体内药物分析概述PPT课件.pptx

1 体内药物分析BiopharmaceuticalAnalysis BiomedicalAnalysis 2 乳酸左氧氟沙星 0 1g 片 用法用量 口服 成人常用量 支气管感染 肺部感染 一次2片 一日2次 或一次1片 一日3次 疗程7 14日 急性单纯性下尿路感染 一次1片 一日2次 疗程5 7日 复杂性尿路感染 一次2片 一日2次 或一次1片 一日3次 疗程10 14日 细菌性前列腺炎 一次2片 一日2次 疗程6周 0 3 0 4g 日 0 2g 日 0 4g 日 3 抗菌药物的抗菌活性 药物抑制或者杀灭病原菌的能力最低抑菌浓度 minimuminhibitoryconcentration 抑制培养基内细菌生长的最低浓度 MIC最低杀菌浓度 minimumbactericidalconcentration 杀灭培养基内99 9 的微生物 MBC喹诺酮类药物对致病菌的杀菌作用取决于药物血药浓度的峰浓度 即药物浓度越高 杀菌作用越强 浓度依赖性时间依赖性 杀菌活性与药物浓度维持在MIC以上时间的长短有关 内酰胺类 林可霉素类等抗生素 4 乳酸左氧氟沙星 0 1g 片 用法用量 口服 成人常用量 支气管感染 肺部感染 药物随着血液到各个组织急性单纯性下尿路感染 药物通过尿液排泄在下尿路发挥治疗作用细菌性前列腺炎 药物随着血液到前列腺组织 0 3 0 4g 日 0 2g 日 0 4g 日 测定血液 尿液甚至组织中的药物浓度 5 1 1体内药物分析的定义 体内样品 生物体液 器官或组织 中药物及其代谢产物或内源性生物活性物质的定性 定量分析 体内样品 确定分析对象药物 代谢产物 内源性生物活性物质 确定待分析物定性 定量分析 如何选择分析手段 建立方法并验证 1 概述 6 体内 药物 分析 成分复杂干扰众多浓度很低高灵敏度高选择性的方法 7 1 2体内药物分析对象和待测物特点 成分复杂 干扰众多生物基质的干扰 蛋白质 糖 脂肪 离子 其他药物的干扰 卡马西平治疗癫痫的有效血药浓度为3 8 g ml 潜在中毒浓度为12 g ml 病人可能之前用过其他抗癫痫药物如丙戊酸钠 乙琥胺等 代谢产物与原型药物互相干扰 抗抑郁药米氮平 DMR 8 OHM N O MRT 方法选择性要高 8 体内药物分析对象和待测物特点 采样量小 浓度很低常见的生物样品采样量少 特定条件采集 不易重新获得血浆 人1 3ml 犬1 5ml 大鼠0 3 0 5ml浓度为ng ml g ml数量级 血液 血浆 血清 全血 尿液 唾液 胆汁 乳汁 脑脊液等均匀生物样品心 肝 脾 肺 肾 脑等非均匀生物样品 方法灵敏度要高 9 1 3体内药物分析方法的特点 对分析方法的要求高 满足灵敏度及专属性的要求样品需要经过前处理 才能分析分析工作量大 方法验证要求严格 测试数据处理和结果阐明较为复杂 1 概述 10 1 4体内药物分析的任务 定性分析 药物代谢产物 内源性物质是什么定量分析 血浆 组织 尿液药物及代谢物浓度药物代谢与动力学 drugmetabolismandpharmacokinetics DMPK 研究 新药研发治疗药物监测 TherapeuticDrugMonitoring TDM 临床应用内源性物质检测 疾病标志物社会事件中的分析 食品安全 法医毒物分析等 1 概述 11 体内药物分析的任务 DMPK 药代动力学研究涉及药物在体内的吸收 分布 代谢与排泄等动态过程 需要研究血药 组织浓度 时间曲线的变化 探讨药物分布与药理作用的关系 1 2 Stability Solubility3 Passive ActiveTrans 4 Pgpefflux CYP3A45 Hepaticfirstpasseffect 12 药物代谢与动力学 血药浓度 时间曲线尿药累积排泄曲线生物等效性评价绝对生物利用度相对生物利用度代谢途径代谢酶 13 体内药物分析的任务 TDM TDM即测定血液中或其它体液中药物浓度 观察临床药物反应 考察药物治疗效果 必要时根据药动学原理调整给药方案 方向是实现个体化给药 目的为临床合理用药服务 达到最佳的药物治疗效果 14 治疗药物监测 抗癫痫药苯妥英钠血药浓度与药理作用及毒性反应 患者女性 25岁 因癫痫强直阵挛性发作入院 遂静脉注射负荷剂量苯妥英钠800mg并开始口服维持剂量250mg d 测得苯妥英钠的浓度为3 6 g ml 医生考虑到尚未达到治疗浓度范围 故增加剂量到400mg d 患者出现痉挛等类似癫痫发作症状 测得血药浓度为10 9 g ml 医生拟打算再次增加剂量 患者白蛋白为20g L 正常范围是34 48g L 于是建议检查患者游离苯妥英钠浓度 结果显示游离苯妥英钠浓度为4 9 g ml 游离药物治疗浓度范围1 2 g ml 判定患者苯妥英钠中毒 建议降低剂量为250mg d 15 体内药物分析的任务 内源性物质检测 体内内源性物质如氨基酸 激素 儿茶酚胺 肌酐 草酸 尿酸等 机体正常生理条件或机体发生病变 测定体内内源性物质或疾病标志物的含量 疾病的辅助诊断或及早预防 药物 中药 代谢组学研究 16 体内药物分析的中心任务 体内药物分析方法学研究生物样品预处理方法分离分析实验条件的优化选择考察体内分析方法的灵敏度 专属性 准确度 线性范围等为临床药理学 临床药学等相关学科提供专一 灵敏 准确 快速 简便的体内药物分析方法 17 2 1体内样品的种类与采集 血液 血浆 血清 全血 尿液 唾液 胆汁 乳汁 脑脊液等均匀生物样品心 肝 脾 肺 肾 脑等非均匀生物样品样品选取原则 1 必须是能够反映出浓度与药物效应之间关系 2 易于获得 3 便于处理 适合于分析 4 根据不同目的与要求进行选取 2 体内样品的种类 采集与贮存 18 体内样品种类与采集 血液 自然凝结 加抗凝剂 离心 离心 全血 上层 血清serum 比血浆少纤维蛋白原 40 下层 血细胞 凝块 上层 血浆plasma 50 下层 血细胞 血样Blood 一般在给药后的不同时间点采集血样 19 体内样品种类与采集 尿样Urine特点 尿药浓度通常变化较大 尿药大多呈结合状态 优点 易得 且样品量多 正常尿液仅含微量蛋白 缺点 尿液是一种良好的细菌培养基 尿液中多具有紫外吸收的化合物 一般在给药后的不同时间段收集尿样 20 体内样品种类与采集 唾液Saliva优点 非伤害性采样 且不受时间地点限制 缺点1 唾液药浓一般低于血浆药浓 某些药物的唾液药浓 S 与血浆游离药浓 UP 十分接近 但两者相关系数不明确 pH改变会影响弱酸性和弱碱性药物在唾液中的药物浓度 一般自然采集或刺激采集 量少 21 体内样品的种类与采集 组织tissue指各种体内脏器 需要对其进行均匀化制备 使之成匀浆溶液反应药物在脏器的分布与蓄积情况头发hair取样方便 可以获得长期的用药史信息前处理复杂 需要排除头发表面的各种干扰 22 2 2体内样品贮存与处理 室温放置时间短期保存温度与时间长期保存温度与时间 20 40 80 分装保存 便于测定去活性保存 防止酶降解 保存温度与时间由什么决定 2 体内样品的种类 采集与贮存 23 研究维生素C泡腾片进入人体后血药浓度 时间曲线变化 通过测定给药后人血浆中维生素C实现 问 采集血样之后如何保存 维生素C的性质 维生素C容易氧化 因此采集血样后加入抗氧剂保存 24 3 1体内药物分析的一般流程 血样尿液唾液胆汁组织器官 前处理方法分离纯化浓集 样品测定方法建立方法优化 方法学研究灵敏度准确度精密度线性和范围耐用性 灵敏 准确 快速 简便 3 体内药物分析方法的建立与评价 25 新药临床药物代谢动力学评价 新药I期临床试验阶段中进行药物在健康志愿者体内药物代谢动力学 探讨药物在体内吸收 分布和消除的特点 为II期临床实验的给药方案制定提供伦理依据 研究内容包括健康受试者单次与多次给药的药物代谢动力学研究 饮食的影响 代谢产物的代谢动力学研究 药物 药物的代谢动力学相互作用研究等 体内药物分析方法是关键 26 人血浆中普卢利沙星活性代谢产物NM394的检测 羧基 酸性基团 哌嗪环 碱性 水溶性增加 共轭结构 27 分析方法建立 分析待测物 NM394分析目标 建立分析方法可以专属 灵敏 准确的检测出血浆中NM394HPLC法 分离分析选择内标化合物 准确定量选择前处理方法 消除干扰 提高检测浓度 28 分析方法的建立 色谱条件及优化 体外方法的建立色谱柱 DiamonsilC18柱 5 m 200mm 4 6mmi d 保护柱 DiamonsilTMODS流动相 乙腈 0 5 三乙胺 磷酸调pH3 0 为21 79流速 1ml min荧光检测 ex 280nm em 425nm柱温 30 内标化合物为洛美沙星 结构类似 性质相近 29 分析方法的建立 样品前处理 分析方法的优化必须考虑生物样品的前处理的影响 30 3 2体内分析样品前处理 3 2 1生物样品前处理的目的纯化药物 消除干扰净化满足检测灵敏度的要求富集减少对分析仪器的污染改善分析环境除非生物样品基质不会干扰检测 也不会污染仪器 同时还有较好的灵敏度 3 体内药物分析方法的建立与评价 31 示例 血液中酒精的检测 直接测定 顶空气相色谱火焰离子化检测器进行检测0 2ml全血和0 5ml内标放到小瓶后迅速封口小瓶被放到顶空进样器上自动加热获得气液两相平衡将液上气体注入GC分析 32 3 2 2蛋白沉淀proteinprecipitationPPT 测定血样时用 去除蛋白质 使结合的药物释放出来有机溶剂沉淀法 甲醇 乙腈 中性盐析法 饱和硫酸铵 强酸沉淀法 高氯酸 使蛋白变性后除去 33 蛋白沉淀过程示意图 ABCD A血浆样品200 lB加入甲醇600 lC涡旋混合3min后D10000rpm离心10min后 34 34 常用蛋白沉淀剂的用量及沉淀蛋白的百分率 样品浑浊 妨碍准确测定 35 蛋白沉淀应用特点 确定沉淀剂与血浆的最佳比例稀释倍数满足检测灵敏度的要求尽可能多沉淀蛋白 减少对仪器的污染适合浓度较高的血样处理过程快速 适合不稳定的药物测定 36 3 2 3液液萃取liquid liquidextractionLLE 常选择与水不混溶的有机溶剂 根据药物在水中与有机溶剂中的溶解度不同而将目标药物和干扰物质分开 随后浓缩含有目标药物的有机层 体液中内源性物质多为极性成分药物多为亲脂性弱酸或弱碱 37 液液萃取示意图 取1ml血浆置具塞玻璃离心管中 精密加入5ml乙酸乙酯提取溶剂 充分涡旋混合3min 38 液液萃取示意图 4000rpm离心10min后 准确取出上层有机溶剂置另一干净具塞玻璃离心管 置N2下水浴挥干溶剂残留物用流动相溶解离心后进样HPLC分析 便于纯化与富集 39 液液萃取应用特点 确定合适的萃取溶剂依据相似相溶原则正己烷 乙醚 乙酸乙酯 正丁醇极性增大有机相 水相 1 1 5 1 40 示例 尿液中甲基苯丙胺与苯丙胺的检测 液液萃取 取尿液2ml 置于5ml离心管中 加入5ml乙醚 涡旋 离心 取乙醚层置另一5ml离心管中 60度水浴氮气流下挥干取尿液2ml 置于5ml离心管中 加入100 l0 1mol lNaOH 混匀后加入5ml乙醚 涡旋 离心 取乙醚层置另一5ml离心管中 60度水浴氮气流下挥干 甲基苯丙胺 冰毒 苯丙胺 41 液液萃取应用特点 调节水相pH值水相pH值主要由药物的pKa确定碱性药物最佳pH值要高于pKa值1 2个pH单位酸性药物则要低1 2个pH单位 pKa9 9 pKa10 1 酸化 0 1mol lHCl碱化 0 1mol lNaOH 42 3 2 4 固相萃取solid phaseextractionSPE 根据色谱理论发展的一种前处理方式将具有吸附 分配或离子交换性质的担体作为萃取剂填入小柱 溶剂淋洗活化后 将生物样品通过小柱 使其药物或杂质保留在担体上 选择一种溶剂洗去杂质 再用适当溶剂将药物洗脱下来 常用担体 疏水性的C18化学键合硅胶等 43 固相萃取基本操作 固定相C18 先甲醇润湿小柱再用水除去多余甲醇 1 活化 44 固相萃取基本操作 1 活化2 上样 液体样品 内源性物质 其他外源性物质 待测药物 45 固相萃取基本操作 1 活化2 上样 3 淋洗 选择不同极性溶剂依次为 水 由低到高比例的甲醇 内源性物质 其他外源性物质 待测药物 淋洗溶剂 46 固相萃取基本操作 1 活化2 上样 3 淋洗 淋洗的目的 除去生物样品的干扰 待测药物仍然保留在SPE柱上 内源性物质 其他外源性物质 待测药物 淋洗溶剂 47 固相萃取基本操作 1 活化2 上样 3 淋洗 4 洗脱 100 甲醇为洗脱剂 内源性物质 其他外源性物质 待测药物 淋洗溶剂 洗脱溶剂 48 固相萃取基本操作 收集洗脱液 其中含有待测药物 直接进样分析浓缩后进样分析 待测药物 洗脱溶剂 1 活化2 上样 3 淋洗 4 洗脱 49 固相萃取基本操作 内源性物质 其他外源性物质 待测药物 淋洗溶剂 洗脱溶剂 活化 上样 淋洗 洗脱 50 固相萃取应用特点 根据药物性质选择适合的柱填料 以提高提取回收率处理速度快 具有一定通量 较容易自动化或联用 51 3 2 5其他处理方式 固体样品均匀化处理组织样品 按照1 4 w v 用生理盐水或缓冲液进行匀浆 匀浆前剪碎组织粪便样品 低温烘干后 取样品研碎 用适当溶剂萃取 超声 注意保证取样均一 52 52 3 2 5其他处理方式 缀合物的水解药物或者其代谢产物与体内内源性物质结合生成的产物称为缀合物 常见葡萄糖醛酸苷缀合物和硫酸酯缀合物缀合物较原型药物具有较大的极性 有机溶剂不易提取 常用酸水解 酶水解的方法使药物释放出 53 血浆中NM394的样品前处理 液液萃取 有一定水溶性 提取溶剂中需要加入一些极性溶剂蛋白沉淀 完全可以固相萃取 完全可以 本实验研究选择蛋白沉淀为前处理方法 200 l血浆 50 l内标溶液 100 l10 高氯酸溶液 涡旋混匀3min 10000rpm离心10min 上清液取出二次离心10000rpm10min 上清液20 l进样HPLC分析 考察不同蛋白沉淀剂对方法专属性的影响 和对绝对回收率的影响 决定的检测灵敏度 54 3 3体内样品分析方法学验证 特异性标准曲线与定量范围定量下限精密度与准确度稳定性提取回收率分析过程质量控制超限样品处理 3 体内药物分析方法的建立与评价 专属性标准曲线与定量范围定量限 检测限精密度与准确度耐用性 质量标准分析方法验证内容 体内样品分析方法学验证内容 概念相似方法不同 55 血浆中NM394检测的特异性 内标 NM394 内源性物质是否有干扰 未知代谢物是否有干扰 与色谱分析方法有关与前处理方法有关 56 血浆中NM394检测的提取回收率 提取回收率又叫绝对回收率 指从生物样品中回收得到待测物的响应值与标准物质产生的响应值的比值 180 l血浆 20 l1 g ml对照品溶液 200 l标准添加血浆0 1 g ml前处理 50 l内标溶液 100 l10 高氯酸溶液沉淀浓度0 1 0 2 0 35 分子上的响应值 流动相配制浓度为0 1 0 2 0 35的对照品溶液 分母上的响应值 57 血浆中NM394检测的提取回收率 评价分析方法将体内样品中的待测物从生物基质中提取出来的能力 提取回收率高 检测灵敏度就高要求在不同浓度上 具有较为接近的提取回收率即可 58 血浆中NM394的线性范围 定量下限 采用内标工作曲线法定量配制