最新鱼类线粒体DNA的遗传分析研究ppt课件.ppt

鱼类线粒体基因组研究进展 姓名 1 研究背景 线粒体是存在于绝大多数真核细胞内的一种基本的重要的细胞器 它含有自己的DNA 具有相对独立的遗传系统 它是细胞进行氧化磷酸化的场所 线粒体基因组不仅是研究DNA结构与复制转录的良好模型 也是研究真核细胞核酸与蛋白质合成非常合适的模型系统 2 鱼类线粒体基因组 线粒体DNA是Nass等在1962年发现的 之后 1992年台湾学者Tzeng等发表了台湾缨口鳅线粒体DNA全序列 这在鱼类是首次 截止到2004年已测定161种鱼类线粒体DNA全序列 它们的分子量在15 2 19 8Kb之间 除海七鳃鳗 淡水七鳃鳗和溪鳉外 其余158种鱼mtDNA的结构和基因成分都与其他脊椎动物的类似 鱼类线粒体DNA基因组结构示意图 西田 1998 3 37个编码基因 22个tRNAs 2个rRNA基因 12SrRNA和16SrRNA 控制区 D 环区 轻链复制起始区 13个疏水蛋白基因 细胞色素b Cytb 2个ATP酶的亚单 ATPase8和ATPase6 3个细胞色素c Cytc 氧化酶的亚单位 CO 和 7个NADH还原酶复合体的亚单位 ND 1 2 3 4 4L 5和 6 4 鱼类线粒体DNA 结构特点 提取方法 研究进展 应用前景 研究内容 遗传特点 检测分析 5 一 鱼类mtDNA的遗传特点 mtDNA通常为母性遗传 这种传递方式是由于成熟的卵母细胞所含的mtDNA较精子中的mtDNA高几千倍 该遗传方式便于进行群体分析 只需少量个体便能反应群体遗传结构 mtDNA进化主要以碱基替换为主 插入和缺失较少 碱基替换主要发生在基因间隔区和控制区 且不同部位替换速率不同 mtDNA进化速率较核DNA快5 10倍 其原因主要有 1 选择压力小 2 受诱变的影响大 3 代谢增补时间短 4 复制无校对修复 6 1 分子较小且存在长度多态性 鱼类mtDNA分子大小范围一般在15 19kp之间 约占总DNA的1 鱼类mtDNA的分子大小在种间存在差异 但这种长度差异并非源于基因数目 主要由于串联重复序列的存在 2 编码效率高 同核DNA相比 mtDNA上的基因排列极其紧凑 基因间隔常少于10bp 且无内含子 编码效率较高 此外 部分mtDNA的密码子不同于基因组DNA 且缺少终止密码子 仅以U或UA结尾 3 拷贝数多 鱼类每个细胞中有1000 10000个线粒体DNA拷贝 容易从组织中分离纯化 4 进化速度快 鱼类mtDNA的突变率高于核中DNA 为基因组DNA的5一10倍 并且缺乏有效的DNA损伤修复机制 修复效率低 二 鱼类mtDNA的结构特点 7 5 解码体系简单 鱼类mtDNA的解码由一个很小的tRNA体系完成 而不像在核基因组摆动假说中所要求的需要在32个tRNA反密码子上的摆动 6 遗传的相对独立性 mtDNA能以自身为模板进行复制 能转录生成信使RNA mRNA 转运RNA tDNA 和核糖体RNA rRNA 也能编码合成一些维持自身结构和功能所必需的蛋白质 具有很大的独立性 同时 线粒体的遗传行为受到核基因的调控 这种调控主要是通过向线粒体输入核DNA编码蛋白质和一些小的RNA 特别是tRNA来实现的 7 同质性与异质性 一般情况下 在一种生物机体内仅存在一种类型的mtDNA分子 但现在大量发现一些个体存在多种类型mtDNA分子 这种特性被称mtDNA分子的异质性 8 多态性 mtDNA中存在多态现象多态性集中在D环 其他区域则高度保守一 9 母系遗传 mtDNA一般不发生重组 随细胞质进行 但鳗鱼线粒体为双亲遗传 8 三 鱼类mtDNA的提取方法 1 直接从鱼类组织提取线粒体DNA从肌肉 肝脏等组织中提取线粒体DNA 其中碱变性法是常见的实验方法 主要溶液是STE液 10mmolNaC1 15mmolTris HC1 pH8 0 45mmolEDTA pH8 0 0 25mol蔗糖 把提取的线粒体DNA放入一20 保存备用 该方法获得的是鱼类的整个mtDNA分子 一般肝细胞 胃壁细胞 肾脏细胞中的线粒体数目较多 直接提取mtDNA获得纯度很高的mtDNA用于研究要选取这些组织 必须杀死鱼才能得到 研究存在数量多的鱼类可以采用该法 2 先提取基因组DNA再用相应引物PCR扩增所需mtDNA某一区域序列片段 9 四 鱼类mtDNA的检测分析 目前用于鱼类mtDNA多态性的检测方法主要有以下几种 1 内切酶图谱法 一般用双酶消化构建鱼类mtDNA限制酶图谱 内切酶图谱法是一种较早的研究方法 此法虽在检测点突变上较为直观 但费时且须做双酶切 其谱带亦较复杂 若个体出现多态就更难解释 2 标准RFLP 其研究步骤为 mtDNA样品一RE消化一电泳一结果检测 该法适合于分析样品中靶序列含量相对较高的样品 如mtDNA和PCR扩增产物 还可进行位点比较和片段长度比较 3 PCR RFLP法 从细胞总DNA中 用设计的引物扩增mtDNA某一序列 RE消化 溴化乙锭染色 电泳检测 这一技术不仅可直接酶切小于500 2000bp的短小片段 还避免了纯化mtDNA的繁琐工作 10 4 探针法 又称杂交法 将基因组DNA酶切 用mtDNA探针进行South杂交来识别DNA上的mtDNA谱带 通过自显影检测印迹 5 PCR SSCP 是PCR技术和SSCP技术的结合产物经过变性后进行单链DNA凝胶电泳时每一条单链处于一定的位置 靶DNA中若发生碱基缺失插入或单个碱基置换时就会出现泳动变位从而揭示该片段有基因变异的存在 6 测序法 直接测定mtDNA的全序列或特定片段的序列 这种方法可获得大量直接可靠的数据 目前 一般测序公司采用测序的原理是双脱氧链终止法 11 五 鱼类mtDNA研究进展 一 鱼类全序列mtDNA研究 曹萤等使用6种酶对尼罗非鲫和奥利亚非鲫的mtDNA进行RFLP分析 测得两种鱼mtDNA都约为16 83kb 并认为Pvu 可作为鉴别两种鱼类的限制性内切酶 二 鱼类mtDNA编码区各片段的研究 1 细胞色素b Cyt b 基因片段 田燚等对六个鲫鱼品系进行了线粒体Cytb基因PCR RFLP分析利用5种限制性内切酶对细胞色素b基因进行酶切 结果显示供检测到4种组合单倍型 野鲫和黑龙睛的遗传距离为0 高背鲫与彭泽鲫的为0 野鲫与红鲫为0 00039 得到的结果为鲫鱼群体内的多态性比较贫乏 12 2 ATPase8 ATPase6 刘良国等运用PCR扩增 克隆 测序等技术对五种鲫鱼品系的线粒体DNAATPase8 ATPase6的基因序列的碱基组成 变异情况和分子系统进化进行了比较分析发现红鲫和普通鲫关系较近 洞庭青鲫和彭泽鲫关系较近 而他们与日本白鲫关系较远 因此推测红鲫 洞庭青鲫和彭泽鲫均起源于普通鲫 3 NADH降解酶基因 1 姚纪花等对我国6个地区银鲫的mtDNA2ND5 6片段进行了RFLP分析 共获得11种图谱和7种限制性类型 根据各群体间的遗传距离构建了UPGMA聚类关系图 探讨了银鲫6个种群间的遗传关系 13 2 庄怡等人采用PCR RFLP方法分析鲫鱼不同品系mtDNAND3 ND4L ND4基因片段 对鲫鱼6个不同品系的基因片段进行测序 首次提出异育银鲫和浙江地区野鲫 河鲫鱼 在mtDNAND3 ND4L ND4基因上的分子鉴定法 4 细胞色素c基因片段 大量研究表明 物种内的COI基因的序列分歧很少有大于2 的 大部分的种内分歧小于1 程磊等人利用鱼类的DNA条形码研究了线粒体细胞色素c氧化酶亚基I COI 基因5 端651bp的片段在这些种和亚种 共计128尾标本 中的变异 得到的结论为 金鱼起源于中国南方的鲫而不是银鲫 以及发现某些单倍型是二倍体与三倍体共享的 所以倍性也不宜作为种的划分标准 简单的将三倍体视为独立的种或者亚种并不恰当 14 三 鱼类mtDNA非编码区各片段基因研究进展 鱼类mtDNA非编码区包含两段 一段是控制区 controlregion 另一段是L 链复制起始区 1 mtDNA控制区结构研究 控制区又称D 环区 位于tRNAPro和tRNAPhe基因之间 是整个mtDNA序列和长度变异最大的区域 但其中也包含有保守片段 因此常常作为线粒体mtDNA遗传分析基因片段 例如 朱雪莲等人借助mtDNA控制区序列分析金鱼与不同地域鲫的亲缘关系 刘琳等人应用PCR技术对行两性生殖的天津子牙河42尾二倍体野生鲫鱼群体mtDNA的D loop区段进行扩增 结果显示 个体间不存在长度变异现象 15 控制区包括 H链复制起始区 OH终止结合序列区 TAS保守序列区 CSBL 链启动子 LSPH 链启动子 HSP 16 1 H链复制起始区 OH 包含与DNA复制终止相关的序列TAS 拷贝数在l 8个之间 mtDNA长度变异的主要原因 目前郭新红 1 等人识别了不同倍性鲤科鱼中的ETAS为TACATAT ATGTATTATCACCAT TATATTAACCA 郭新红等人在研究不同倍性鲤科鱼类mtDNA控制区的结构时发现红鲫 鲤鱼 异源四倍体鲫鲤含有4个TACAT核心序列 日本白鲫中含有3个TACAT核心序列 三倍体湘云鲤含有1个TACAT核心序列 而已有报道的斑马鱼中含有6个TACAT核心序列 17 2 中央保守区 郭新红等人识别了不同倍性鲤科鱼类mtDNA控制区的中央保守区的CSB F 关键为 ATGTAG GAGACCACC CSB E 关键序列为 ATG AT GAATCA GGACA CSB D 关键序列为 TTAT CTGG ATCTG T AA 18 3 保守序列区 郭新红等人识别了不同倍性鲤科鱼类的CSB1 一般形式为 ATT AATTAATG T GCAGGACA TA CSB2 一般形式为 CAAA CCCCCCTACCCCC CSB3 一般形式为 TGTCAAACCCGAAACCA 19 2 L 链复制起始区 L 链复制起始区 OL 长约30 50bp 位于L 链tRNAAsp和tRNACys基因间 富含G C对 而环的碱基组成 长度变异比较大 5 GCCGG 3 是OL中RNA引物与DNA合成的转换区 位于H 链OL茎区5 端 其序列组成和位置从人 海豹 果蝇到鲤鱼 泥鳅 虹鳟都是十分保守的 20 六 鱼类mtDNA应用前景 1 群体遗传结构分析例如 周建峰等运用PCR RFLP方法分析了鲤鱼3个亚种线粒体DNA的ND5 6区段来了解它们之间的遗传关系 找到了区分鲤鱼3个亚种的线粒体DNA分子遗传标记2 类群识别例如 多态性丰富的mtDNA可作为类群识别的标志 Barlett等 5 利用Cytb基因的307bp序列 成功地区别了加拿大东海岸的4种有重要商业价值的金枪鱼 为保护处于