCTP dTTP四种的等量混合物 3 引物使用浓度为0 1 0 5 mol L 浓度过低则产量低 过高则易导致错配 2020 1 3 19 4 模板单 双链DNA均可 一个PCR反应中104至107个模板分子可获得较理想的效果 但由于PCR较灵敏 更少的模板分子数在循环数增加时也会得到大量扩增 不能混有蛋白酶 核酸酶 DNA聚合酶抑制剂 DNA结合蛋白类 模板纯度不高往往是限制PCR扩增的重要因素 5 耐热性的DNA聚合酶有多种 均从耐热性的细菌中分离出来 均耐高温 普遍具有5 3 聚合酶和5 3 外切酶活性 常用的有 1 TaqDNA聚合酶2 TthDNA聚合酶3 VentDNA聚合酶4 PwoDNA聚合酶5 PfuDNA聚合酶6 混合DNA聚合酶 2020 1 3 20 PCR引物的设计一般原则引物长度一般以18 30bp为宜 过短降低特异性 过长会引起退火时结合的模板数减少 降低反应效率 解链温度 Tm值 很重要 直接决定了扩增中可使用的退火温度 Ta值 的高低 两条引物间的Tm值越接近越好 避免引物内部出现二级结构 避免序列内有较长的回文结构 引物3 端为关键碱基 是PCR延伸的起始端 不能进行任何修饰 也不能形成二级结构的可能 要避免两个引物间碱基序列互补以及同一引物自身碱基序列互补 引物5 末端碱基可添加与模板无关的序列 如限制性核酸内切酶的识别序列 ATG起始密码子或启动子序列等 便于克隆和表达 引物的碱基顺序不能与非扩增区有同源性 引物与核酸序列数据库的其它序列均应无明显同源性 以免造成不必要的非特异性扩增 2020 1 3 21 三 PCR反应程序1 常规程序 94 左右预变性几十秒至几分钟 94 左右变性10秒至1分钟 50 65 左右退火30秒至1分钟 20 35个循环72 左右延伸30秒至几分钟 72 左右最后延伸和加尾3 10分钟 4 25 保持3分钟或更长 2 退火和延伸温度 退火温度Ta值由Tm值决定 多数情况下Ta采用Tm减去3 5 较高时特异性强但退火效率低 较低时退火效率增加而非特异扩增增加 可根据实际研究目的采用高特异性或低特异性退火 2020 1 3 22 3 反应时间 变性步骤一般为5秒至1分钟 变性温度高时时间短 低时时间长 简单模板时间短 复杂模板时间长 退火时间一般为30秒至1分钟即可 引物结构好的时间短 引物结构差的退火时间宜长 延伸时间从半分钟到10分钟以上不等 由扩增片段的长度和DNA聚合酶的延伸速度共同决定 4 循环次数 多数为25 35 主要取决于模板属性 模板丰度 引物退火效率DNA聚合酶的扩增能力 裸露DNA 杂质少 高丰度模板 引物结构好 DNA聚合酶扩增能力强时 循环数宜少 以尽量减少突变 否则宜多 以保证获得必要的PCR产物量 重复1 3步25 30轮 目的DNA片段扩增100万倍以上 DNA双螺旋 DNA单链与引物复性 DNA变性形成2条单链 子链延伸DNA加倍 模板DNA PCR的基本原理 PCR反应条件PCR过程PCR的特点 引物1 引物2 PCR的基本原理 PCR反应条件PCR过程PCR的特点 引物1 引物2 Taq酶 Taq酶 PCR的基本原理 PCR反应条件PCR过程PCR的特点 第1轮结束 第2轮开始 PCR的基本原理 PCR反应条件PCR过程PCR的特点 Taq Taq Taq Taq PCR的基本原理 PCR反应条件PCR过程PCR的特点 第2轮结束 PCR的基本原理 PCR反应条件PCR过程PCR的特点 模板DNA 第1轮扩增 第2轮扩增 第3轮扩增 第4轮扩增 第5轮扩增 第6轮扩增 理想拷贝数 2nn循环次数实际拷贝数 1 x nX平均效率 约为0 85n循环次数 PCR操作 录像 PCR中其它注意的事项 1 防止污染试剂小量分装吸头及EP管 离心管 一次性使用器皿及工作区域要分开 无菌操作2 设立对照 阳性对照 阳性模板阴性对照 阴性模板 无模板试剂对照 除模板外的所有组分 PCR应用举例 1 在PCR产物两端添加限制性酶切位点在PCR引物的5 加上根据需要而设计的酶切位点 PCR产物内部无该切点 在酶切位点的5 加3个左右的保护碱基 其数目多少取决该酶的性质 PCR产物经电泳回收后 直接用限制酶进行切割 纯化后与目标载体连接重组 该法适用于直接将PCR产物克隆到表达载体进行功能研究 但构建好的表达载体必须测序才能证明PCR产物的身份正确且没有突变 2020 1 3 35 2 TA克隆这是目前最通行的PCR产物克隆方法 基本思路是先将PCR产物与特制的T载体进行连接重组 测序证明正确无误后 再从T载体上亚克隆到表达载体上进行功能研究 Taq酶PCR产物的特点 该酶具有末端转移酶活性 通常在其产物DNA分子每条链的3 末端加上一个突出的A T载体 通过特定制作技术制作的在多克隆位点中间已开环的质粒载体 其每条链的3 末端具有一个突出的T TA克隆 将3 末端具一个突出的A的PCR产物与T载体连接重组 转化大肠杆菌 对鉴定为阳性的重组克隆子的多克隆位点区的插入片段进行测序 然后再亚克隆到其它载体进行功能研究等 3 反向PCR reversePCR 是用反向的互补引物来扩增两引物以外的DNA片段对某个已知DNA片段两侧的未知序列进行扩增 可对未知序列扩增后进行分析 如探索邻接已知DNA片段的序列 用于仅知部分序列的全长cDNA的克隆 扩增基因文库的插入DNA 建立基因组步移文库 已知序列 未知序列 未知序列 已知序列 未知序列 未知序列 限制酶 限制酶 连接酶 4 利用接头的PCR 锚定PCR anchoredPCR 将基因组总DNA用限制酶切割 然后将序列已知的接头连接到酶切片段的两端 以提供PCR的锚定引物 该锚定引物与已知序列中的基因特异引物组合后 用于目标基因侧翼序列的扩增 为了减少锚定引物与锚定引物之间组合后构成的非特异扩增 可以将接头替换为一端平 另一端为5 突变的结构 且对3 凹陷的碱基实行亚氨基修饰