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本科生基因工程实验论文指导教师 王郑 苏慧敏学 生 王大伟专 业 生物科学年 级 2012级2015 年 8 月 10 日 碱性磷酸酶基因表达载体的构建及在大肠杆菌中的表达 内蒙古大学生命科学学院生物系本科生基因工程实验论文 碱性磷酸酶基因表达载体的构建及在大肠杆菌中的表达 刘帆 01011017 生物科学 摘要碱性磷酸酶广泛分布于人体各脏器器官中这种酶能催化核酸分子脱掉5磷酸基团从而使DNA或RNA片段的5-P末端转换成5-OH末端。碱性磷酸酶在酶联免疫等生化检测中有重要作用是许多生化反应试剂盒的检测酶。从大肠杆菌提取的碱性磷酸酶成本低热稳定性好而且能用基因方法实现蛋白质定向标记等。本文主要介绍利用基因工程实验技术操作碱性磷酸激酶基因将已经连接在pMD19-T载体上的碱性磷酸激酶酶源基因用PCR扩增出837bp的碱性磷酸激酶的基因片段与T载体连接后导入感受态的DH5菌中筛选鉴定。用双酶切切下碱性磷酸激酶的成熟基因片段插入带有6个组氨酸标签的原核表达载体pET-his导入 BL(21)DE3感受态菌中诱导表达碱性磷酸激酶蛋白质用SDS-PAGE鉴定。 关键词碱性磷酸酶 基因表达 载体 大肠杆菌 SDS-PAGE Construction and Expression of Alkaline Phosphatase Expression Vector in E.coli ABSTRACTAlkaline phosphatase is a widely distributed in human organs in various organs , the enzyme catalyzes the nucleic acid molecule off the 5 phosphate group , so that the DNA or RNA fragments of the 5-P terminal converts 5-OH ends . Alkaline phosphatase in ELISA and other biochemical detection plays an important role in many biochemical reactions kit detection enzymes. Extracted from E. coli alkaline phosphatase , low cost, good thermal stability, but also can be used genetic methods to achieve protein orientation markings.Main of this article describe the gene engineering operation in BAP gene which has already connected with pMD-1-T vector amplified by PCR in which can get 837bp nattokinase gene fragments ,then liBAPing with T vector that transform it into DH5 bacteria which were screened after identification. The mature peptide can be cutted by double-digested and insert with six histidine-tagged prokaryotic expression vector pET-his. At last, induced the protein expression of nattokinase in the expression of E.coli BL (21) DE3. Eventually , identify that by SDS-PAGE. KEYWORDS: Bacterial alkaline phosphatase , gene expression, vectorE. coli, SDS-PAGE 内蒙古大学生命科学学院生物系本科生基因工程实验论文 目 录 引言 . 1 材料与方法 . 1材料 . 1.1试剂、仪器及实验用具 . 1.2菌种 . 1.3质粒 . 1.4常用溶液的配制 . 2方法 . 2.1引物的设计 . 2.2 碱性磷酸激酶基因的PCR扩增 . 2.3 DH5a和BL21感受态的制备 . 2.4 pMD19-T-BAP的构建及转化和检测 . 2.5 pET-his及BAP的酶切和回收 . 2.6 pET-his-BAP的构建及转化和检测 . 2.7 pET-his-BAP的诱导表达 . 2.8 细菌碱性磷酸酶表达的SDS-PAGE检测 . 3结果与分析 . 3.1 碱性磷酸激酶基因的PCR扩增 . 3.2 pET-his的提取酶切及胶回收检验 . 3.3 pMD19-T-BAP的构建转化检测 . 3.4 pMD19-T-BAP的酶切 . 3.5 pMD19-T-BAP胶回收的结果 . 3.6 pET-his-BAP的构建及转化和检测 . 3.7 SDS-PAGE检测pET-his-BAP的表达 . 4讨论 . 参考文献 . 致谢 . 感想 . 内蒙古大学生命科学学院生物系本科生基因工程实验论文 引言: 碱性磷酸酶广泛分布于人体各脏器器官中其中以肝脏为最多其次为肾脏骨骼、肠、和胎盘等组织。这种酶能催化核酸分子脱掉5磷酸基团从而使DNA或RNA片段的5-P末端转换成5-OH末端。但它不是单一的酶而是一组同功酶。目前已发现有 AKP1 、AKP2 、AKP3 、AKP4 、AKP5 与 AKP6 六种同功酶。 细菌碱性磷酸酶是分子生物学的重要工具酶。在碱性条件下可以催化磷酸单脂水解生成无机磷酸。在ELISA过程中BAP常用作标记二抗的酶显色。 近年来国内外一些学者直接将BAP与抗体蛋白融合表达避免了酶标二抗的使用和交叉反应不仅在疾病诊断中有显著优势还可以检测与之融合的各种单链抗体的活性。 碱性磷酸酶在酶联免疫等生化检测中有重要作用是许多生化反应试剂盒的检测酶。目前国内市场引用的碱性磷酸酶都是从国外进口并且是有牛、猪肝脏提取价格昂贵且产量不高。从大肠杆菌提取的碱性磷酸酶成本低热稳定性好而且能用基因方法实现蛋白质定向标记等。 材料与方法 1.材料 1.1试剂、仪器及实验用具 1.1.1仪器 台式离心机旋涡混合器微量移液取样器气浴振荡摇床制冰机超净工作台微波炉和电磁炉电泳仪和电泳槽电子分析天平恒温水浴锅紫外分光光度计PCR仪三用紫外分析仪恒温细菌培养箱凝胶成像仪高压蒸汽灭菌锅。 1.1.2实验用具 超净工作台玻璃涂布棒酒精灯双面微量离心管架试管架记号笔,手表摇菌试管1.5mL离心管0.5mL微量离心管枪头010uL20200uL2001000uL100mL三角瓶250mL 三角瓶凝胶成像系统一次性薄膜手套等,0.2mLPCR微量管泡沫塑料保温盒培养皿琼脂糖凝胶电泳槽和梳子及其制胶模块, 垂直电泳槽及配套的玻璃板、夹子、密封条、梳子。 1.1.3试剂 LB 培养基 氨苄青霉素储存液 无菌ddwater 200mg/mLM/VIPTG 20%葡萄糖1.0mol/L Tris HCl pH8.8 0.5mol/L Tris HCl pH6.810%SDS内蒙古大学生命科学学院生物系本科生基因工程实验论文 30% Acr/Bis 10% Aps2上样缓冲液TEMED 低分子量蛋白分子量 Marker考马斯亮蓝染色液 5 X电泳缓冲液20%M/VIPTG2%M/VX-gal50 X TAE电泳缓冲液溴化乙锭储存液10加样缓冲液6加样缓冲液DNA分子量Marker电泳级琼脂糖粉Premix Taq 10mg/mL RNase ATE缓冲液95%和 70%乙醇EcoR I 和 BamH I 限制性内切酶10内切酶缓冲液0.1 mol/L CaCl2溶液T4 DNA连接酶连接酶缓冲液。 1.2菌种 带有 pET-his 质粒载体DH5菌,带有pMD19-T-BAP载体的DH5菌 E.coli DH5E.coli BL21由基因工程实验室提供。 1.3 质粒 表达载体pET-his 1.4 常用溶液的配制 1.4.1 氨苄青霉素储存液无菌水配制 100mg/mL分装后-20C保存。 1.4.2 LB 培养基胰化蛋白胨 10g酵母提取物 5gNaCl 10g加 200mL ddwater 搅拌完全溶解用约NaOH 调 pH 至 7.0加 dd water 至 1L分装4个200ml和2个100ml,121 20min 灭菌。使用时可加入氨苄青霉素终浓度100ug/mL。 1.4.3 溶液NaOH/SDS溶液0.2mol/L NaOH1%SDS,现用现配。 1.4.4 50TAE电泳缓冲液pH约8.5Tris碱242g,57.1ml冰乙酸37.2g Na2EDTA2H2Odd water 定容至1L。使用时稀释成1。 1.4.5 琼脂糖凝胶称取0.25g琼脂糖粉放入三角瓶加入25ml 1TAE 电泳 缓冲液注意原液是50按照1:49的比例稀释用保鲜膜盖住放入微波炉里内蒙古大学生命科学学院生物系本科生基因工程实验论文 烧开30 s取出观察若无颗粒则置于桌面上冷却至不烫手即可灌胶若仍然有颗 粒状物需要再继续加热直至无颗粒后冷却灌胶。 1.4.6 1.0mol/L Tris HCl pH8.8称取12.1g Tris碱, 加50mL蒸馏水缓慢地加浓盐酸至pH8.8约加 8mL。让溶液冷却至室温pH将会升高然后再调至 pH8.8加蒸馏水至 100mL。高温高压灭菌后 4保存。 1.4.7 0.5mol/L Tris HCl pH6.8称取 6.05g Tris 碱溶于 40mL 蒸馏水中加约 48mL 1mol/L HCl让溶液冷却至室温再用 HCl 调至 pH6.8加水稀释到 100mL 终体积。高温高压灭菌后 4保存。 1.4.8 30% Acr丙烯酰胺/BisN,N-亚甲基双丙烯酰胺30g Acr+0.8g Bis用 dd water定容至100mL4C棕色瓶避光保存现用现配。 1.4.9 10% Aps过硫酸铵蒸馏水配制-20保存。过硫酸铵会缓慢分解一周内使用完。 1.4.10 上样缓冲液0.5mol/L Tris HCl pH6.8 2mL甘油 2mL20% SDS 2mL0.1%溴酚蓝0.5mL-2-巯基乙醇1.0mLdd water 2.5mL室温存放。 1.4.11 电泳缓冲液Tris 7.5g 甘氨酸36gSDS2.5g加ddwater 至500mL。使用时稀释5倍。 1.4.12 考马斯亮蓝染色液考马斯亮蓝 R250 0.25g + 45mL 甲醇+10mL 冰醋酸用ddwater 定容至100mL 。 1.4.13 LB 平板培养基LB 培养基中含 1.2 %1.2g/100ml琼脂高压灭菌后加入氨苄青霉素至100g/mL每个培养皿中约 20mL 倒制平板。 2. 方法 2.1 设计引物 PCR引物 2.2 BAP基因的PCR扩增 2.2.1 由老师提供pMD-19-T-BAP质粒进行PCR扩增。 2.2.2 在 0.2mL PCR微量离心管中按下列剂量配制 50L 的PCR反应体系。 内蒙古大学生命科学学院生物系本科生基因工程实验论文 2.2.3 设置 PCR 仪的循环程序 94 3min 94 30s 58 30s 72 1min 72 10min PCR结束后取9l产物进行琼脂糖凝胶泳。 观察是否有预计分子量的主要产物带。 注退火温度: 58PCR3h。 2.3 DH5和BL21(DE3)感受态的制备 2.3.1 取2个1.5mL 预冷10 min的无菌微量离心管做上相应标记。 2.3.2 其中一管加入1.0mL BL21(DE3)菌液另外一管加1.0mL DH5菌液然后在冰上放置 10min 5000r/min 4 离心 10min弃上清。 2.3.3 加入 1ml 冰冷的 0.1 mol/L CaCl2溶液立即在涡旋混合器上混匀插入冰中静置 30min。 2.3.3 45000r/min 离心 10min。弃上清液后用 1mL 冰冷的 0.1 mol/L CaCl2溶液重悬菌体插入冰中放置 30min。 2.3.4 45000r/min 离心 10min。弃上清液后用 200uL 冰冷的 0.1 mol/L CaCl2溶液重悬菌体。 2.3.5 在超净工作台内将两种菌按50ul/管分装在1.5ml管内放于4冰箱待用。 2.4 pMD19-T-BAP的构建及转化和检测 2.4.1 PCR 产物(BAP)与pMD-19-T PCR 2.1载体直接连接 阳性PCR产物与pMD-19-T载体PCR 2.1连接。在离心管中加入 PCR体系 50L总 PCR Supermix 45L 模板质粒 1L已稀释50倍 Primer1 1L Primer2 1L dd water 2L 循环30次 内蒙古大学生命科学学院生物系本科生基因工程实验论文 在干式恒温气浴中16连接3 h。(实际操作时考虑到PCR产物浓度不高,故加了4L, 没有加水。) 2.4.2 感受态细菌的转化 2.4.2.1 将恒温水浴的温度调节到 42。 2.4.2.2 从4 冰箱中取出感受态菌冰浴7min。 2.4.2.3 取10 uL连接好的质粒与感受态细菌DH5a混匀在冰上放置20min。 2.4.2.4 于42水浴中90S进行热休克然后在冰中放置4 min在超净台上加入300uL LB培养基不含氨苄青霉素37振荡培养45 min。 2.4.2.5 超净台上取上述转化的混合液150L、200L于新的1.5ml的离心管中加入40L 20% x-gal7L 20% IPTG 混匀。 2.4.2.6 将上述菌液用涂布棒均匀的涂布在含Amp的LB固体培养基上37恒温培养过夜。 2.4.3 pMD-19-T-BAP的鉴定提取质粒使用tiangen试剂盒 2.4.3.1 观察菌落生长状态用10uL枪头挑取3个白菌落分别置于含1.7mL LB培养基中37摇菌培养8h。 2.4.3.2 分别取 1.4mL 的菌液于 1.5mL 离心管中12000r/min 离心1min弃上清。 2.4.3.3 柱平衡向吸附柱CP3吸附柱加入收集管中加入500l的平衡液BL,12000rmp离心1分钟倒掉收集管中的液体将吸附柱放回到收集管中。 2.4.3.4 将留有菌体沉淀的离心管加250ul 溶液 P1悬浮细胞沉淀。 2.4.3.5 再向离心管中加250ul溶液 P2温和上下翻转6-8次。 2.4.3.6 向离心管中加350ul溶液 P3温和上下翻转6-8次充分混匀此时将出现白色絮状沉淀12000r/min离心10min。 2.4.3.7 吸取上步中离心上清液并转移到吸附柱12000r/min离心1min弃滤液。 2.4.3.8 将吸附柱置回收集管中加500ul 去蛋白液12000r/min离心1min弃pMD-19-T连接反应体系 10L总 pMD-19-T vector 1L PCR 产物 3L dd water 1L Solution 1 5L 内蒙古大学生命科学学院生物系本科生基因工程实验论文 滤液。 2.4.3.9 将制备管置回离心管加600ul 漂洗液 PW12000r/min离心1min弃滤液。 2.4.3.10 重复上一步操作。 2.4.3.11将吸附柱移入收集管中12000r/min空柱离心2分钟。 2.4.3.12将吸附柱至于干净的离心管中向吸附膜的中间部位滴加60lEB室温放置2分钟12000r/min离心2min。 电泳检测以蓝菌落作对照电泳检测T4-BAP是否连接并转化成功。点样顺序为质粒3个蓝菌落11个白菌落。 2.5 pET-his、pMD19-T-BAP的酶切与回收 2.5.1 pET-his、plasmid双酶切 2.5.1.1 pET-his质粒 DNA双酶切体系 2.5.1.2 BAP质粒 DNA双酶切体系 2.5.2 pET-his、BAP胶回收 2.5.2.1 用 1TAE 和琼脂糖配制 1%回收胶。 2.5.2.2 从恒温水浴锅中取出酶切产物分别加入4uL的10 Loading Buffer终止反应并混匀。 2.5.2.3 pET-his胶回收点样顺序为pET-his空质粒pET-his大片段小样pET-his大片段大样pET-his大片段大样 pET-his质粒DNA双酶切体系 40L总 pET-his质粒 34L Quick Hind 1L Quick Hind 1L 10 Quick Buffer 4 L plasmid 质粒DNA双酶切体系 40L总 plasmid 34L Hind 1L BamH I 1L Buffer 4 L 内蒙古大学生命科学学院生物系本科生基因工程实验论文 BAP胶回收点样顺序为pET-his空质粒BAP的PCR 产物pMD19-T-BAP小片段小样pMD19-T-BAP小片段大样 2.5.2.4 电泳结束后用电话卡将含有大量酶切产物的泳道切下EB 染色含小样的胶块。在紫外灯下找到目的 DNA 带用刀片在目的 DNA带的下上下边缘各切一个小口作为标记。 2.5.2.5 将做好切口标记的凝胶与未染色的凝胶原位对齐根据小胶条上的切口标记估计未染色的胶块上大样的 DNA 酶切产物的位置。 2.5.2.6 用刀片切下大胶中 DNA 产物所在的凝胶尽量不要多余的凝胶分别转移至一个事先称量过的、灭活的 1.5mL 微量离心管中。再称量后计算出其中胶块的重量。 2.5.2.7 再用 EB 染色切除 DNA 以后的大胶与小胶条并在一起在紫外灯下检查是否已把 DNA 带切走。 2.5.2.8 按照 DNA 凝胶回收试剂盒的说明书操作回收 DNA 酶切产物。 2.5.2.8.1 向吸附柱CA2中加入500L 的BL12000r/min 1min 离心弃废液将吸附柱从新回收到收集管中。 2.5.2.8.2 将单一的目的DNA条带胶块的离心管中加入3倍体积的溶胶剂PN。 2.5.2.8.3 在50水浴锅中放置10 min中间隔2-3 min轻晃几次确保胶体完全融化没有胶体颗粒剩余。 2.5.2.8.4 将上一步所得的溶液放置室温后加入吸附柱中室温放置2分钟12000r/min离心 1min。 2.5.2.8.5 离心后弃废液。向吸附柱中加入600L漂洗液pw12000r/min 60s。弃废液。 2.5.2.8.6 重复上步。 2.5.2.8.7 空柱离心12000r/min2min弃废液。开盖放置彻底晾干。 2.5.2.8.8 将CA2加入新的ep管中先加入洗脱缓冲液EB 80L放置2min。12000r/min 2min。收集DNA洗脱液。 2.5.2.9 pET-his 、 BAP gene 胶回收电泳验证 pET-his 胶回收电泳点样顺序为pET-his空质粒胶回收片段 BAP gene 胶回收电泳点样顺序为pET-his空质粒BAP的PCR 产物胶回收片段 2.6 pET-his-BAP的构建及转化和检测 内蒙古大学生命科学学院生物系本科生基因工程实验论文 2.6.1 pET- his -BAP的构建 1 提前将干式恒温仪或泡沫塑料保温盒里的水温度调整到 16。 2 取一个高压灭活的 0.5mL 微量离心管加入如下连接体系 将上述混合液轻轻震荡后再短暂离心然后置于 16水中保温过夜连接。 2.6.2 pET-his-BAP转化BL21DE3 2.6.2.1 将恒温水浴的温度调到 42。 2.6.2.2 从4冰箱中取出一管BL21(DE3)感受态菌插入冰上。 2.6.2.3 加入10L 连接好的pET-his-BAP质粒混合液轻轻震荡后放置冰上 25min。 2.6.2.4 轻轻摇匀后插入 42水浴中90s进行热休克然后迅速放回冰中静置 5 min。 2.6.2.5 在超净工作台中向上述管中加入300uL LB不含氨苄青霉素 培养基轻轻混匀然后固定到摇床的弹簧架上 37震荡 45min。 2.6.2.6 在超净工作台中取上述转化混合液300ul混匀后滴到含合适抗菌素(Amp+)的固体 LB 平板培养皿中。从酒精中取出玻璃涂布棒在火上点燃熄灭后稍等片刻待其冷却后轻轻涂布均匀。 2.6.2.7 在涂好的培养皿上做上标记先放置在 37恒温培养箱中约30min 直到表面的液体都渗透到培养基里后再倒置过来放入 37恒温培养箱中培养过夜。 2.7 pET-his-BAP的诱导表达 2.7.1 观察平板上菌落生长状态选择大小合适的单菌落以便后续试验步骤。 2.7.2 将LB培养基分装到100ml的三角瓶中后加入氨苄青霉素100mL/100L。 2.7.3 将加好Amp+的LB培养基分装到灭菌的试管中1.8mL/管 2.7.4 挑菌37摇床中进行摇菌扩培。 pET-his-BAP连接体系 10L总 pET-his 回收Product 1L (根据所提质粒浓度确定) BAP 回收Product 7L 10x Ligation Buffer 1L T4 Ligase 1L 内蒙古大学生命科学学院生物系本科生基因工程实验论文 2.7.5 质粒提取使用tiangen试剂盒步骤与2.5.1小提质粒相同。 2.7.6 提质粒后进行电泳检测。 2.7.7 将LB培养基配制成含0.2%的LB-葡萄糖培养基Amp+浓度为120g/ml即100ml/120l的比例加入Amp+ 2.7.8 将正确的质粒对应的菌液加入6ml的LB-葡萄糖培养基培养基30慢摇过夜。 2.8 SDS-PAGE检测pET-his-BAP的表达 2.8.1 电泳槽的组装及配胶 2.8.1.1 组装电泳玻璃并用细橡胶管密封底部和侧面然后用夹子夹住玻璃两侧的中央部位。插入梳子后在玻璃上距离梳子齿底部 1cm处做一个标记。拔掉梳子倒入蒸馏水检验是否漏水。如不漏水弃掉蒸馏水。 2.8.1.2 配制 10%分离胶按顺序和量取下列溶液混在一个 50mL 的小烧杯中 Acrylamide-Bis 3.96ml 1M Tris(pH8.8) 4.38ml dd water 3.432ml 10% SDS 118.8L TEMED 9.9L 10%APS 118.8L 2.8.1.3 加完TEMED 后拿起烧杯轻轻转动几下底部将溶液混匀后立刻缓缓倒入玻璃夹缝中直到液面与所作的标记齐平。剩下的胶液留在小烧杯中倾斜放置。 2.8.1.4在胶液面上部用 1000uL 微量移液器轻轻地沿玻璃壁来回移动加满 dd water。静置约 30min。直到烧杯中剩余的胶液凝固。倒出蒸馏水。 2.8.1.5 配支持胶按顺序和量取下列溶液混在一个 50mL 的小烧杯中 Acrylamide-Bis 0.675ml 0.5M Tris(pH6.8) 0.563ml dd water 3.165ml 10% SDS 45L TEMED 7.5L 10%APS 45L 2.8.1.6 加完TEMED 后拿起烧杯轻轻转动几下底部将溶液混匀后立刻倒入玻璃内蒙古大学生命科学学院生物系本科生基因工程实验论文 夹缝中液面与玻璃上边缘齐平。然后再慢慢插入梳子静置约 20min。烧杯中剩下的胶液倾斜放置直到其中的溶液凝固。 2.8.1.7去掉橡胶管将装有胶的玻璃和梳子翻转,贴在电泳槽侧面用夹子把玻璃两边的中部与电泳槽中部夹在一起。 2.8.1.8 在上面的槽中加满自来水试验一下是否漏水然后倒掉自来水。 2.8.1.9 配制1X加样缓冲液400mL从上面的电泳槽倒入若不从下面的电泳槽漏水则加满缓冲液在将下面的电泳槽也加满电泳缓冲液小心缓慢地拔出梳子。 2.8.2 外源基因的诱导表达 2.8.2.1 超净台中接种 pET-his-BAP的BL21DE3菌 空pET-his转化BL21DE3菌 BL21DE3空菌。 37摇菌。 2.8.2.2 150-170r/min 摇菌设置时间梯度对比。统一加3lIPTG进行诱导。 样品编号 时间梯度 34, 5, 6, 7 1.5ha 2hb 3hc 2.8.3 各取1.5ml菌液12000rpm离心15min弃上清收获菌体。用20uldd water重悬菌体加入20ul的2加样缓冲液煮沸5min。 2.8.4 电泳泳道设计1-11泳道加样顺序依次为marker、碱性磷酸酶、IPTG空菌BL2DE3、空载体BL21DE3。3a、3b、3c、4a、4b、4c、7b。 另一电泳泳道设计1-11泳道加样顺序依次为marker、碱性磷酸酶、IPTG空菌BL21DE3、空载体BL21DE3。5a、5b、5c、6a、6b、6c、7c。 2.8.5 电泳时15mA恒流电泳。直至到条带到支持胶处改为20 mA电流电泳。 2.8.6 染色考马斯亮蓝染色30min流水冲掉染料后清水脱色浸泡过夜。 3 实验结果与分析 3.1. BAP基因的PCR扩增 将实验室提供的pMD-18-T-BAP质粒进行PCR扩增在30个PCR循环中得到BAP基因的扩增片段进行琼脂糖凝胶电泳后没有得到条带。而且我们整个在基因工程实验室做实验的同学的PCR电泳均没有条带产生可能是因为PCR仪有些许的问题影响了实验结果。因没有条带产生进而也没有照相。 3.2 pET-his的提取酶切及胶回收检验 内蒙古大学生命科学学院生物系本科生基因工程实验论文 3.2.1 pET-his的提取电泳检测如图1所示 3.2.1.1 1-6号样均为质粒提取的结果本组位于右起第2个泳道。 3.2.1.2 实验结果表明提取质粒成功,但是含量不高,分析原因可能是菌体浓度不够,所含质粒数量较少,提取质粒时操作猛烈,导致片段化等。由于第一次照相的效果不好结果看得不太清楚。 3.2.2 pET-his酶切结果分析如图2所示 3.2.2.1 左数第一条带为pET-his质粒2,3为pET-his质粒酶切的大片段小样。 3.2.2.2此为酶切图谱小的片段已经跑出凝胶了我们主要回收大的片段。由小图1 图2 内蒙古大学生命科学学院生物系本科生基因工程实验论文 样清晰度来看酶切成功的含量应该很大。由于未被酶切的质粒呈现超螺旋结构故电泳时跑的位置靠下。而被酶切的片段呈现线性跑的速率相对较慢故呈现上图的情形。 3.2.3 pET-his酶切胶回收电泳检验,如图3所示 3.2.3.1 图中,2号孔代表未被酶切的质粒,3-7号孔代表胶回收的产物 3.2.3.2 由于含量很低照相后无法很清楚的看到条带在紫外灯下能够看到条带但很微量不太清晰。 3.3 pMD19-T-BAP的构建转化检测 3.3.1 pMD19-T-BAP的构建转化检测。 3.3.1.1 用已经扩增好的PCR 产物(BAP)与pMD-19-T PCR 2.1载体直接连接。并将连接好的pMD19-T-BAP质粒导入DH5感受态菌中进行诱导鉴定。将转化的DH5感受态菌摇菌培养后涂平板。涂到LB(Amp+)的固体培养基中过夜培养进行蓝白斑鉴定。将每个平板挑取三个白菌落一个蓝菌落分别加入加了3mlLB(+Amp)的试管中标记在超净工作台中工作。然后培养3h 3.3.1.2 将培养的菌取出按照试剂盒提质粒后进行电泳鉴定。我组的电泳结果过于模糊因而用的别组的照片进行分析 图4 图3 内蒙古大学生命科学学院生物系本科生基因工程实验论文 1为pET-his质粒23,4为蓝菌落所提质粒5-10为白菌落所提质粒。 3.3.1.3 由图可知5和7号样的连接错误而6号样出现两个条带可能是因为在挑取菌落的时候挑了两个以上的单菌落而真正成功连接的为10号样。 3.3.1.4 失败的原因可能是菌落太小在挑取时颜色分辨的不是很清楚感受态菌体本身有问题PCR产物有问题T载体有问题平板涂布不均匀连接出现问题等。 3.4 pMD19-T-BAP的酶切 3.4.1pMD19-T-BAP的酶切结果借用别组的照片我们的在紫外灯下看得到微弱的条带可是在成像仪内照相后看不到条带 3.4.1.1 1为pET-his质粒2为PCR产物3-6为酶切产物。 3.4.1.2 3-6中明显可以看到2条条带分别为大片段和小片段本次我们需要回收的为大小和PCR产物相近的小片段。所以采用这些酶切结果进行胶回收。 3.5 pMD19-T-BAP胶回收的结果 图6 3.5.1 1为PCR产物2-5为胶回收产物。 图5 内蒙古大学生命科学学院生物系本科生基因工程实验论文 3.5.2 我组的产物位于第三泳道在紫外灯下能够看到条带可能是由于含量太少成像仪照相的照片没有条带。 3.6 pET-his-BAP的构建及转化和检测 图7 3.6.1 由右到左依次为 1为pET-his质粒其余皆为连接载体的提取物 3.6.2 由图可知除了marker外3、4、5、6、7皆有亮度出现但由于有严重的拖尾现象所以目前不能确定是否连接正确但为了后续试验我组决定扩大培养该五组菌体然后进行蛋白质检验。出现严重的拖尾现象可能是因为电泳槽的温度太高导致DNA 片段化进而出现大范围的拖尾现象但具体原因尚不明确。 3.7 SDS-PAGE检测pET-his-BAP的表达 将正确的质粒对应的菌液上步对应的3、4、5、6、7的菌液加入6ml的LB-葡萄糖培养基培养基30慢摇过夜,加入IPTG进行诱导,本组做的为时间梯度,检测如图8所示。 图8 内蒙古大学生命科学学院生物系本科生基因工程实验论文 分析 电泳泳道设计1-11泳道加样顺序依次为marker、碱性磷酸