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有机小分子荧光探针的研究 1 什么是荧光探针 荧光探针是建立在光谱化学和光学波导与测量技术基础上 选择性的将分析对象的化学信息连续转变为分析仪器易测量的荧光信号的分子测量装置 荧光探针受到周围环境的影响 使其发生荧光发射发生变化 从而使人们获知周围环境的特征或者环境中存在的某种特定信息 2 荧光分子探针的优点 灵敏度高选择性好使用方便成本低不需预处理不受外界电磁场影响远距离发光 3 荧光分子探针的结构 荧光分子探针通常由三部分组成 识别基团 receptor 报告基团 fluorophore 连接体部分 spacer 识别基团决定了探针分子的选择性和特异性 报告基团则决定了识别的灵敏度 而连接体部分则可起到分子识别枢纽的作用 4 荧光分子探针的设计原理 荧光分子探针的设计原理主要有以下几种 键合 信号输出法 置换法和化学计量计法 1 键合 信号输出法 荧光连接体识别被分析物信号输出基团基团 键合 信号输出法是指将探针中的识别基团和荧光基团通过共价键连接起来设计荧光探针的方法 5 当识别基团与被分析物结合时会引起荧光基团的化学环境发生变化 通过颜色的改变 光谱的移动 荧光强度的增减等现象来表现 这些变化可被裸眼或者仪器识别 这是目前为止在设计荧光探针中应用最广泛的方法 6 作为荧光基团的香豆素和作为识别基团的邻氨基苯硫醚以席夫碱相连 加入锌离子后 与硫醚上的硫原子 席夫碱上的氮原子及香豆素上的氧原子配位得到结构2 抑制了席夫碱上C N键的旋转 实现了荧光从无到有的变化 基于键合 信号输出法设计的锌离子荧光探针 7 2 置换法 识别基团被分析物识别基团荧光基团结合荧光基团结合被分析物基于置换法设计的荧光探针该原理是利用识别基团分别与荧光基团和被分析物结合能力的不同来实现对被分析物的检测 识别基团和荧光基团形成络合物 当被分析物加入到该体系中时 由于识别基团与被分析物的结合能力要强于识别基团与荧光基团的结合能力 因此被测物将荧光基团置换出来 从而引起了整个体系荧光等化学参数的变化 进而为仪器或者裸眼识别 该原理常用于设计阴离子荧光探针 8 化合物3以氟硼荧为荧光团修饰了DPA为识别基团 探针本身荧光很强 但与铜离子络合后可形成结构3 从而淬灭了氟硼荧的荧光 加入氰根离子后 由于铜离子与氰根离子的结合常数更大 从而把作为荧光基团的氟硼荧衍生物从络合状态中置换出来得到结构4 使之进入溶液 荧光恢复 而其它的阴离子没有这样的现象 因此可以实现对氰根离子的检测 9 3 化学计量计法 探针分子被分析物新物质A 探针分子被分析物中间体新物质B新物质C 基于化学计量计设计的荧光探针 I 被分析物和探针分子反应形成了共价化合物 II 被分析物催化探针分子反应生成两种新物质 10 化学计量计法是利用探针分子和被分析物之间发生的特定化学反应 一般是不可逆反应 来改变探针所处的化学环境 从而对被分析物进行识别的一种方法 根据化学计量计法设计的探针可以称为化学计量计 主要包括两种类型 一 探针分子和被分析物发生化学反应后形成共价化合物 I 二 被分析物催化探针分子反应生成两种新物质 II 一般而言 基于化学计量计原理设计的荧光分子探针通常具有不可逆性和较好的选择性 11 基于化学计量计法设计的次氯酸根离子荧光探针根据次氯酸根可以氧化羟胺的特性 设计合成了化合物5 当次氯酸根存在时可氧化羟胺结构 使罗丹明开环 从而形成结构6 最终进一步水解为罗丹明6G本身7 而产生强烈的荧光 而其它氧化性分子没有这样的特性 因此可以实现对水相中次氯酸根的高选择性检测 12 荧光探针的响应机理 荧光分子探针主要有如下几种响应机理 1 光诱导电子转移 PET photo inducedelectrontransfer 2 分子内电荷转移 ICT intramolecularchargetransfer 3 荧光共振能量转移 FRET fluorescenceresonanceenergytransfer 4 激基缔合物 excimer exciplex 13 1光诱导电子转移 PET photo inducedelectrontransfer 光诱导电子转移是指电子给体或电子受体受光激发后 激发态的电子给体与电子受体之间发生电子转移的过程 识别基团与被分析物结合之前 荧光基团受激发 最终被光激发到激发态的电子不能跃迁到基态 使得荧光基团的荧光淬灭 而识别基团与被分析物结合后 PET过程受阻 荧光基团的荧光得以恢复 14 PET过程可以用前线轨道理论具体解释 当识别基团不存在时 荧光团被光激发后 其最高占据轨道 HOMO 的一个电子跃迁到最低空轨道 LUMO 能够产生荧光 若外来识别基团的HOMO或LOMO轨道介于荧光团两轨道能量之间 此时就可以发生识别基团与荧光团之间的电子转移而导致荧光的猝灭 即PET过程阻止了荧光团的一个电子从激发态到基态的非辐射跃迁途径 降低了荧光团的量子产率 表现为荧光强度的减弱或淬灭 PET识别分析物理论示意图 15 PET1识别基团对荧光团的PET过程发生和受阻的前线轨道理论解释 第一种是识别基团对荧光基团的电子转移 PET1 如图1 9所示 即识别基团的HOMO轨道介于荧光基团的HUMO和LUMO轨道之间 当被分析物不存在时 荧光基团被激发后 识别基团的HOMO轨道的电子转移到荧光基团的HOMO轨道 致使荧光基团被激发到LUMO轨道上的电子无法回到基态而难以产生荧光 导致荧光淬灭 即PET1过程发生 当识别基团与被分析物结合后 识别基团HOMO轨道能量降低 使PET过程受阻 这样荧光基团的激发态电子可以返回基态 荧光恢复 16 总的来说 识别基团对荧光基团的电子转移 即识别基团的HUMO轨道上的电子占据了荧光基团的HOMO轨道 荧光基团对识别基团的电子转移 PET2 即识别基团LUMO消耗掉了荧光基团被激发的电子 两者最终导致荧光基团被激发的电子不能回到基态 使荧光被淬灭 17 2 分子内电荷转移 ICT intramolecularchargetransfer 分子内电荷转移是指分子在激发态时发生分子内电子转移 造成正负电荷分离 形成分子电荷转移态 分子内电荷转移荧光探针分子通常是荧光团上同时连有推电子基团 电子给体 Donor 和吸电子基团 电子受体 Acceptor 通过 键提供电子转移的通道 形成强的推 拉作用的共轭体系 其吸电子基团或推电子基团本身充当识别基团的一部分 当识别基团和被分析物结合后 作为识别基团的供电子部分或拉电子部分的推拉电能力发生的改变 整个体系的的 电子结构重新分布 从而导致吸收光谱 发射光谱发生变化 主要是光谱红移或蓝移 18 识别基团分别为电子供体和电子受体的ICT过程光谱移动示意图 其中D A分别表示电子给体和电子受体 19 化合物8是另一类香豆素荧光探针 在香豆素的3号位以烯键连接了一个苯并拉电子基 7号位修饰了一个二乙胺基供电子基 构成了推拉电子体系的荧光分子探针 当羟基自由基存在时 能够将化合物8氧化为化合物9 这样化合物9共轭度大大扩大 氮原子带正电荷增强了其拉电子能力 使整个体系p电荷离域程度增大 从而导致吸收光谱和荧光光谱分别红移了60nm和156nm 发射波长已位于近红外 基本不受样品荧光背景的干扰 荧光颜色由绿色变为红色 该探针可对细胞中的羟基自由基进行比率检测 比率信号可达210倍 89 20 3荧光共振能量转移 FRET fluorescenceresonaceenergytransfer 荧光共振能量转移指一个荧光体系含有两个荧光团 一个充当能量供体D 另一个为能量受体A 当用供体D的激发去激发荧光体系时 可以发生从D到A的非辐射能量转移 从而发射出受体荧光团的荧光 荧光共振能量转移发生必须具备以下几个条件 1 能量供体荧光团D的荧光发射位于短波长处 且发射光谱和能量受体荧光团A的吸收光谱有一定重叠 能量受体能够在能量供体的发射波长处吸收能量 2 能量供体与能量受体相隔的距离必须远大于它们之间的碰撞直径 有时甚至为70 100 3 能量供体与能量受体还必须以适当的方式排列 21 化合物10是以氟硼荧和罗丹明为荧光团设计的FRET荧光探针 由于氟硼荧的荧光发射光谱与罗丹明的吸收光谱有较大范围重叠 通过连接臂连接 氟硼荧作为能量供体 罗丹明作为能量受体 加入被分析物后 荧光共振能量转移过程便能实现 加入汞离子之前 表现为氟硼荧的绿色荧光 汞离子的存在能促使氨基硫脲形成噁二唑酮类化合物而致使罗丹明内酰胺结构开环 此时氟硼荧的能量传递给罗丹明 最终使得共振能量转移发生 氟硼荧的发射峰减弱 从而发射出罗丹明的红色荧光 从而实现了对汞离子的比率型检测 1011 22 4激基缔合物 复合物 excimer exciplex 激基缔合物指一些荧光团在激发态与另一相同或不同的基态荧光团接近时往往能生产激基缔合物 通过 堆积作用形成激基缔合物 可观察到双重荧光 它的发射光谱不同于单体的荧光 新的荧光会产生一定的红移 且出现强而宽的 无精细结构发射峰 这种作用本质上是光致电荷转移作用 在两个相同的荧光分子之间形成激基缔合物以及在两个完全不同的荧光分子之间形成激基复合物 可以用下式表示 A AA A excimer A BA B exciplex 23 激基缔合物对距离的要求更为苛刻 只有激发态分子和基态分子达到碰撞距离 3 时才可能形成激基缔合物 因此可以利用各种分子间作用力改变两个荧光团之间的距离 通过结合客体前后单体和激基缔合物的荧光光谱的变化来表达客体被识别的信息 由于萘 芘 葸等荧光团具有较长的激发单线态寿命 易形成激基缔合物等特点 因此常常被用于此类探针中 24 化合物12基于激基缔合物的荧光探针 加入汞离子之前两个芘分子相距很远 因此发射的是芘单体荧光 当汞离子存在时 O N原子与其配位形成化合物13 从而拉近了两个芘分子之间的距离 且让其平行排列 最后产生二聚体荧光 1213 25 5 有机载体在荧光分子探针中的应用 罗丹明罗丹明及其衍生物是一种氧杂蒽类荧光染料 由于苯环间氧桥的存在 从而分子具有刚性共平面结构 使其分子结构稳定性增强 开环状态下 在激发光的作用下能产生强烈的吸收和荧光 其最大发射波长位于500 700nm之间 为红色可见光区 可有效的避开生物体系背景荧光 从而能提高探针的灵敏度 因此是生物分析中经常用到的荧光探针 具有很高的研究和应用价值 26 罗丹明内酰胺螺环结构具以下特点 1 罗丹明的内酰胺螺环是非共轭结构的 因此在长波长处无吸收 无色 无荧光 2 内酰胺螺环结构在酸性条件或者与被分析物结合后能够诱导罗丹明内酰胺结构开环 氧杂蒽结构电子重新排布 共轭结构恢复 因此在长波长有吸收 有颜色 强荧光 由于此结构的优势 罗丹明内酰胺类衍生物是一类很好的OFF ON型荧光传感器荧光团 因此可以用罗丹明作为母体来进行设计 首先使它形成具有酰胺螺环结构的化合物 当它与被分析物作用时 内酰胺螺环结构被打开 信号从无到有 达到对被分析物的识别的目的 1415 27 芘芘分子由四个苯环构成 是一种四环多环芳香类物质 有很强的荧光 在丙酮中量子产率可达0 99 其晶体加电压可发光 最初用于电致发光研究 芘荧光基团是最有用的荧光化学敏感器之一 芘基团附近连接一氨基已被广泛采用的在选择具体的金属离子 通过控制信号光诱导电子转移 PET 过程来选择性识别金属离子 28 检测银离子 化合物16和17 加入了Ag 后 该探针荧光由单体荧光变为激基缔合物的荧光 对Ag 有高灵敏度和高选择性 其中 化合物17对Ag 只有微弱的响应 这是由于化合物16带有羟基与Ag 配位起了决定性的作用 在自由态时 化合物18表现出很强的激基缔合物荧光 Ag 存在时与氮配位 使两个芘分子距离变远 激基缔合物荧光减弱 单体荧光增强 因此可以对银离子进行比率型检测 16 1718 16R OH17R H 29 有机荧光探针最新研究进展 随着荧光探针的合成及应用技术的不断改进 人们对有机荧光化合物的认识和研究也不断深入 有机荧光探针的发展前景将越来越广阔 30 1BODIPY类二氟化硼 2 二吡咯甲烷 BODIPY 是一类重要的有机荧光染料 由于其分子结构易于改性 近十年来研究人员合成了一系列的BODIPY衍生物 并在荧光探针技术上得到应用 这类荧光染料具有荧光量子产率高 摩尔吸光系数大 稳定性好 对pH 溶液极性不敏感等优点 因而在金属离子检测 PH值测定 DNA的标记及测序等方面得到重要应用 31 1 1基于BODIPY的金属离子荧光分子探针研究进展 对金属离子探针的研究早在20世纪七八十年代就已开始 2008年 SerdarAtilgan 等人通过逐步法合成了一种高灵敏的锌离子荧光探针 32 WenwuQin MukuleshBaruah 等人合成了含氮杂冠醚取代基的BODIPY衍生物 这种基于BODIPY的染料分子表现强烈的依赖溶剂的荧光发射特征 33 XiaojunPeng 研究组合成了一个能专识别Cd2 离子的荧光探针 该探针具有较好的细胞穿透性 并且首次被应用于活体细胞内Cd2 的检测 其机理为分内电荷转移机理 IcT 探针的最大发射波长为656nm与Cd2 络合后蓝移至597nln 而Zn2 及其它金属离子没有干扰 结构如图所示 34 YufangXu和XuhongQian则根据PET机理设计合成另一种高选择性的镉离子荧光探针 探针分子本身在溶液中几乎无荧光 而且不易受PH的影响 Zn2 Pb2 Cr3 Fe3 Cu2 Hg2 Ag Ba2 Mg2 Co2 Cs Na K Ca2 和Ni2 的存在几乎不影响荧光发射广谱 对Cd2 展示出高度的选择性 35 MingjianYuan 等设计了一个基于PET和ICT双重机理的Hg2 荧光探针 该探针包含有两个受体 分别以PET机理和ICT机理与Hg2 结合 加入Hg2 前荧光较弱 最大发射波长在668nm 而络合Hg2 后荧光增强超过7倍 最大发射波长蓝移到578nm 对Hg2 显示出良好的选择性和高度的敏感性 结构如图所示 36 XuhongQian 等以BODIPY为荧光团 以聚酰胺为受体 合成一系列基于PET机理的Hg2 荧光探针 每个探针分子能够络合两个Hg2 荧光增强显著 该系列探针拥有专一的选择性 高灵敏性以及良好的水溶性 也许是因为水溶性太好所以不能够透过细胞膜 未能做到在细胞内荧光成像 结构如图所示 37 1 2基于BODIPY的pH荧光分子探针的研究进展 pH在许多体系扮演重要角色 因而测定pH具有重大的意义 目前测定pH的方法很多 荧pH荧光探针是其中一种重要手段 相较其他分析方法 pH荧光探针具有不破坏待测体系 高灵敏度的特性 故在细胞生物学 药物学 生物化学上应用广泛 近年来 人们合成了多种pH荧光探针 38 1 3基于BODIPY的染料的其它荧光探针 目前以BODIPY染料为母体结构的荧光探针多数都是用于检测金属离子及pH的 但研究人员的兴趣不局限于此 近来利用BODIPY染料合成了一些可以对某些酸 酸根离子或氧化物响应的荧光探针 39 EnginU Akkaya 合成了一种BODIPY衍生物可以检测溶液中微摩尔浓度的氰离子 当溶液有氰离子存在时 这种结构简单的荧光探针的发射强度急剧下降 溶液颜色可逆的由红色变为蓝色 荧光探针的合成 结构及可能的作用机理如图3 2所示 40 YoungkyuDo