青蒿素的提取分离研究终稿毕业论文.doc

青蒿素的提取分离研究摘要本文研究了野生黄花篙植物中青篙素的提取和分离过程，确定了一条由青篙原料出发、较为合理的提取分离工艺路线。本文比较了冷浸法、索氏提取和恒温搅拌三种提取方式对青篙素的提取回收率（青篙素提取量/原料青篙素含量），结果分别为：46.48%、68.9%、79.60%，确认恒温搅拌提取方式回收率最高。对石油醚恒温搅拌提取方式利用单因素实验分析了温度、时间、搅拌速率、原料粒度、溶剂量等因素对青篙素提取的影响，结果表明，各因素对青篙素提取在一定程度上表现为促进的作用，在一定范围内回收率增加很快，但超过这个范围，提取回收率随之增加的趋势变缓且逐渐呈现下降的趋势。采用四因素四水平正交实验方法，得到了青篙素较好的提取工艺条件，即提取时间180min，提取温度50，搅拌速度500r/min，原料粒度60目，每克青篙叶粉溶剂用量为60mL。关键词：黄花篙 青篙素 提取分离 含量测定AbstractExtraction and separation of Artemisinin from wild Artemisia annual was studied in this dissertation, a rational extraction technical route based on Artemisinin raw material was established,and the simulation of the extraction process was achieved using the error back-propagation network. The constant-temperature stirring extraction was affirmed having the highest extraction mass rate of recovery,compared with the infusing under room temperature and Soxhlet extraction methods,which mass rate of recovery was 46.48% and 68.9%.The effects of temperuatre,time,stirring speed,grinding degree of material,quantity of solvent and other factors on the extraction rate of recovery were discussed,and the results were also given that those factors were beneficial to the extraction of Artemisinin within a certain range and the extraction rate of recovery got a rapid increase within this range,then the increasing tendency slowed down and gradually presented the Downtrend beyond this range.By the optimizing experiment the appropriate technical conditions were established as extraction time at 180min,temperuatre at 50,stirring rate at 800r/min,material grinding degree at 60 meshes,solvent quantity at 60mL/g.Keyword: Artemisinin annual; Artemisinin; extraction and separation; Content measuration目 录摘要IAbstractII第1章 绪论11.1 研究的目的和意义11.2 国内外现状11.2.1 青蒿素的结构11.2.2 青蒿素的物理性质21.2.3 青蒿素的化学性质21.3 青蒿素的电化学性质41.4 青蒿素的作用及其应用41.4.1 青蒿素的作用41.4.2 青蒿素的应用及市场前景5第2章 青蒿素的提取分离方法62.1 天然药用成分提取分离方法62.1.1 传统提取分离方法62.1.2 提取新技术62.2 青篙素的制备92.2.1 青篙素的化学合成92.2.2 青蒿素的生物合成92.2.3 植物组织培养合成青蒿素102.2.4 天然植物中提取青篙素112.3 黄花篙植物中青篙素的提取112.3.1 原料、设备及分析方法112.3.2 实验及标准曲线测定112.4 青篙素的分析测定方法132.4.1 定性分析13第3章 实验结果分析与总结153.1 实验结果分析153.1.1 实验条件的选择153.1.2 搅拌提取的单因素实验163.1.3 不同方法提取产物比较203.1.4 结语203.2 实验总结22参考文献23致 谢25第1章 绪论1.1 研究的目的和意义菊科植物黄花蒿（Artemisinin annual.药青蒿）在我国用作抗疟中药已有二千多年的历史。我国科学工作者70年代首次从中分离出一个含过氧基团的新型倍半萜内酯，并命名为青蒿素( Artemisinin；Arteannuin；Qinghaosu；QHS)1。国内外大量理化实验，药理研究及临床应用表明，青蒿素是抗疟的有效成分2,4。其结构独特，抗疟机制特别，对抗氯喹的恶性疟和脑性疟有特效，正因为它具有结构上的新颖性和药理作用中高效低毒等特点，国际上有关方面认为青蒿素的发现是抗疟研究史上的重大突破3,5，并已成为世界卫生组织推荐的抗疟药品6。由于其结构独特，抗疟机理特别，对抗氯喳的恶性疟和脑性疟有特效，且高效低毒的特点，而被WHO称为“世界上目前唯一有效的疟疾治疗药物”。与此同时，国内外学者进行了大量的药理及临床研究。实验表明在疟原虫红内期内，青篙素能有效干扰疟原虫的表膜线粒体功能，阻断了以宿主红细胞浆为营养的供给，直接杀伤疟原虫7。此外青篙素在其他疾病的治疗中也显示出诱人的前景。如抗血吸虫8,9，调节或抑制体液的免疫功能10,11，提高淋巴细胞的转化率，利胆，祛痰，镇咳，平喘等12。目前，已研制出了第二代换代产品和用青篙素治疗肿瘤、黑热病、红斑狼疮等疾病的衍生新药，同时开始探索青篙素治疗艾滋病、恶性肿瘤、利氏曼、血吸虫、涤虫、弓形虫等疾病以及戒毒的新用途13-16。青蒿素不仅是一种抗疟药物，在其他疾病的治疗中，也潜在诱人的前景，它能显著提高淋巴细胞转化率，增强抗体的免疫功能17,18-20和抗流感功能，治疗登革热时，疗效显著优于吗啉双胍等西药。青蒿素新用途的研究正在激烈的竞争中，人们特别希望青蒿素及其衍生物能在治疗艾滋病（AIDS）和相关疾病方面取得进展2,3。与此相应地，有关青蒿索的理化性质、测定方法、提取分离、药理研究、合成方法等都引起了世界范围内广泛的兴趣，并取得了不少进展。本文仅对青蒿素的主要理化性质及其测定方法研究方面的进展作一综述。1.2 国内外现状1.2.1 青蒿素的结构青蒿素的分子式为 C15H22O5，分子量282.33，分子结构如。它是一种新型倍半萜内酯，具有过氧键和-内酯环21,22，有一个包括过氧化物在内的1,2,4三惡烷结构单元，这在自然界中是十分罕见的，它的分子中包括有7个手性中心2,7,23。它的结构如，其特征是A、B环顺联，异丙基与桥头氢呈反式关系，青蒿素中A环碳架被一个氧原子打断1,7,8。图I 1.2.2 青蒿素的物理性质青蒿素为无色针状结晶，溶点为156-157（C=1.64氯仿）。易溶于氯仿、丙酮、乙酸乙酯和苯，可溶于乙醇、乙醚，微溶于冷石油醚，几乎不溶于水 2,8,9,21。因其具有特殊的过氧基团，它对热不稳定，易受湿、热和还原性物质的影响而分解5,7,.9,.26 。IR谱（KBr）具有一个六元环内酯（1745cm-1）过氧基团（831,881,1115 cm-1）。不含双键，无紫外吸收2,27。高分辨质谱（m/z 282.1472M+）及元素分析（c63.72，7.86）1。结晶学参数：晶胞参数a=24.098，b=9.468/i，c=6.399A。密度：实验d0=0.30 g/cm3，计算 d0=1.294g/m3单胞中分子数 Z=41。1.2.3 青蒿素的化学性质1.2.3.1 过氧基团反应 青蒿素与三苯基磷反应可以证明青蒿素含有一个当量的过氧基，其做法是青蒿素在三苯基磷和二甲苯溶液中通氮气回流，加甲醛及水搅拌，水洗有机层，合并水层及酸性溶液，加碱后，用无过氧化物乙醚提取，无水硫酸钠干燥，除去乙醚，测得三苯基磷重量，结果证明消耗三苯基磷克分子数与青蒿素相近1,8。1.2.3.2 显色反应显色反应是用以鉴定青蒿素简单可行的方法，主要有以下几种：(1)对二甲氨基苯甲醛缩合反应：取实验产品青蒿素约l0mg，加乙醇2mL溶解，加对二甲氨基苯甲醛试剂1mL置水浴上加热，溶液呈蓝紫色反应。(2)异羟肟酸铁反应：取样同(1)，溶于1mL甲醇中，加人=7盐酸羟胺甲醇溶液4-5滴，在水浴上加热至沸，冷却后加稀盐酸调至酸性，再加人=1FeCl3乙醇溶液1-2滴，溶液呈紫红色反应。(3)2,4-二硝基苯肼反应：取样同(1)，溶于1mL氯仿后，滴于滤纸片上，以2,4-二硝基肼试液喷洒，在80烘箱中烘10min，产生黄色斑点。(4)碱性间二硝基苯反应：取样同(1)，溶于2mL乙醇中，加人=2间二硝基苯的乙醇液和饱和的KOH乙醇液各数滴，水浴微热，溶液呈红色反应。1.2.3.3氢解反应 青蒿素在含有钯-碳酸钙的甲醇溶液中，在常温、常压下催化氢化，过氧化物被还原成化合物。在此反应过程中，反应最初所得为油状物，若将其溶于有少量丙酮的正已烷中，需放置4-5d。变为化合物的晶体，而在重氮甲烷中则甲酯化得到甲酯化合物8,17。1.2.3.4还原反应青蒿素溶于甲醇，在冰浴中（0-5）搅拌分次慢慢加入固体硼氢化钠，加完后继续搅拌半小时。反应液用冰醋酸中和，减压除去溶酶，即得到化合物V的粗结晶产物，它是用硼氢化钠还原青蒿素而得到的半缩醛化合物。如用钯-碳酸钙在常温常压下进行催化氢化，则会失去氧而得到环氧化合物1,8,10。 1.3青蒿素的电化学性质陈扬等采用多种电化学方法研究了青蒿素分子中过氧基在Hg电极上的还原，还原电位在0.0V（Vs.AgAgCl）附近，电极过程为不可逆还原，还原时反应电子数n=2，半渡电位El/2=0.012V，电子转移系数=0.66，表观标准电极反应速率常数Ks=6.3410-6cms，扩散系数D=4.310- 6cm2/s，反应产物在电极表面具有吸附性14。另外，还用电化学方法研究了青蒿素与氯化血红素之间的相互作用。青蒿素在玻璃碳电极上于一1.08V处发生一个2电子转移的不可逆还原15。Chart.K.L等用HPLC-ECD的方法研究了青蒿素的电化学性质 16。1.4 青蒿素的作用及其应用1.4.1 青蒿素的作用青篙素是我国唯一得到国际承认的具有自主知识产权的抗疟新药。它发挥药理作用分两步：(1) 活化：青蒿素被疟原虫体内的铁催化，其结构中的过氧桥裂解，产生自由基；(2) 烷基化：第一步所产生的自由基与疟原虫蛋白发生络合，形成共价键，使疟原虫蛋白失去功能，从而死亡。此外，青蒿素还具有多种其他药理活性。 抗疟作用通过产生自由基，对恶性疟原虫红内期的生物膜产生严重破坏作用，或与原虫蛋白结合，使之死亡。 抗卡氏肺孢子虫肺炎作用青蒿素主要破坏卡氏肺孢子虫膜系结构，引起孢子虫滋养体胞浆及包囊内出现空泡，线粒体肿胀，核膜破裂，内质网肿胀，囊内小体溶解破坏等超微结构的改变。 肿瘤的作用二氢青蒿素对白血病、黑色素瘤、结肠癌、前列腺癌和乳腺癌细胞株高度敏感，能显著下调K562细胞血管内皮生长因子（VEGF）蛋白和mRNA表达，有效抑制K562细胞的增殖。 抗血吸虫作用其抗血吸虫活性基团是过氧桥，其药用机理是影响虫体的糖代谢。 治疗弓形虫感染作用青蒿素主要作用于虫体细胞膜、线粒体及细胞核，继而广泛损伤其膜系结构，造成核膜断裂、线粒体肿胀、空泡样变性、内质网扩张甚至出现核碎裂、核溶解现象。 对心血管的作用青蒿素能明显对抗结扎冠脉引起的心律失常，可使氯化钙、氯仿引起的心律失常发作时间明显推迟，室颤明显减少。 对免疫系统的作用青蒿素能减少原虫感染动物IgG含量，使脾脏重量减轻，血中补体C3和血清总补体含量降低，控制血空斑和玫瑰花结形成细胞。1.4.2 青蒿素的应用及市场前景青蒿素主要应用于抗疟，研制成功的药品主要有蒿甲醚片/胶囊/注射液等。青蒿素具有很多作用，当前，作为有全球90%以上疟疾病例的非洲大陆，90%以上的非洲国家药品依赖进口。氯喹类产品（主要是奎宁和氯喹）占世界抗疟药市场的80%。目前这些产品的治疗费用偏高，整个疗程费用达1520美元左右，而且毒副作用大，同时由于疟原虫对现有的治疗药物具有一定的耐药性及恶性疟疾原虫株的出现，使疟原虫现已经产生抗药性（特别是东南亚地区抗药性疟原虫株已达80%），可以说这类药物现已基本失去了疗效，给疟疾的防治带来了困难。为此，国际上迫切需要寻找新的抗疟疾药物。而青蒿素类药物正好在抗氯喹原虫耐药株恶性疟等方面具有较大的优势。正如世界卫生组织热带传染病机构负责人戈达所说，青蒿素衍生物是当前治疗疟疾的换代新药。专家预铡，该类药物将会以极快的速度取代奎宁、氯喹等传统抗疟药而跃升为未来的主流药物，在世界抗疟药领域占领35成市场。青蒿素产业正在受到世界各国的广泛关注，已成为一个具有巨大市场前景的产业。作为特殊行业，医药产品的生命周期明显长于一般的工业产品，尤其是产品的市场引入期。一般一个全新药物的上市，引入期需要510年时间。我国青蒿素正处于市场引入期。尚未进入快速成长期。第2章 青蒿素的提取分离方法2.1 天然药用成分提取分离方法2.1.1 传统提取分离方法2.1.1.1 提取方法用液体把固体（通常是粒状）所含的物质提取出来的操作被称为浸取或者固体浸出24。这时的固体，其本身并不是均质的，而是由不溶解的固体残渣和被分散包容于其中的溶液所构成。固体浸取的工艺过程，首先是从把固体颗粒变小开始的。一般所粉碎的薄片厚度约为0.2mm。片越薄，粒越小，浸出所需的时间就越短，当固体尺寸大致减小一半，浸出时间缩短为原来的四分之一。但是粒度越小，会导致阻力损失增大，并且固液分离的难度加大，造成浸取液的残留等。经验证明，上述粒度尺寸对浸出操作是有利的。第二步就是把粉碎了的固体浸泡在液体中，使溶质溶解于液相即构成浸出液，然后再从浸出液中提取溶质。浸取的大致过程就是如此。2.1.1.2 分离方法在将植物体中的化学成分提取出来后，要进一步将这些复杂的混合物进行分离。一般用到的方法有：不同极性的溶剂处理法、酸碱沉淀法、铅盐沉淀法、萃取法、吸附法、层析法、离子交换法等。目前混合物分离所用方法中比较多的是柱层析（也称柱色谱），并用薄层层析来摸索柱层析的条件以及检验各种成分按什么顺序从柱中洗脱出来。纸层析近年来用得不多，但在以前其使用较为广泛，因为它比薄层层析所用的设备要便宜。下面对这几种层析方法加以简单的介绍。纸层析是由Consden、Gordon、Martintk和Synge发现的，纸层析可分为分配、吸附和离子交换层析，按所使用的方法可将纸层析分成洗脱，展层析法、多次层析、单向和双向层析、圆形层析、楔形层析和离心层析。薄层层析法是估计有机化合物纯度最快、最容易也是常用的方法。它是一种物理化学的分离技术。原理是由于薄层上的吸附剂对不同物质的吸附力的大小不同，当溶剂流过薄层时，被分离的各物质移动的速度各不相同，经过一段时间毛细管作用的移动，不同的物质就彼此分开，从而获得分离。它操作简便，不受温度等因素影响，混合物分离时间短、灵敏度高、样品用量少。柱层析可用来分离多种物质，尤其是复杂天然混合物的分离。吸附柱层析法能分离毫克量级到百克量级的物质。常用的吸附剂为硅胶和氧化铝。由于常压柱层析有其局限性，如分离速度慢、样品可能被不可逆吸附、不适合采用小颗粒吸附剂等，人们便对柱层析不断改进，如使用干柱层析、减压液相层析等。2.1.2 提取新技术中草药所含成分十分复杂，为了提高中草药的治疗效果，就要尽最大限度提取有效成分，去除无效成分及有毒成分。因此，中草药提取对于提高中药制剂的内在质量和临床疗效最为重要。但常用的提取方法（如煎煮法、回流法、浸渍法、渗流法等）在保留有效成分，去除无效成分方面，存在着有效成分损失大、周期长、工序多、提取率不高等缺点。近10年来，在中药提取方面出现了许多新技术、新方法，这些新技术和方法的应用，使得中草药提取既符合传统的中医理论，又能达到提高有效成分的收率和纯度的目的。2.1.2.1 超临界流体萃取技术超临界流体萃取25.27（Super Critical Fluid Extraction，缩写SCFE）是一种以超临界流体（SCFE）代替常规有机溶剂对中草药有效成分进行萃取和分离的新型技术，其原理是利用流体溶剂在超临界区内与待分离混合物中的溶质具有异常相平衡行为和传递性能，且对溶质的溶解能力随压力和温度的改变而在相当宽的范围内变动，利用这种SCF作溶剂，可以从多种液态或固态混合物中萃取出待分离组分，常用的SCF为CO2，因CO2无毒，不易燃易爆，价廉，临界压力和温度较低，易于安全地从混合物中分离出来。与传统的提取分离法相比，SCFE最大的优点是可在近常温条件下提取分离不同极性、不同沸点的化合物，几乎保留产品中全部有效成分，无有机溶剂残留；产品纯度高，收率高，操作简单，节能；通过改变萃取压力，温度或添加适当的夹带剂，可改变萃取剂的溶解性和选择性。SCFE对于提取分离挥发性成分、脂溶性物质、高热敏性物质以及贵重药材的有效成分显示出独特的优点，但其高压设备，一次性投资大，运行成本高，因此这一技术目前在工业生产中还难以普及。2.1.2.2 超声提取技术超声提取技术26,27的基本原理主要是利用超声波的空化作用加速植物有效成分的浸出提取，另外超声波的次级效应，如机械振动、乳化、扩散、击碎、化学效应等也能加速欲提取成分的扩散释放并充分与溶剂混合，利于提取。与常规提取法相比，具有提取时间短、产率高、无需加热等优点。作为提取的一种手段有着广阔的应用前景。超声提取技术能避免高温高压对有效成分的破坏，但它对容器壁的厚薄及容器放置位置要求较高，否则会影响药材浸出效果。目前超声技术广泛应用于中药质量分析和少量提取中，实验研究都是处于很小规模，要用于大规模生产，还有待于进一步解决有关工程设备的放大问题。2.1.2.3 微波萃取技术微波萃取技术29-31是利用微波能来提高萃取率的一种最新发展起来的新技术。它的原理是在微波场中，吸收微波能力的差异使得基体物质的某些区域或萃取体系中的某些组分被选择性加热，从而使得被萃取物质从基体或体系中分离，进入到介电常数较小、微波吸收能力相对差的萃取剂中；微波萃取具有设备简单、适用范围广、萃取效率高、重现性好、节省时间、节省试剂、污染小等特点。目前，除主要用于环境样品预处理外，还用于生化、食品、工业分析和天然产物提取等领域。在国内，微波萃取技术用于中草药提取这方面的研究报道还比较少。这一技术应用于药材浸出是一种省时便捷，值得推广普及的中药浸出新方法。但这一技术用于中草药提取尚属起步，在理论和实践中还存在一些问题，如微波提取的机理方面、微波对各类成分提取的选择性以及微波用于中药提取的工程放大等，均有待进一步研究。2.1.2.4 酶工程技术中药制剂的杂质大多为淀粉、果胶、蛋白质等，针对杂质可选用合适的酶予以分解除去。酶反应较温和地将植物组织分解，可以较大幅度提高收率，故酶解不失为一种最大限度从植物体内提取有效成分的方法之一。传统的提取方法（如煎煮，有机溶剂浸出和醇处理方法）提取温度高、提取率低、浪费乙醇、成本高，不安全；而选用恰当的酶，可通过酶反应较温和地将植物组织分解，加速有效成分的释放提取；选用相应的酶可将影响液体制剂的杂质如淀粉、蛋白质、果胶等分解去除，也可促进某些极性低的脂溶性成分转化为糖苷类易溶于水的成分而有利于提取。这是一项很有前途的新技术。目前，用于中药提取方面研究较多的是纤维素酶，大部分的中药材的细胞壁是由纤维素构成，植物的有效成分往往包裹在细胞壁内；纤维素则是由-D-葡萄糖以1,4-葡萄糖苷键连接，用纤维素酶酶解可以破坏-D-葡萄糖键，使植物细胞壁破坏，有利于对有效成分的提取。纤维素酶用于以纤维素为主的中药材提取有效成分，的确能提高有效成分的收率，但要拓宽其应用领域，还需要进一步深入探讨酶的浓度、底物的浓度、温度、酸碱度、抑制剂和激动剂等对提取物有何影响。诚然，酶法目前在动物类药材提取方面应用得较为广泛。2.1.2.5 半仿生提取法半仿生提取法4,5（简称SBE法）是将整体药物研究法与分子药物研究法相结合，从生物药剂学的角度，模拟口服给药及药物经胃肠道转运的原理，为经消化道给药中药制剂设计的一种新的提取工艺。即将药料先用一定pH的酸水提取，继以一定pH的碱水提取，提取液分别滤过、浓缩，制成制剂。它将分析思维与系统思维统一起来，形成观察问题的新思路，即在中药提取中坚持了“有成分论，不唯成分论，重在机体的药效学反应”。这种新提取法可以提取和保留更多的有效成分，能缩短生产周期，降低成本，多种复方制剂的研究提示，“SBE法”有可能替代“WE法”（即水提取法）。而且这种提取方法在中药饮片颗粒化的研究中，也有着广阔的应用前景。2.1.2.6 破碎提取法破碎提取法6是通过对植物材料在适当溶剂中充分破碎而达到提取的目的。他们根据流体力学原理，参照国外先进技术，研制出一种新型的破碎提取器，这种提取器主要由高速电机、破碎刀具、容器、底座、主柱及调速开关等组成。电机转速分快、慢两档，破碎提取一次仅需1-2min，提取后药材被破碎成匀浆状。通过选用各种性质的药材，分别进行冷浸提取法、渗流提取法、回流提取法和破碎提取法所得提取物收得率和薄层层析对比试验。结果表明，破碎提取法提取快速、完全，且不需加热，从而可以节约大量的时间、溶剂和能源。破碎提取法虽然操作简单，避免了高温加热，提取时间也极短，但提取物的收率并不是最高，且也局限于实验研究，要应用于大生产，还需进一步研究。2.2 青篙素的制备2.2.1 青篙素的化学合成化学合成青篙素这一复杂的天然分子是有机化学家所面临的挑战。中国科学院上海有机所对青篙素及其一类物的结构和合成进行了大量的工作33,34。1986年，Xu等报道了青蒿素的全合成途径，其合成以R(+)香草醛为原料，经十几步合成青篙素，合成途径如图2-1所示。国外也以不同原料为出发点进行青篙素一类物的化学合成研究35-38。图2-1 青蒿素的化学合成途径Fig.2-1 Chemical synthesis pathways for Artemisinin2.2.2 青蒿素的生物合成意义：（1）通过添加生物合成的前提来增加青蒿素的产量；（2）通过对控制青蒿素合成的关键酶进行调控，或者对关键酶控制的基因进行激活来大幅度增加青蒿素的含量；（3）利用基因工程手段来改变关键基因以增强他们可控制的酶的效率。青蒿素等倍半萜类的生物合成在细胞质中进行，途径属于植物类异戊二烯代谢途径，可分为三大步：由乙酸形成FPP，合成倍半萜，再内酯化形成青蒿素。FPP4,11-二烯倍半萜青蒿酸二氢青蒿酸二氧青蒿酸过氧化物青蒿素。如图2-2所示。目前在青蒿芽、青蒿毛状根和青蒿发根农杆菌等培养体系中进行的青蒿素合成技术极有可能被应用于工业生产。青蒿素由于存在近期复燃性高、在油中和水中的溶解度低以及难以制成合适的剂型等不足，需对其结构进行改造，以期在保持青蒿素优良药理作用基础上开发新药，进一步改善和提高药效。而合成青蒿素衍生物蒿甲醚、蒿乙醚、青蒿琥酯、二氢青蒿素等克服了青蒿素复燃率高的弊病。蒿甲醚。其抗疟作用为青蒿素的10至20倍，目前其开发成功的剂型蒿甲醚注射液为主要含蒿甲醚的无色或淡黄色澄明灭菌油溶液。青蒿琥酯。是目前唯一的能制成水溶性制剂的青蒿素有效衍生物，给药非常方便。作为抗疟药，不但效价高，而且不易产生耐受性。双氢青蒿素。比青蒿素有更强的抗疟作用，它由青蒿素经硼氢化钾还原而获得。图2-2 青蒿素的生物合成途径Fig.2-2 Biosynthetic pathways for Artemisinin2.2.3 植物组织培养合成青蒿素利用植物组织培养方法来生产青蒿素是目前青蒿素研究的另一热点，可能成为大规模生产青蒿素的重要手段。经过几十年的研究，已经在青蒿愈伤组织、悬浮细胞、芽和毛状根等培养体系中进行了青蒿素的合成探究。1994年，秦明波等用发根农杆菌1601成功转化青篙幼茎获得毛状根培养物，提供了以发根农杆菌作为基因载体进行青篙的遗传改造的可行性。与此同时，Weathers等用发根农杆菌15834感染青篙的芽尖和叶片，获得青篙毛状根培养物，并且检测到青篙素的含量约为干重的0.43%，其含量远高于其它青篙组织培养物中青篙素的含量。蔡国秦等用发根农杆菌1601感染青篙叶片建立了毛状根培养系，并在培养物中检测到青篙素，在添加赤霉素的条件下青篙素的含量约为干重的0.2%。Vegruawe等利用根癌农杆菌感染青蒿叶片，获得转基因植株中青蒿素含量约为干重的0.17%，青篙素合成前体青篙素B的含量约为0.22%，为通过转基因植物进行青篙素大量生产奠定基础。2.2.4 天然植物中提取青篙素除了化学合成、生物合成、植物组织培养制备青篙素以外，天然产物的提取也是一种简便高效的青篙素制备方法，尤其我国发展青篙素产业在资源方面具有无可比拟的优势。目前除黄花篙外，尚未发现含有青篙素的其它天然植物资源。黄花篙虽然系世界广布种，但青篙素含量随产地不同差异极大。据迄今的研究结果，除我国重庆东部、福建、云南、广西、海南部分地区外，世界绝大多数地区生产的黄花篙中的青篙素含量都很低，无生产价值。因此，我国具有明显的资源优势。所以，通过天然产物提取青篙素的各种方法，也就成为青篙素制备研究的热点问题。如今，天然产物提取青篙素的方法包括有机溶剂提取、超亚临界CO2萃取、微波萃取等方法。2.3 黄花篙植物中青篙素的提取有机溶剂提取，青篙素易溶于氯仿、丙酮、乙酸乙酯和苯，可溶于乙醇、乙醚，微溶于冷石油醚，几乎不溶于水。因此可用有机溶剂提取植物中的有效成分，然后用柱层析或重结晶等方法分离精制得到青篙素。基本工艺是：干燥-破碎-浸泡、萃取（反复进行）-浓缩提取液-粗品-精制。2.3.1 原料、设备及分析方法 实验原料：干青蒿叶末，将经过筛选的青蒿叶置于烘箱中40烘烤3h后取出，用瓷乳钵研磨至粉状，过筛，制成青蒿叶粉，储于干燥器中备用。 主要试剂：青蒿素标准品为Sigma Chemical Co.，2储存。试剂均为石油醚。 仪器分析：紫外分光光度法，Beckman DU7500紫外-可见光分光光度计。2.3.2 实验及标准曲线测定冷浸提取：准确称取青蒿样品1g置纸筒中，置于反应器中，加入石油醚浸泡，每24h更换一次溶剂，提取至溶剂无色。恒温搅拌提取：原料放入锥形瓶中，加入相应比例的溶剂，以及搅拌转子和沸石，安装冷凝管，通入冷却水后开始搅拌并加热，加热过程中温度控制在某一温度下恒定。实验条件：青篙原料1g，石油醚溶剂量为60mL，置锥形瓶中，水浴温度恒定为50，搅拌提取2h。索氏提取：是将研细的原料粉末放入滤纸筒内，上下开口处应扎紧，以防粉末逸出。将其放入提取器的提取筒中，滤纸筒不宜太紧，以加大固体和液体的接触面积。从提取管上口加入溶剂，当发生虹吸时，液体流入烧瓶中，再补加过量溶剂。装上冷凝管，通入冷却水，加入沸石后开始加热。液体沸腾后开始回流，在提取筒中蓄积，使粉末浸入液体中。当液面超过虹吸管顶部时，蓄积的液体带着从粉末中提取出来的易溶物质流入烧瓶中。继续使用上述方法，再进行第二次提取。这样重复多次以后，虹吸下的溶剂近无色。实验条件：青篙原料1g，加入60mL石油醚溶剂，置于索氏提取器中，水浴温度恒定为500，提取2h。使用Soxhlet提取器来进行提取。图2-3 索氏提取装置图Fig2-3 Soxhlet extraction instruments样液处理：提取结束时，将提取液冷却至室温后，抽滤，滤液置于分液漏斗中，加入2% NaOH溶液洗去碱溶性部分，弃去下层碱液后，以蒸馏水洗涤至中性。经水洗后的提取液置于圆底烧瓶中55减压蒸馏，得到含青蒿素的浸膏，再以95%乙醇溶解浸膏，并定容于50mL容量瓶中备测。图2-4 恒温搅拌提取装置Fig.2-4 Constant temperature reaction instruments标准曲线的制备：精确称取80干燥至恒重的青蒿素标准品10mg置100mL容量瓶中，用95%乙醇稀释至刻度。分别吸取0，2，4，6，8，10mL于50mL容量瓶中，以95%乙醇补充至10mL，补加0.2%NaOH溶液至刻度，置（501）水浴中反应30min，流水冷却至室温。在292nm处测吸光值。标准曲线的线性回归相关系数为0.999。青蒿素浓度C可按下式计算：C= 1.05138A+0.0105983（mg/50mL） 样品溶液的测定：吸取样液2mL于20mL容量瓶中，补充95% 乙醇至4mL后，加入0.2%NaOH溶液至刻度。50水浴中反应30min后取出，流水冷却至室温。292nm处测吸收峰。青蒿素提取量M及提取回收率E的计算式如下：M=C50VsnW0（mg/g）E=MM0100%其中：Vs=20mL，被测样品体积；n=25，稀释倍数；W0=1g，原料用量；A-吸光度；M-青蒿素提取量，mg/g；M0-原料青蒿素含量，mg/g。2.4 青篙素的分析测定方法2.4.1 定性分析2.4.1.1 薄层层析法薄层色谱法（thin-layer chromatography，TCL）是将细粉状的吸附剂或载体涂布于玻璃板、塑料板或铝片上，成一均匀的薄层，经点样、展开与显色后，再与适宜的对照物质按同法所得的色谱图作对比，用于进行药品的鉴别，杂质检查或含量测定的方法。TLC法是一种物理化学的分离技术。2.4.1.2 显色法显色法即利用青蒿素的显色反应用作青蒿素的检识。显色反应是用以鉴定青蒿素简单可行的方法，主要有以下几种：1)异羟肟酸铁反应：取本品10mg溶于1ml甲醇中，加入7% 盐酸羟鞍甲醇溶液4-5滴，在水浴上加热至沸，冷却后加稀盐酸调至酸性，然后加入1% 三氯化铁溶液1-2滴，溶液即呈紫色。2)2,4-二硝基苯肼反应：取本品10mg溶于1ml三氯甲烷中，将三氯甲烷溶液滴于滤纸片上，以2,4-二硝基苯肼试液喷洒，在80烘箱中烘10min，则斑点呈黄色。3)碱性间二硝基苯反应：取本品10mg溶于2ml乙醇中，加入2% 间二硝基苯的乙醇液和饱和氢氧化钠各数滴，水浴微热，溶液呈紫红色。4)对二甲氨基苯甲醛缩合反应：取实验产品青蒿素10mg，加乙醇2ml溶解，加对二甲氨基苯甲醛试剂1ml置水浴上加热，溶液呈蓝紫色反应。结晶首先遇到的问题是选择合适的溶剂，结晶过程所用的溶剂应该具备以下的条件：不与被提纯物质起化学反应；在较高温度时能溶解多量的被提纯物质；而在室温或更低温度时，只能溶解很少量的该种物质；杂质与样品在这个溶剂中的溶解度相差较大，对杂质的溶解非常大或者非常小。前一种情况是使杂质留在母液中不随被提纯物晶体一同析出；后一种情况是使杂质在热过滤时被滤去；溶剂的沸点不宜太高，要适中大约在60左右，沸点过低溶剂容易挥发逸失，损耗大，亦难以控制；沸点太高则不便于浓缩，同时不易除去；溶剂的沸点应低于化合物的沸点，以免受热分解变质；溶剂熔点还应低于结晶时的温度，以免混入溶剂的结晶；价廉易得，无毒或毒性很小，便于操作。第3章 实验结果分析与总结3.1 实验结果分析通过本文的研究，主要得到了如下的实验结果：选择较佳的提取方式，优化提取工艺条件通过观察薄层色谱实验中样品与标准品蓝紫色斑点颜色的深浅、大小，得到如下结论：青篙中提取得到的青篙素易溶于极性较小的有机溶剂，如正己烷、石油醚、乙醚等。考虑到溶剂的提取率、挥发性、刺激性气味等特点，石油醚是青篙素提取较适宜的溶剂。以青篙素的提取回收率为工艺指标，对不同的传统提取方式进行了比选。实验中分别采用了冷浸法、索氏提取和恒温搅拌三种传统提取方式对黄花篙植物中青篙素进行了提取，结果表明，恒温搅拌提取效率最高，索氏提取法次之，冷浸法效率最低。采用石油醚恒温搅拌提取的方式，通过单因素实验，讨论了原料粒度，提取时间，提取温度，溶剂量以及搅拌方式对青篙素提取量的影响，结果表明各因素对青篙素提取在一定程度上表现为促进的作用，特别是提取时间和温度，在一定范围内回收率增加很快，但超过这个范围，提取回收率随之增加的趋势变缓且逐渐呈现下降的趋势。通过正交试验，得到结论：3.1.1 实验条件的选择实验分别对提取介质、原料粒度以及原料中青蒿素含量进行了研究 。溶剂选择：不同溶液对青蒿中青蒿素以及其它成分的溶解度不同，本组实验分别以60mL乙醚、氯仿、正己烷、石油醚（30-60）为溶剂，在50水浴下搅拌提取2h，紫外吸收谱图测定结果如表2-1所示。4种溶剂中石油醚为较适宜的溶剂。表3-1不同溶剂提取物紫外扫描结果溶剂 波长nm/吸收峰值氯仿正己烷 石油醚乙醚205/1.5878 211/0.8057 217/0.8053 231/0.778 9202/0.2706 209/0.2354216/0.2058235/0.2090211/0.3669218/0.3520225/0.3481292/0.5161202/0.7777 208/0.5002214/0.4754220/0.4822292/0.7365292/0.4240292/0 .6570原料粒度的影响：据研究认为12青蒿素主要存在于植物细胞的腺体中，属于胞内次级代谢产物。提取介质首先从原料颗粒外部扩散进入颗粒内部和细胞内溶解青蒿素，由于内外青蒿素浓度差异，青蒿素再扩散进入主体溶液，因而原料颗粒大小对提取效率存在影响。不同粒度对提取影响结果如表2-2所示。显然粒度超过60目以后，粒度影响逐渐不明显。因为过细的原料不仅增加原料预处理成本，而且还会给后续的液-固分离带来困难，实验操作过程中选60目为宜。表3-2原料粒度的影响粒度(目)提取量M(mg/g)提取收率E(%)吸光值A102040601003.554.365.695.825.9748.659.675.879.657.70.1330.1670.2140.2240.218图3-1原料粒度对青篙素提取回收率的影响Fig.3-1 Effect of grinding degree on extraction of Artemisinin原料青蒿素含量测定：采用索氏提取法，对原料进行平行测定，结果如表2-3所示。表3-3原料青蒿素含量测定提取时间(h)122448 平均 M0(mg/g)7.237.327.38 7.313.1.2 搅拌提取的单因素实验实验中分别对提取时间、温度、溶剂量及搅拌速度等因素的影响进行了研究。下述讨论中若无特别说明原料粒度为60目，提取时间均为2h，提取温度均为50，溶剂量为60mL，搅拌速度为800r/min。提取时间对提取率的影响：不同提取时间结果如表2-4所示。提取开始随时间的延长，提取率显著上升，提取时间在2h达到最高。此后，时间增加，提取率无显著增加。这可能是由于青蒿素中具有对热不稳定的过氧基团，而长时间的加温搅拌可能会导致青蒿素的缓慢分解。 表3-4提取时间的影响提取时间(min)提取量M(mg/g)提取收率E(%)吸光值A1530601201802402.283.515.245.995.845.7031.248.071.781.979.978.00.1180.1550.2210.2380.2260.224图3-2 提取时间对青蒿素的提取的影响Fig.3-2 Effect of extraction time on extraction of Artemisinin温度对提取率的影响：分别以不同温度提取2h，提取结果如表2-5。可见温度上升到一定高度时，提取率开始下降，原因是由于高温导致青蒿素的分解，提取温度控制在50比较适宜。表3-5温度的影响温度（） 提取量M(mg/g)提取收率E(%)吸光值A303540455055601.912.653.565.065.874.853.7526.136.348.769.280.366.448.80.0850.1170.1430.2140.2410.2120.147图3-3提取温度对青篙素提取的影响Fig.3-3 effect of extraction temperature on extraction of Artemisinin溶剂量对提取率的影响：分别加入不同体积石油醚50提取2h，结果如表2-6所示 。经过预实验证明，每1g青蒿粉样提取过程中可吸收12mL溶剂左右。在实际分离提取过程中，提取残渣中的溶剂需采用压滤等方法进一步回收。显然，在溶剂量从20mL增加到60mL时，提取回收率增加很快，超过60mL以后则变化很慢。表3-6溶剂量的影响溶剂量(min)提取量M(mg/g)提取收率E(%)吸光值A204060801201603.274.285.875.895.905.9144.758.680.380.680.780.90.1550.1930.2360.2370.2400.242图3-4 溶剂量对青蒿素提取的影响Fig.3-4 effect of extraction solvent quantity on extraction of Artemisinin搅拌速度对提取率的影响：实验条件：青篙原料1g，原料粒度选择80目，溶剂量为60mL，温度恒定为50，提取时间为2h，考察搅拌对青篙素提取的影响，进行实验。得到结果如表2-7所示。表3-7搅拌速度的影响搅拌速度 （r/min）提取量 M(mg/g)提取收率E(%)吸光值A020040060080010000.912.764.285.075.926.0312.537.858.669.481.080.20.0780.1680.1960.2110.2310.226图 3-5 搅拌速度对青蒿素提取的影响Fig.3-5 Effect of stirring speed on extraction of Artemisinin显然，搅拌速度对提取率有显著影响，实验条件下搅拌速度以800r/min为宜。在实验操作中应从经济性综合考虑选择合适的搅拌速度。3.1.3 不同方法提取产物比较表2-8对不同提取方法得到提取产物紫外扫描结果进行了比较 。同标准样品比较，搅拌提取较索氏提取、室温冷浸提取产品含杂质量少。这主要是由于强烈的搅拌有效地增加了青蒿素在提取溶剂中的传质速率，大大缩短了提取时间，减少其他成分溶出的机会。表3-8不同溶剂提取物紫外扫描结果提取方法波长nm/吸收峰值对照品冷浸提取搅拌提取索氏提取渗滤204/0.039202/0.3183202/0.3183204/0.7358211/1.1364 217/0.0399208/0.3088208/0.3088210/0.7154215/1.1550 292/0.2805 220/0.3211 292/0.500 220/0.3211 292/0.500 220/0.6166 292/0.6462 226/1.1085 292/0.61153.1.4 结语对乙醚、氯仿、正己烷、石油醚（30-60）为溶剂搅拌提取青蒿素研究表明，石油醚是青蒿素提取较适宜的溶剂。对石油醚提取青蒿素的工艺条件进行了较系统研究，较适宜的提取条件为原料粒度60目，提取时间2h，提取温度50，溶剂量60mL（1g原料），搅拌速度800r/min。本实验结果可为改进现有青蒿素石油醚提取工艺提供一些依据。在提取时间120min，提取温度50，搅拌速