组织工程2015.ppt

组织工程TissueEngineering 何留民Email jnu lmhe 学历新加坡国立大学联合培养博士 2007 2008 中山大学博士高分子化学与物理 2006 2009 郑州大学学士高分子材料与工程 2000 2004 工作经历2012 2014香港大学香江学者2009 至今暨南大学副研究员2008 2009新加坡国立大学研究员研究方向生物医用材料 组织工程 药物载体 纳米医学在神经再生中的应用 参考书目 1 B O 帕尔森 S N 巴蒂亚组织工程科学出版社2 柏树令 顾晓松 张传森组织工程学教程人民军医出版社3 姚康德 尹玉姬组织工程相关生物材料化学工业出版社 学习方式 课堂学习学术讲座实验课程 8 13周 评分方式 平时成绩 30 考试 70 主要学习内容 组织工程学概述生物支架材料种子细胞与培养组织工程的免疫学基础组织工程产品与临床应用组织工程动物实验技术 组织工程概述 何谓组织工程 为何要发展组织工程 如何进行组织工程 WHAT WHY HOW 何谓组织工程 最早由美籍华人学者冯元祯 Y C Feng 教授提出 组织工程学 WHAT Feng Y C 1987年美国国家科学基金会根据冯教授的建议 正式采用 组织工程学 这一术语来描述这一新兴的领域 并正式建立了这门新学科 组织工程学 定义 应用生命科学与工程学的原理与技术 在正确认识哺乳动物正常及病理两种状态下组织结构与功能关系的基础上 研究和开发用于修复 维护 促进人体各种组织或器官损伤后功能和形态的生物替代物的一门新兴学科 组织工程 在2000年5月美国 时代 杂志中被列为未来十大热门工作的榜首 组织工程的多学科交叉特点 材料科学 细胞生物学 化学 生物 流体力学 结构力学 表面物理 高分子 干细胞 发育 信号转导 组织工程 生物学家 利用已知的对动物胚胎发育成组织 器官的研究成果所获取的经验知识 进行组织器官的体外再生 材料学家 对人体组织的材料学特性进行详尽的研究 了解其关键的参数和性质 以此为基础 设计组织替代物 保证其材料学特性与人类自体组织完全相同 关于组织工程 关于组织工程 工程师 研究人体组织的力学特性 然后利用这些特殊性质设计一个有限元的数学模型 预测组织器官如何随年龄及其它条件变化 外科医生 寻找一类新的生物大分子或细胞表型 通过外科手术植入到组织损伤部位 使不能自然愈合的损伤再生或加速其愈合过程 分子生物学家 通过对人类基因组计划的研究或其它途径 了解人类的全部基因信息 并找出那些控制组织形成和再生的基因序列 然后将其引入到原代细胞 进而形成可以制造组织的细胞系 圣葛斯默和丹米安奇迹般地治愈了腿的移植 MasterofLosBalbases 约在1495年 狗腿子 的故事 传说中的 组织工程学 组织工程主要是致力于组织和器官的再生与形成 利用生命科学和材料科学的进步 在一个模仿组织与器官形状的材料中种入细胞 使细胞依照模型来长成新的组织与器官 以供修复人体的组织或器官缺损 核心 建立由细胞和生物材料构成的三维复合体 尝试人造耳 中国青年学者曹谊林教授于1996年在世界上第一个成功地在裸鼠背上培养制成了人形耳廓软骨支架 因而获得美国整形外科最高荣誉巴莱脱勃朗奖 组织工程的科学目标 在细胞水平和分子水平构建具有生命力的生物体 也即组织和器官的形成和再生 组织工程的应用目标 组织工程的应用目标是提高人体健康 长寿和生命的质量 组织工程的直接目标则是从形态 结构和功能上对组织 器官功能障碍或丧失进行永久性地置换和替代 组织工程远期目标 建立具备与人体自身组织 器官相同生命功能的组织工程产品生产基地 使各类组织缺损 病变和器官衰竭患者能随时在组织工程产品的 超级市场 购买所需要的 产品 为何要发展组织工程 组织 器官的丧失或功能障碍是人类健康所面临的主要危害之一 也是人类疾病和死亡的主要原因 WHY 美国每年有数以百万计的人发生各种组织或器官的功能障碍或丧失 需进行800万人次手术修复 年耗超过400亿美元 由于移植物来源有限 只有不足2 的患者能及时治疗 组织工程产品需求 假肢年销售额50 100亿人工关节2亿 年 Zimmer公司2000套 获利5000万 烧伤植皮几百万 年骨 软骨300万 年关节置换100万例 年晚期肾病6 12万例 年 年花费 150亿肾透析70170人次 肾移植2000人次人均年透析治疗费用3万美元 目前美国组织工程产品市场8亿美元主要为组织工程皮肤 组织工程骨 软骨类产品 我国是人口大国 形势更加严峻 因创伤和疾病造成的组织 器官丧失或功能障碍病例据世界各国之首 传统器官修复途径 加定义 自体组织移植拆东墙补西墙 以伤养伤异体组织移植免疫反应 供体严重不足人工代用品异物反应 癌变 致畸 需修复的器官 组织 可供移植的器官 组织 供需矛盾尖锐 于是 应运而生 组织工程 组织工程的优点 对病损组织进行形态 结构和功能的重建 可永久性替代 可进行大块组织缺损的修复 可对组织器官缺损进行完美的形态修复 其他 组织工程 人类组织和器官的制造业 组织工程科学意义 不但可以从细胞水平和分子水平认识生命的本质 而且能够从整体上优化生命的质量 并把握生命的进程 同时组织工程研究理论体系和研究方法不仅是针对哺乳类动物 而且可拓展到植物上去 这对于促进农业 工业和军事科学的发展都将有着不可估量的深远意义 组织工程科学意义 多学科交叉的边缘学科特点 除了具有生物力学 生物材料学和细胞与分子生物学三大学科支撑外 融汇了生物信息 生物化学工程 遗传学及工程 生物电子学及计算机的原理和方法 组织工程的研究 必将促进相关高技术产业的交叉 渗透和发展 同时还可以演化或衍生出新的高技术产业 组织工程将是21世纪最具有潜力的高技术产业 必将产生巨大的社会效益和经济效益 组织工程研究 历史与现状 Vacanti Langer 1986 开始相关研究美国国家科学基金委员会 1987 提出组织工程概念1988年起 美国开始资助建立了一系列实验室至今累计投资 10亿 年增长20 建立四个国家级组织工程研究中心欧洲 英国 德国 1998 500亿欧元用于肝脏 1000亿用于心脏 公开招标亚洲 日本 韩国 新加坡 已经起步 组织工程研究机构 美国已有相当数量的研究机构 NASA DOE NIH等 大学包括 MIT HMS GIT UCSD UMAS等 公司 Sandoz 0rganogenesis AdvancedTissue等 参与了组织工程 发展迅猛 在许多方面取得了重大进展 组织工程研究领域 骨组织工程软骨组织工程皮肤组织工程神经组织工程肝脏组织工程心脏血管组织工程肌腱组织工程其它组织工程 脂肪 尿道 膀胱等 我国组织工程发展 上海 1997年上海成立我国第一个组织工程实验室 上海组织工程研究重点实验室 2005年5月成立组织工程国家工程研究中心 广东省 2001年广东省在全国率先成立了人体组织工程学的学术团体 广东省人体生物组织工程学会 1999获国家重点基础研究项目 973计划 专项资助 2003年 863计划 项目 如何进行组织工程 基本方法 将体外培养的高浓度组织细胞 扩增后吸附于一种生物相容性良好 并可被人体逐步降解吸收的细胞外基质 ECM 上 使细胞按预制形态的三维支架生长 然后将这种细胞生物材料复合体植入机体病损部位 在生物支架降解吸收过程中 种植的细胞继续增生繁殖 形成了新的具有其原来特殊功能和形态的相应组织和器官 HOW 组织工程三要素 支架凝胶泡沫纤维 讯息因子生长因子细胞外基质蛋白 细胞成体细胞干细胞基因工程细胞 细胞的家 组织再生关键 所罗门之钥 组织工程器官 组织工程用生物材料 生物材料在组织工程主要是构成支架 起着为细胞的生长 增殖提供适宜环境的作用 因此为了保证组织细胞按预定设计形状要求生长增殖 最终长成所需的组织或器官 组织工程用生物材料必须具备特殊性能 生物材料 概念 1987年10月 巴黎 国际标准化组织规定 以医用为目的 用于和活体组织接触且具有功能的无生命材料 生物材料 分类 体内植入材料 包括组织工程材料 半体内应用材料 接触镜 人工肾 体外应用材料 生物传感器 医疗器械 要求 优良的生物相容性 符合机体环境的生物特性以及物理 化学性质 生物相容性 血液相容性组织相容性生物惰性 基本性能 支架材料的性能要求 组织工程支架研究重点 生物相容性力学性能降解速率及体内吸收速度三维空间结构的要求及形成表面形貌特征营养物质的提供代谢废物的排除生物活性位点 材料的理化性质 支架形貌与结构 组织工程支架性能 构建技术 生物相容性 生物相容性是影响大多数生物医用材料在临床应用的主要问题 作为组织工程细胞支架的生物材料不但要求优良的生物相容性 而且还要求良好的细胞亲和性 不会引起细胞变性 生物医用材料的生物相容性技材料接触人体部位不同一般分为两类 若材料用于心血管系统与血液直接接触 主要考察与血液的相互作用 称为血液相容性 若与心血管系统外的组织和器官接触 主要考察与组织的相互作用 称为组织相容性或一般生物相容性 从广义上讲 植人体内的各种医用材料和装置都首先要求具有优良的组织相容性 接触人体部位 生物相容性的检测方法 一是通过体外试验揭示材料与组织之间的反应性质 即在离体试验中 常利用对基因 细胞 血液及蛋白质等各种生理物质进行观察分析 了解材料与组织的反应关系 二是进行体内试验 目的是为了进一步对材料处于动态时的生物学行为进行生物相容性检测 力学性能 组织工程细胞支架用的三维空间结构应具有一定的力学性能 以保证在细胞增殖 形成组织器官的过程中承受在机体中的正常应力 其中对作为硬组织修复用组织工程支架的强度 模量要求 以及对软组织修复用支架的韧性 弹性要求 是目前影响支架得以应用的主要因素 降解与吸收 组织工程支架在机体内的降解及吸收速度应与细胞的增殖速度以及组织的修复速度相匹配 基于不同组织 不同程度损伤及缺陷的组织修复需要不同的时间 因此要求具有不同降解速度的多种生物降解材料以适应不同组织修复的需要 生物降解高分子在组成 分子量 分子量分布等方面可以在一定程度上进行调节 人体组织愈合时间 皮肤组织3 10天被膜组织1 2 1月内脏损伤1 2月硬组织3 6月大器官 半年 合适的生物降解性 降解产物无毒降解速率可调降级过程中 材料与组织有较好的亲和性降解液pH值 生物降解材料基础 降解的基本概念与类型降解机制与过程降解与吸收的研究方法生物降解材料的安全评价 降解的基本概念与类型 基本概念 降解 高分子主链断裂 分子量逐渐变小 以致最终成为单体或者代谢成二氧化碳和水的化学过程 生物降解 酶进入聚合物的活性位置并渗透至聚合物的作用点后 使聚合物发生水解 从而使聚合物的分子骨架发生断裂 成为小的链段 并最终断裂成稳定的小分子产物 完降解的过程 生物可降解与生物可吸收 生物降解 完全生物降解生物破坏不包括非酶性水解和物理性溶解 但在医用材料中包括水解 生物可吸收 指通过生物降解或水解 溶解而在体内通过代谢而消失的材料 生物降解 但不一定可吸收可吸收 一般要生物降解 也有例外PEG 降解吸收机制 物理 应力化学 水解 氧化及酸碱作用生化 酶和微生物由于植入体内的材料主要接触组织和体液 因此水解和酶解是主要的降解机制 一般而言 体内有酶解作用 体内降解快于体外降解 但如果酶在降解过程中不起作用除外 PLGA多通道神经导管 体外降解 1W 4W 12W 体内移植8W 降解 化学键 分子间力 侧链切断 转化为水溶性高分子交联点切断 恢复为未交联高分子主链切断 无规降解 拉链式 范得华力库仑力 降解方式 本体水解 表面蚀解 外形保持不变 结构逐渐变松 分子量和力学性能下降在先 质量损失滞后 分子量和质量同时下降 水解 PLGA多通道神经导管体外降解 酶解 聚合物降解早期就有酶的参与 酶促水解 单纯水解的聚合物水解后生成低分子量的聚合物片断可能需要酶作用转化为小分子代谢产物 酶促水解 一些认为是非降解的聚合物如尼龙人工血管 聚氨酯导管在体内有明显的降解作用 酶促氧化 影响降解的因素 材料 化学结构 构型 形态 分子量 形状 杂质植入部位的环境因素 体液 酶物理因素 外应力 消毒方法 保存历史 降解速率的调控 亲水性比表面积和多孔结构加工工艺 降解吸收评价方法 生物材料的分类及性能 按工程化组织应用性质来分类 1 结构类如皮肤取代物 软骨和骨的取代物等 大都采用生物降解聚合物做为支架 2 代谢类 3 细胞类体细胞经离体扩增 增殖和纯化后植人体内 按来源分类 天然高分子 如明胶 胶原 海藻酸盐 甲壳素等合成高分子 如聚乳酸 聚乙醇酸 乳酸 乙醇酸共聚物 乳酸 己内酯共聚物 聚原酸酯 聚磷酸酯 聚酸酐等天然高分子同合成高分子的复合物 如脱水胶原 聚乙醇酸的复合物等有机材料和无机材料的复合物 如羟基磷灰石 甲壳素的复合物 羟基磷灰石 聚乳酸的复合物 天然组织支架材料 天然蛋白质类材料天然多糖类材料天然无机物 胶原蛋白 让你约会十年前 下一節 蛋白質純化鹽溶及鹽析 胶原蛋白在细胞的位置 胶原蛋白 纤网蛋白 细胞膜 细胞外液 细胞骨架微丝 肌动蛋白 细胞质 多糖分子 糖类分子 蛋白多醣分子 核心蛋白 整合蛋白 蛋白多糖复合体 整合蛋白 胶原蛋白的分布 人体正常骨骼中含有80 的胶原蛋白 其功能主要是将钙 磷 矿物质等成分黏着 然后构成骨质 在皮肤中则有约70 的胶原蛋白 以50公斤的成人为例 胶原蛋白在体内就占了约3公斤 分布在骨 皮肤 血管壁 肌腱 韧带 肌肉 软骨 角膜等 胶原也是结缔组织的主要蛋白成分 在一些组织中含量非常高 某些组织中胶原蛋白的含量 组织含量 骨 矿物质除外 88 0跟腱86 0皮肤71 9角膜68 1软骨46 63韧带17 0主动脉12 24肝3 9 胶原蛋白种类 到目前为止 已发现的动物胶原蛋白可分成21种型式 依组织不同而有不同的胶原蛋白 有不同基因编码 I II III V XI型为有横纹的纤维结构 其中以I型胶原蛋白的含量最多 约占全部胶原蛋白含量的90 也是用途最广的胶原蛋白 胶原组成 一级结构 每链1050个氨基酸 富含脯氨酸和羟脯氨酸二级结构 螺旋结构高级结构 由三条 肽链相互拧成1个三股螺旋状结构的蛋白质分子其分子量为30万左右 交联 由侧向相邻的lys 赖氨酸 或hyl 羟赖氨酸 残基氧化后所产生的两个醛基间进行缩合而成 交联后后形成不溶性纤维 原胶原呈阶梯状排列 电镜下可见间隔67nm的横纹 婴幼儿的胶原交联程度低而易于抽提 老年人胶原交联程度高 组织僵硬老化 制备来源 牛和猪的肌腱 生皮 骨骼是生产胶原的主要原料 由各种物种和肌体组织制备的胶原差异很小 生产 医用胶原制备的主要目的是除去组织中的非胶原成分和抗原物质 获得高纯度的胶原肽 胶原纤维或胶原组织 胶原在应用时必须交联 以控制其物理性质和生物可吸收性 同时也必须考虑所用交联方法的强度 稳定性 毒性 趋钙化以及抗酶降解性能等 特点 优点 胶原材料具有生物力学性能好 免疫原性低等优点 被制造成为各种生物医学材料 在医疗器械产品制造领域有着不可替代的优势和相当广泛的应用 缺点 要通过对实际生产过程的严格控制才能达到动物源性胶原的人用标准 胶原的性质 生物降解 生理化学性能 生物学性能 胶原生理作用 结构蛋白 在人体 约占蛋白质总量的1 3 主要功能是组织的支持物 其他功能 生物的生长 发育 细胞的分化和黏附 抗原抗体结合反应 胶原蛋白制品降解速率较快 必须进行改性物理交联 高能辐射 紫外辐射 干热处理化学交联 常用交联剂是一些双或多官能度化合物 醛 铬酸 碳二亚胺 亚胺酸酯等胶原基复合材料 胶原改性 胶原应用 胶原蛋白是一种具有良好生物学特性和弱的抗原性 生物降解性和止血性的材料 人工心脏瓣膜 前景展望 胶原材料应用范围极其广泛 优势明显 我国在对胶原类医疗器械产品的检验评价方面也日趋完善 如不久前又增添了对免疫原性检测的要求 但当前国内对胶原类生物医用材料免疫原性的研究很少 并且对于此类产品的免疫原性尚无标准评价方法 这一点仍需要我们继续不断地摸索与探究 明胶是水溶性蛋白质混合物 皮肤 韧带 肌腱中的胶原经酸或碱部分水解或在水中煮沸而产生 无色或微黄透明的脆片或粗粉状 在35 40 水中溶胀形成凝胶 含水为自重5 10倍 是营养不完全蛋白质 缺乏某些必需氨基酸 尤其是色氨酸 广泛用于食品和制作黏合剂 感光底片 滤光片等 明胶 化学组成 明胶不是一种单一物质 其主要成分为氨基酸组成相同而分子量分布很宽的多肽混合物 20000 250000 在明胶分子中 5中常见的氨基酸为 甘氨酸26 4 30 5 脯氨酸14 8 18 羟基脯氨酸13 3 14 5 谷氨酸11 1 11 7 丙氨酸8 6 11 3 明胶是一种无脂肪的高蛋白 且不含胆固醇 是一种天然营养型的食品增稠剂 食用后既不会使人发胖 也不会导致体力下降 明胶还是一种强有力的保护胶体 乳化力强 进入胃后能抑制牛奶 豆浆等蛋白质因胃酸作用而引起的凝聚作用 从而有利于食物消化 明胶通常用来制作果冻和其它甜点 由煮过的动物骨头 皮肤和筋腱制成的 据报道 全世界的明胶有60 以上用于食品糖果工业 结构 胶原蛋白分子分离和断裂方式 理化性质 商用明胶呈粗颗粒 粉末或薄片状 易脆 淡黄色 密度1 3 1 4 凝胶化溶解性酸碱性粘度 0 5 以上的明胶溶液冷至35 40 即粘度增加形成凝胶 明胶可溶于水 多元醇的水性溶液以及极性大可以形成氢键的有机溶剂 明胶的酸碱性是由水解产生的氨基和羧基决定的 明胶的粘度与浓度 温度 分子量 pH值 添加剂和杂质有关 在等电点粘度最小 7 溶涨 明胶是一种有效的保护胶体 可以阻止晶体或粒子的聚集 用以稳定非均相悬浮液 加入盐 硫酸钠 形成凝胶层 加入反离子聚合物 如阿拉伯胶 发生凝聚 微囊化 在等电点溶胀性最小 低于等电点 阴离子可以控制溶胀 高于等电点 阳离子影响溶胀 5 胶体和乳化性质 6 凝聚 制备和加工 酸法 碱法 A型明胶 来源于猪皮 B型明胶来源于骨头 猪浸渍皮 洗脱异物 酸溶胀 较高温度萃取4 5次 过滤 减压蒸馏浓缩 冷却 干燥 研磨 应用 食用明胶可用于医用软硬胶囊 外科敷料 止血海棉 肉冻 食品添加剂 罐头 糖果 冰糕 火腿肠 皮冻 汽水悬浮剂 检剂 淀剂 雪糕等食品行业等 执行国家标准GB6783 94 药用明胶主要用于软硬胶囊 片剂糖衣的原材料 工业明胶主要用于胶合板 纱布 砂石 印刷 粘合剂等 广泛用于纺织 印刷 印染 塑料 电子 国防 航空 砂布砂纸 火柴 墨 橡胶填料 工艺品粘贴 木器家具 皮革上光 染织上浆 冶金镀液 纸钞涂质 化妆发胶 等工业和部门中 其中有用于提取水解动物蛋白质的低粘度低灰份的工业明胶还有专用于饲料添加剂的工业明胶 天然蛋白质类材料 纤维蛋白来源 纤维蛋白原 一种血浆蛋白 凝血酶作用凝固而成纤维蛋白亲水基团更多 生理条件下溶解性好 化学改性 放射性碘化法 甲基化 接枝 固定酶 纤维蛋白主要来源于血浆蛋白 因此具有明显的血液和组织相容性 无毒副作用和其他不良影响 作为止血剂 创伤愈合剂和可降解生物材料在临床上已经应用很久 它的主要生理功能为止血 另外还可明显促进创伤的愈合 还可作为一种骨架 促进细胞的生长 并具有一定的杀菌作用 血浆中的纤维蛋白原在凝血酶和血小板因子的作用下 变成网状固体的纤维蛋白 纤维蛋白是人体里的 水泥 它会很快地凝固 凝成一根根又细长又长的纤维 这些纤维再相互交错 重叠 终于堵住了 决口 使血液不再往外流了 过了几天 伤口就凝结成了坚硬的痂皮 纤维蛋白的应用形式 纤维蛋白原就地凝固 用于眼科手术的组织粘合剂 肺切除后胸腔填充物和外科手术中的止血 纤维蛋白粉末 用作止血剂 可以与抗菌素共用 用作充填慢性骨炎和骨髓炎手术后的骨缺损 纤维蛋白海绵 用作止血剂 扁平瘢的治疗和唾液腺外科手术后的填充物 组织代用品 商品名Bioplast 主要用于关节成型术 视网膜脱离 眼外科治疗 肝脏止血及疝气修复等 纤维蛋白薄膜 用于神经外科 替代硬脑膜和保护末梢神经缝线 用于烧伤治疗 消除颌面窦和口腔间的穿孔 纤维蛋白凝胶在肌组织形成中的应用纤维蛋白胶 成肌细胞混合注射纤维蛋白胶作为三维支架培养细胞纤维蛋白凝胶在骨 软骨组织形成中的应用需要与其他材料复合提高机械强度纤维蛋白凝胶在上皮组织形成中的应用纤维蛋白凝胶中的ECM成分可以调节角化细胞的生长 显著提高上皮细胞的克隆率 纤维蛋白凝胶能提高皮片移植的成活百分比 尤其在定点移植 有效止血 降低细菌感染 与纤维结合蛋白联合还可以支持角质化细胞和成纤维细胞在体内外的生长 提高伤口细胞活力 并作为外源性生长因子的传递系统加速伤口 天然多糖类材料 甲壳素及其衍生物概述源自 虾 蟹 昆虫 真菌和藻类简史 1811年被发现1887年确立了基本结构1977年召开第一届国际会议 甲壳素及其衍生物结构 生产 首先用稀的氢氧化钠液除去蛋白质 然后 用盐酸除去钙盐 剩下的就是几丁质 为了从这些几丁质中除去乙酰基 用长时间的高温 使之在浓的氢氧化钠中发生反应 就可制成含有氨基的甲壳质 几丁聚糖或壳糖胺 因为几丁质不溶于酸碱 也不溶于水 很难被人体利用 经脱乙酰基成几丁聚糖后它能溶于稀酸和体液中 可被人体所利用 壳聚糖 壳聚糖为甲壳素的脱乙酰衍生物 由甲壳素在40 50 浓度的氢氧化钠水溶液中110 120 下水解2 4h得到 壳聚糖在碱性条件下存在大量氢键 体系收缩 药物通透率低 表现为 关 酸性条件下成盐 由于同种电荷的相互排斥 聚合物网络扩张 药物通透率高 表现为 开 因此具有pH刺激响应性 可作为智能型药物控制释放材料使用 壳聚糖接枝丙烯酸在酸性条件下存在大量氢键 体系收缩 药物通透率低 表现为 关 在碱性条件下成盐 离子性基团解离 由于同种电荷的相互排斥 聚合物网络扩张 药物通透率高 表现为 开 因此具有pH刺激响应性 可作为智能型药物控制释放材料使用 甲壳素及其衍生物理化性能甲壳素白色片状或粉状固体 常温时稳定氢键作用强 结晶度高 高度难溶 只溶于浓酸和某些溶剂 甲壳素及其衍生物理化性能壳聚糖白色片状或粉状固体 常温时稳定可溶于稀酸 甲酸 乙酸 但也不溶于水和绝大多数有机溶剂性能更活泼 可通过氨基和羟基改性 生物活性 壳聚糖一般只有很小的异物排斥反应不引起慢性反应 无大量纤维组织增生可加速移植物与正常组织融合 甲壳素及其衍生物降解 甲壳素溶菌酶作用下降解 糖蛋白形式吸收壳聚糖溶菌酶的催化水解速度 随脱乙酰化程度增高而降低 甲壳素及其衍生物组织工程支架材料中的应用 临床可吸收缝线 人工皮肤软骨组织神经修复 治疗外伤 创伤 甲壳素 壳聚糖等产品生物相容性好 且具有止血 止痛 抑菌 促进肉芽组织和上皮组织的形成等作用 是外伤 创伤治疗的理想产品 甲壳质缝线 天然多糖类材料 是一种酸性粘多糖 1934年美国哥伦比亚大学眼科教授Meyer等首先从牛眼玻璃体中分离出该物质 透明质酸以其独特的分子结构和理化性质在机体内显示出多种重要的生理功能 如润滑关节 调节血管壁的通透性 调节蛋白质 水电解质扩散及运转 促进创伤愈合等 尤为重要的是 透明质酸具有特殊的保水作用 是目前发现的自然界中保湿性最好的物质 被称为理想的天然保湿因子 Naturalmoisturizingfactor NMF 例如 2 的纯透明质酸水溶液能牢固地保持98 水分 透明质酸 透明质酸结构 透明质酸理化性能白色无定形固体 无臭无味溶于水 不溶于有机溶剂有极强的吸湿性 可吸收和保持其自身重量上千倍的水 透明质酸生物学特性理想的生理填充材料在组织生成 创伤愈合 肿瘤入侵好调节细胞功能等方面有诸多方面具有重要的生理作用降解 极易发生 透明质酸改性 制不溶性凝胶和膜材料用二乙烯基砜作交联用醛作交联用多官能团的环氧基作交联 透明质酸在组织工程支架材料中的应用 眼科手术关节病治疗组织修复 天然无机物 天然珊瑚 概述主要成分 碳酸钙具有类似骨骼的多孔结构种类 滨珊瑚 角孔珊瑚 角蜂巢珊瑚 叶状珊瑚 石芝珊瑚 鹿角珊瑚 天然珊瑚组织工程中的应用 骨组织水热法将珊瑚制成羟基磷灰石珊瑚复合材料 人骨形成蛋白与珊瑚复合 合成组织支架材料 聚乳酸 聚羟基乙酸及其共聚物聚酸酐聚羟基丁酸酯聚原酸酯聚膦腈其他合成材料 聚乳酸 聚羟基乙酸及其共聚物 制备 聚乙醇酸Poly glycolicacid PGA 结构性质高结晶度33 55 高熔点220 225 C较低玻璃化温度35 40 C溶解性能差 只溶于高氟化有机溶剂强的力学性能 自20世纪30年代以来 从著名高分子化学家Corothers开始 人们对PGA的研究就未停止过 PGA合成 直接缩聚 工艺路线较简单 分子量低 两步法 单体纯度高和高真空 合成路线冗长 工艺复杂 产率低 成本高 PGA的生物降解性 PGA在体内的降解不需要特殊酶的参与 主要是水解 降解产物可被体内吸收代谢 最终通过尿液和呼吸排除体外 PGA降解速率较快 PGA羟基乙酸乙醛酸甘氨酸丝氨酸丙酮酸乙酰CoA柠檬酸二氧化碳和水 草酸 尿 二氧化碳 PGA熔融纺丝纤维降解行为 0W 1W 2W 4W PGA在降解过程中 首先从非结晶区开始 第二阶段晶态区降解 PGA共聚改性 由于PGA结晶度较高 熔点较高 在一定程度上影响加工 并且PGA降解较慢 影响了应用领域的扩大 同时 人们为了在PGA链节上引入其他官能团 扩大PGA的应用范围 因此 聚乙醇酸共聚物的研究日益受到重视 共聚物的范围也从最初的共聚酯扩展到与聚醚 氨基酸 聚磷酸酯的共聚 聚乳酸Poly lacticacid PLA PLA合成 PLA 丙交酯开环聚合催化剂 阳离子聚合催化剂质子酸 路易斯酸 烷基化试剂等 如羧酸 对甲苯磺酸 阴离子聚合催化剂烷基锂 碱金属烷氧基化合物等 丁基锂 醇钠 醇钾 配位聚合催化剂过渡金属烷 氧 基化合物 羧酸盐等 锡盐类 氯化锡 氧化锡 辛酸亚锡 有机铝化合物 异丙基铝稀土化合物 PLA基本性能 性能力学性能 与结晶性有很大关系降解性能 本体降解 酶催化 自催化 降解速度的影响因素 改性研究主要问题亲水性不理想 不利于细胞黏附 生长和分化分子链中缺乏活性基团降解产物偏酸性 可导致非特异无菌性炎症反应机械强度不足 改性研究提高材料的亲水性和细胞黏附性物理方法 提高表面粗糙度 涂层化学方法 LA与GA 己内酯等共聚采用亲水性引发剂与功能单体共聚 改性研究降低无菌性炎症反应临床约有8 的反应率原因 引起局部组织pH下降加入碱性物质 碳酸钙 碳酸钠 碳酸氢钙和羟基磷灰石等 改性研究提高材料机械强度与羟基磷灰石等复合 应用 药物控制释放骨折内固定材料组织工程形状记忆材料 粉碎性骨折的包覆 指对已经赋形的高聚物在一定的条件下 如加热 光照 改变酸碱度 磁场等 实施变形 将这种变形状态保存下来 当聚合物再进行加热 光照或者改变酸碱度等刺激的时候 聚合物又可以恢复到其原来的赋形状态 形状记忆聚合物Shapememorypolymer 聚合物的形状记忆效应 形状记忆聚合物的结构由记忆起始形状的固定相和随温度变化能可逆地固化和软化的可逆相组成 固定相一般为具有交联结构的无定型区 也可以是Tm和Tg较高的一相在较低温度时形成的物理缠结 血管用的PLA形状记忆材料 性质 良好的生物相容性 生物可降解性能 无毒 对细胞无损害 有助于组织的重 一定的力学强度等适用范围 通过微创腹腔手术植入体积较大的植入物 手术缝合线的自动打结 可降解的SMP在医学上的应用 手术缝合线用PLA类材料 聚乳酸 乙醇酸共聚物 PLGA 通过控制LA GA的比例合成系列不同无规共聚物 Tg小于PLA 大于PGA 降解速率快于两种均聚物 可调控 共聚物可溶于一般的有机溶剂 GA含量越高溶解性能越差 PLGA膜体内降解时间 PLGA多孔支架体外降解中形貌和结构的变化 a 0w b 8w c 10w PLGA85 15 PLGA65 35 PLGA55 45 a 0w b 4w c 10w a 0w b 2w c 4w 2w 0w 85 15 75 25 65 35 55 45 体外降解外观变化 PLGA多通道神经导管体外降解 1W 4W 12W 0W 1W 4W 聚己内酯polycaprolactone PCL 常规的催化剂是Sn oct 2 反应温度140 170 熔融本体聚合 根据聚合条件的改变 分子量可从几千到几十万 lewis和其它有机酸也可作为催化剂 但合成的PCL分子量分布较宽 阳离子聚合 稀土络合物也可作为催化剂 特点是PCL分子量分布窄 可合成超高分子量的PCL PCL合成条件 CL纯化 在CaH2下减压分馏 收集在装有干燥分子筛的容器中反应瓶150 预先干燥18h 然后在充满干燥氮气的手套箱中冷却 反应温度140 150 时间18 24h产物用二氯甲烷溶解 过量甲醇沉淀链控制剂一般为水 伯醇 胺以及其它一些含有活泼氢的化合物 线性高分子可用官能度为1或2的醇如正十二烷醇或1 6 己二醇 枝状高分子可用官能度大于2的醇如季戊四醇 三羟甲基丙烷以及各种糖等制得 PCL性质 PCL半结晶的聚合物 Tm 60 结晶度45 Tg 60 良好的通透性和柔韧性 断裂伸长率300 600 良好的热稳定性 分解温度350 良好的加工型和力学性能生物降解性 泥土中微生物作用下降解 在空气重降解很慢 形状记忆特性 PCL形状记忆材料在矫形外固定 骨折绷带 癌症放射治疗时的定位等 PCL PDS形状记忆缝合线 PCL b PLLA PCL的环境降解 表面蚀解 PCL单丝泥土包埋降解 10m长 地面10cm深 丝状真菌是生物降解的主要原因 泥土包埋前 包埋后1month 包埋后2months 聚磷酸酯 polyphosphoesters PPEs 聚磷酸酯是分子骨架上连有磷酸酯键 类似于生物大分子比如核酸和磷壁质酸的高分子材料 比如多聚磷酸酯 polyphosphate 聚膦酸酯 polyphosphonates 和亚磷酸盐 polyphosphites MPO3 M2HPO3 M4P2O5 等 统称为聚磷酸酯polyphosphoester PPE 它具有结构多样性 生物可降解性 良好的生物相容性及在生理条件下的可酶解性 因而它在药理和生理上得到广泛的应用 由于分子链中存在有5价的磷原子 这就允许具有生物活性的分子连接到链上 从而增加了改变聚合物物理化学性质的自由度 同时也改变了分子链的骨架结构 如图所示 可以改变R和R 从而在宽的范围内改变PPEs的物理化学性质 聚磷酸酯近来主要用于基因传递 genedelivery 和组织工程 tissueengineering 中生长因子的控制释放方面 MajorstagesofDNAdeliveryintothecellandintracellulartransport 聚 有机 磷腈poly organo phosphazenes 聚磷腈是一类由N P原子通过单 双键交替连接的具有无机主链的聚合物 通过侧链衍生化引入性能各异的有机基团可以得到理化性质变化很广的高分子材料 其生物相容性好 具有生物降解性 R基团可以是烷氧基 芳氧基 氨基 烷基 杂环 无机和有机金属单元 其它聚酯 聚醚酯 1 4 二氧杂环己烷 2 酮 1 5 二氧杂环庚烷 2 酮DXO 1 4 6 三氧杂螺 4 4 壬烷 支架 细胞的家 什么样的家才是细胞的理想家园 为什么细胞需要一个家 人类是由一个胚胎细胞不断地分裂 成长 分化而成 共同功能的细胞组成组织 不同群的组织形成有特殊功能且结构复杂的器官 而器官连接形成系统 各种系统的整合运作使生理机能发挥效果 如此构成一个完整的身体 想让细胞长成我们所预期的器官构造 如果缺乏细胞的立足点 也就是作为细胞生长温床的 支架 是一件不可能完成的任务 组织工程是依循人体组织生长发育的模式 利用特殊的生物高分子材料建构出三维空间的立体框架 让植入的细胞可以在其中生长并增生 提供近似体内的生长环境和营养给未完全分化的细胞 如干细胞 使这些细胞分裂 生长 及分化成具有特定功能的细胞 进而繁衍成所需的组织 甚至培养不同功能的组织 以形成具有特殊功能的器官 支架的功能不仅仅当作细胞生长的框架结构 更可以进一步地控制引导细胞朝特定的方向生长 分化 理想的组织工程支架材料的要求 良好的生物相容性 无毒 不致畸 利于种子细胞的黏附 增殖 降解产物无毒 无炎症反应 良好的生物降解性 完全降解 降解速率与组织细胞生长速率相适应 降解时间可认为调控 具有三维多孔结构 材料具有合适的孔径 高孔隙率 90 以上 较高的内比表面积 有利于细胞的黏附生长 血管和神经的长入 有利于新陈代谢 具有良好的可塑性 材料可预先制成一定的形状 具有一定的机械强度 良好的材料 细胞界面 利于细胞黏附 增殖 激活细胞特异基因表达 维持细胞正常表型表达 组织工程支架材料 支架构建 致孔剂致孔 形成气体的盐致孔水溶性致孔剂致孔冰晶致孔 PLLA三维海绵支架形貌 控制因素 致孔剂形状支架孔形貌致孔剂尺寸支架孔径致孔剂用量支架孔隙率 粒径 500 m粒径 500 m 不同大小NaCl颗粒为致孔剂的共混多孔支架形貌 热致相分离 A metastableregionB unstableregion 参数 溶液浓度 冷冻温度 冷冻时间和冷冻速率等 固 液相分离 PLLA 二氧六环 横截面 纵截面 溶剂 冰醋酸 二氧六环 PLGA 浓度 PLGA 二氧六环 温度 PLLA 二氧六环 30 C 80 C 196 C 小口径血管 温度 PLLA THF体系L L相分离制备纳米支架 相分离与半晶质聚合物结晶同时进行 温度 溶剂 PLLA 二氧六环 水 温度 溶剂 PDLLA 二氧六环 水 温度 溶剂 PLGA 二氧六环 水 乳液冷冻干燥 Polymer1995 36 837 42 超临界流体Supercriticalfluid SCF 液体 气体和超临界流体的比较 各种化学物质的临界压力 温度和密度 接近临界点时 压力或者温度的小变化会导致密度发生很大变化 因此使得超临界流体的许多特性可以被 精细调整 超临界流体适合作为工业和实验室过程中的溶剂 而且可以取代许多有机溶剂 超临界流体技术制备组织工程支架 超临界流体发泡工艺图 无残留溶剂制备非晶相聚合物支架参数 压差 减压速率 SEMofthefoamedPEMA THFMAdiscshowingthenon porousouterskin SEMofoneofthefoamsfollowingremovaloftheouterskin 组织工程纳米支架 不同层次的组织工程 组织工程应该在宏观 超细胞 100 m和细胞 10 m 微观 亚细胞0 1 10 m 和纳观 0 1 m 尺度同时进行 因此 要构建仿生的支架 也必须在宏观 微观和纳观各个层次进行 纳米尺度的重要性 体内ECM是三维纳米纤维结构 ECM中存在纳米尺度的孔 纤维和隆起 此外 细胞表面受体为纳米结构 细胞表面功能结构域的尺度亦为纳米级 许多生物功能分子 ECM组分和细胞的相互作用都发生在纳米级别 即分子水平 发生在纳米尺度的这些相互作用直接影响细胞的行为与功能 从生物学的观点来看 几乎所有的人体组织和器官都具有纳米纤维的形式和结构 如骨骼 胶原质 软骨和皮肤等 可见 只有具有三维纳米纤维结构的支架才能最大限度地模仿天然ECM的结构 进而具备生物功能 实现与肌体组织的完全整合 因此 仿生组织工程支架的设计与构建必须由纳米纤维来实现 纳米纤维优点 在结构上与天然ECM更接近 比表面积大 能提供大量的细胞接触点 为细胞的粘附 增殖 生理功能提供更好的微环境 并改善蛋白质吸附 也更有利于药物和生物因子的释放 因而被认为比传统的微米级支架更有利于细胞的粘附和生长 纳米纤维支架材料也存在尺寸效应和表面 界面 效应 这两个特性使纳米支架材料更能有效地诱导细胞生长和组织再生 因而在性能上与具有相同组成的微米级支架材料存在非常显著的差异 即存在生物纳米效应 纳米生物效应的存在 而且也为人们在分子水平研究材料与肌体组织的相互作用提供了平台 由此实现了在分子水平对植人材料的设计与制造 静电纺丝技术相分离自组装 纳米纤维支架制备技术 静电纺丝技术 静电纺丝装置图 静电纺丝基本过程 静电纺丝影响因素 同轴纺丝 无规Vs有序 静态水浴旋转电纺丝 动态水浴旋转电纺丝 神经导管小口径血管 相分离制备纳米纤维支架 2 5 wt v PLLA THF8 C 利用相分离技术制备纳米纤维支架的关键是聚合物溶液在相分离之后由于聚合物结晶而发生的凝胶化 5 PCL b PLLA 50 50 THF 40 C PLLA 二氧六环 水 5 W V PLLAin88 12dioxane water 5 W V PLLAinTHF 自组装技术制备纳米纤维支架 根据外界条件改变 两亲性的短肽分子 peptide amphiphilesmolecules PAs 可以自组装成片状 棒状 球状或者管状等不同的形状 细胞 组织再生的关键 获得数量充足 不会引起机体免疫排斥反应且具有再生活力的种子细胞是开展组织工程研究的前提和基础 组织工程种子细胞的要求 采用非侵入手段或微创手段即可获得 分裂增殖能力强 功能旺盛 无免疫排斥反应 能连续传代 并且传代培养后不发生形态 功能以及遗传物质的改变 组织工程种子细胞种类 干细胞 干细胞 stemcell Science将干细胞的研究评为1999年人类十大科学成就之首 干细胞的定义 干细胞 stemcell 是指具有无限或较长期的自我更新能力 并能产生至少一种高度分化子代细胞的细胞 根据这一定义 在个体发育的不同阶段以及成体的不同组织中均存在着干细胞 只是随着年龄的增长 干细胞的数量逐渐减少 其分化潜能也逐渐变窄 在干细胞的发育过程中 还有一种中间类型的细胞称为祖细胞 progenitorcells 祖细胞也具有有限的增殖和分化能力 与干细胞不同的是 祖细胞没有自我更新能力 它在经过几轮细胞分裂周期后产生的两个子代细胞均为终末分化细胞 terminaldifferentiatedcells 干细胞分裂 A 干细胞B 祖细胞C 分化细胞1 对称分裂2 非对称分裂3 祖细胞分裂4 终末分化细胞 干细胞 自我更新及分化多潜能 干细胞与组织工程 干细胞 stemcell 具有多能性 可以发育为多种细胞 存在于许多组织中 条件正确可能发育为较完整器官 可以避免通过克隆人产生器官 有些科学家仍持谨慎态度 干细胞分类 根据发生学来源分类 胚胎干细胞 embryonicstemcell ESC 和成体干细胞 somaticstemcell 根据分化潜能分类 全能干细胞 totipotentstemcell 多能干细胞 pluripotentstemcell 单能干细胞 unipotentstemcell 目前 已经从许多组织或器官中成功地分离出干细胞 其中包括 胚胎干细胞 造血干细胞 骨髓间充质干细胞 神经干细胞 肌肉干细胞 成骨干细胞 内胚层干细胞 视网膜干细胞及胰腺干细胞等 胚胎干细胞 EmbryonicStemCell ES 胚胎干细胞是指由胚胎内细胞团 innercellmass ICM 或原始生殖细胞 primordialgermcell PGC 经体外抑制培养而筛选出的细胞 胚胎干细胞还可以利用体细胞核转移 somaticcellnucleartransfer SCNT 技术来获得 胚胎干细胞具有发育全能性 在理论上可以诱导分化为机体中所有种类的细胞 胚胎干细胞在体外可以大量扩增 筛选 冻存和复苏而不会丧失其原有的特性 ES细胞的全能性指ES细胞在解除分化抑制的条件下能参与各种组织的发育的潜力 即ES细胞具有发育成完整动物体的能力 可以为细胞的遗传操作和细胞分化研究提供丰富的试验材料 ES细胞的多能性是指ES细胞具有发育成多种组织的能力 参与部分组织的形成 将ES细胞在特定培养基进行培养 可以定向分化成特定组织 ES细胞的全能性和多能性 ES面临的挑战 抗原性问题 可能存在致癌风险 定向分化控制仍不成熟 2006年7月19日 布什否决了国会通过的要求增加胚胎干细胞研究拨款的议案 这是布什5年半总统任期首次动用否决权 同年7月24日 欧盟25国负责科研的部长在布鲁塞尔开会决定 将继续资助欧盟科研人员有限度地开展人类干细胞研究 2009年3月9日 美国总统奥巴马在白宫签署行政命令 宣布解除对用联邦政府资金支持胚胎干细胞研究的限制 科学与伦理之争 成体干细胞 AdultStemCell ASC 成体干细胞是指存在于一种已经分化组织中的未分化细胞 这种细胞能够自我更新并且能够特化形成组成该类型组织的细胞 成体干细胞存在于机体的各种组织器官中 成年个体组织中的成体干细胞在正常情况下大多处于休眠状态 在病理状态或在外因诱导下可以表现出不同程度的再生和更新能力 ASC在人体可能的分布 ASC优点 容易获得供应充足可取自患者自身的干细胞无伦理学困扰无过多的学术争论 骨髓间充质干细胞 mesenchymalstemcell MSC 间充质干细胞 MSCs 是属于中胚层的一类多能干细胞 主要存在于结缔组织和器官间质中 以骨髓组织中含量最为丰富 由于骨髓是其主要来源 因此统称为 骨髓间充质干细胞 a ColonymorphologyofMSCs 100 b MSCshadafusiformandspindle shapedappearance 200 早期分离培养时 其外观呈成纤维细胞样而被称为 成纤维细胞集落形成单位 Colony formingunit fibroblastic CUF F MSC特点 具有强大的增殖能力和多向分化潜能 在适宜的体内或体外环境下不仅可分化为造血细胞 还具有分化为肌细胞 肝细胞 成骨细胞 软骨细胞 基质细胞等多种细胞的能力 具有免疫调节功能 通过细胞间的相互作用及产生细胞因子抑制T细胞的增殖及其免疫反应 从而发挥免疫重建的功能 具有来源方便 易于分离 培养 扩增和纯化 多次传代扩增后仍具有干细胞特性 不存在免疫排斥的特性 MSC分化 MSC作为组织工程的种子细胞 MSC可取自自体骨髓 取材方便 由它诱导而来的组织在进行移植时不存在组织配型及免疫排斥等问题 因此可作为组织工程的种子细胞来修复各种病变和缺损组织 从而使得器官 组织的修复和重建成为可能 目前使用较多的方法是先用体外培养扩增后的MSC与支架材料复合制备成细胞 材料复合体 然后再植入缺损部位 MSC应用存在的问题 分离MSC有效成分的方法尚不稳定 MSC特异性的表面标记尚不清楚 在体外扩增 定向分化的条件尚不成熟 骨髓中间充质干细胞的数量极少 成人骨髓平均10万个有核细胞中含有1个 且随着年龄的增加 细胞数量逐渐减少 神经干细胞 Neuralstemcells 近年的一些研究表明 成年哺乳动物的脑组织仍可不断产生新的神经元 成人脑组织中的NSC主要是在侧脑室下层 SVZ 和海马齿状回两处 以往认为 中枢神经系统的神经元在出生前或出生后不久 就失去再生能力 1992年 Reynodls等从成年小鼠脑纹状体中分离出能在体外不断分裂增殖 且具有多种分化潜能的细胞群 并正式提出了神经干细胞的概念 从而打破了认为神经细胞不能再生的传统理论 Mckay于1997年在 Science 杂