miR155调控HGAL的表达和增加淋巴瘤细胞的运动概述.ppt

miR 155调控HGAL的表达和增加淋巴瘤细胞的运动 汇报人 摘要 HGAL是弥漫性大B淋巴瘤和霍金斯淋巴瘤的病人的预后指标 前言 HGAL 淋巴生发中心特殊基因 至少通过2个分子机制参与了淋巴细胞和淋巴瘤细胞运动的负调控 一是直接结合到肌动蛋白和肌球蛋白上 二是激活RhoA信号通路 但它本身的调控机制还不清楚 miRNA 小的非编码RNA 在转录后调控基因表达参与调控多种的生命活动 他们参与免疫系统的调控可能对淋巴细胞引起的恶性肿瘤的发病有作用 方法 寻找miRNA靶基因和结合位点RNA分离和miRNA定量PCR real timePCR DNA构建荧光素酶报告实验趋化实验RhoApull downassay 结果 miRNA155抑制HGAL的表达 蛋白水平的检测 A 在Raji MC116 和VAL细胞系中转染高表达hsa miR 15548小时后用Westernblot检测HGAL蛋白表达水平 Actin水平作为内参 从图中可以看出3个细胞系转染了miR 155后 跟对照比相比 HGAL蛋白表达量都有降低 miRNA155抑制HGAL的表达 mRNA水平的检测 B Raji细胞系中转染高表达hsa miR 155通过real timePCR在转染24 48 和72小时后检测HGALmRNA水平 结果 从图中可以看出 在转染hsa miR 15572小时后HGALmRNA的降低水平大到最大 miRNA155抑制HGAL的表达 mRNA水平的检测 C MC116细胞系中转染高表达hsa miR 155通过real timePCR在转染24 48 和72小时后检测HGALmRNA水平 结果 从图中可以看出 在转染hsa miR 15548小时后HGALmRNA的降低水平大到最大 MiR 155直接作用于HGALmRNA的3 UTR上 D HeLa细胞系中 野生型和3 UTR突变HGAL融合双荧光素酶报告基因 黑柱代表共转染hsa mir 155与报告基因与3 UTR突变 或 灰柱表表共转染hsa mir 155随机突变载体与报告基因 从图中可以看出miR 155可能结合位点 突变后荧光素活性没有恢复 突变后荧光素活性恢复 结果 说明了miR 155转录后调控HGAL的表达是通过与HGAL 3 UTR上的M2结合位点 MiRNA155增加淋巴瘤细胞的运动性 结果 说明了MiRNA155增加淋巴瘤细胞的运动性 我们探索了miR 155对Raji VAL和MC116淋巴瘤细胞SDF 1和IL 6趋化运动的影响 和对照组相比 转染了hsa miR 155显著减少了HGAL蛋白表达 加强了SDF 1 诱导的的淋巴瘤细胞趋化运动 MiRNA155增加淋巴瘤细胞的运动性 结果 从图上的结果可以看出MiRNA155增加淋巴瘤细胞的运动性 Raji细胞接种到fibronectincoated6 wellplates板上 转染hsa mir 155或nontargeted对照组48小时后实时图像一小时内每2分钟拍一次的运动途径 C 在每个处理组中50的细胞平均速度 miR 155对RhoA活性的影响 结果 A Raji Val 和sudhl6淋巴瘤细胞实验前无血清培养饥饿8小时 然后用LPA 1 5 克 毫升 处理45秒 转染hsa mir 155或nontargeting48小时后 细胞裂解用Westernblot检测TotalRhoA的表达 和rhoapull down检测RhoA GTP的水平和检测HGAL的表达 从图上可以看出在Raji SUDHL6 和VAL淋巴瘤细胞中转染了hsa miR 155没有对总RhoA蛋白表达水平产生影响 说明了RhoA蛋白不是miR 155的直接靶标 miR 155对F actin的聚合的作用 结果 B Raji Val 和sudhl6淋巴瘤细胞实验前无血清培养饥饿8小时 然后处理或不处理45秒LPA 1 5 克 毫升 处理45秒 转染hsa mir 155或nontargeting48小时后 固定后用Alexa 488鬼笔环肽后的染色后用流式细胞仪分析 通过增加RhoA活性 HGAL同样作用于RhoA的下游效应物 下调应力纤维的形成和激动蛋白的聚合 miR 155对F actin的聚合的作用 结果 图4 bic miR 155 小鼠脾B细胞趋化性实验 bic miR 155 或对照组小鼠脾B细胞用于SDF 1和IL 6的趋化实验 从图中可以看出 miR 155并没有增加小鼠脾B细胞的运动性 这与体外培养的人属淋巴瘤细胞的结果是相反了 说明了在鼠科中 miR 155及M17 HGAL人属 的作用机制还有待进步一步的研究 miR 155上调RTKN2的表达 结果 图5A在RajiVAL 和MC116细胞系中转染hsa mir 15548小时后用Westernblot检测RTKN2和肌球蛋白轻链蛋白表达水平 Actin作为内参 从图中可以看出 转染了hsa mir 155后 RTKN2的表达减少但肌球蛋白轻链蛋白的表达没有影响 说明了RTKN2是miR 155在RhoA信号通路中的靶位点 miR 155对RTKN2的调控是直接的 结果 在HeLa细胞中共转染与野生型或rtkn23 UTR突变融合双荧光素酶报告质粒与hsa miR 155 黑柱代表共转染了hsa miR 155 灰柱代表共转染与nontargeting对照 在假定的结合位点的突变命名为M1和M2的3 UTR和两个位点同时突变为M1 2 从图中可以看出共转染hsa miR 155与荧光素质粒到HeLa细胞中 荧光素活性减少60 对M1进行突变后 荧光素活性恢复75 对M2突变后 活性增加了80 对两个位点都进行突变 活性全部恢复 结果 这些结果说明了miR 155通过作用于HGAL和RTKN2增加了淋巴瘤细胞的运动性 讨论 免疫应答中miR 155有活跃的作用 在GC淋巴细胞分化过程中B细胞受体或是NFkB可以上调miR 155和PRDM1的表达 导致HGAL蛋白表达的下降 增