产前诊断中绒毛脐血羊水取样及标本培养.ppt

产前诊断中绒毛 脐血 羊水取样及标本培养 南京大学附属鼓楼医院妇产科产前诊断中心李洁副主任医生2006年11月 产前诊断中心 南京鼓楼医院 产前诊断指征 夫妇任一方有染色体异常 曾生育过染色体病患者 夫妇任一方为单基因病患者 曾生育过单基因病患者 有不明原因的自然流产史 畸胎史 死产或新生儿死亡史 产前诊断中心 南京鼓楼医院 产前诊断指征 羊水过多的孕妇 夫妇任一方曾接触致畸因素 孕妇年龄大于35岁 有遗传病家族史的近亲婚配的夫妇 产前筛查高风险的孕妇超声胎儿结构筛查胎儿有结构异常的孕妇 产前诊断中心 南京鼓楼医院 产前诊断的方法 羊膜腔穿刺取样 amniocentesis 绒毛穿刺取样 chorionvillussampling cvs 脐带血取样 periumbilicalcordbloodsampling PUBS 植入前诊断 preimplantatongeneticdiagnosis PGD 产前诊断中心 南京鼓楼医院 产前诊断的方法 胎儿组织取样 皮肤 肝脏 胎儿镜 fetoscope 胚胎镜 embryoscope 胎儿超声波图象 fetalultrasoundimaging 母体外周血胎儿细胞检测 cell storing 产前诊断中心 南京鼓楼医院 绒毛穿刺取样 历史 1975年我国鞍山钢铁公司铁东医院首次问世 经宫颈盲吸法 准确率95 自然流产率9 3 出生婴儿未发现异常 莫斯科产科研究所 超声引导下经宫颈吸样 1983您Ward和Brambati分别于英国和意大利发表文章介绍绒毛取样及核型分析 产前诊断中心 南京鼓楼医院 绒毛穿刺取样 时间 妊娠9 11周 产前诊断中心 南京鼓楼医院 绒毛穿刺取样 抽取量 20mg左右 染色体核型分析约需10mg DNA分析约需5mg 生化测定约需5 10mg 产前诊断中心 南京鼓楼医院 绒毛穿刺取样 并发症 胎儿丢失胎儿肢体发育缺陷 LRD 产前诊断中心 南京鼓楼医院 CVS并发症 胎儿丢失 CVS的流产率不比amniocentesis高经宫颈和经腹取样安全性相同 Jackson 1992 多胎取样高于单胎取样 Pergament 1992 产前诊断中心 南京鼓楼医院 CVS并发症 LRD 1999年WHO发布CVS综合性资料认为CVS与LRD无关 216 381例CVS中115例出现LRD发生率1 1881 总的人群发生率1 1642 世界各地相关资料综合 9周以下CVS出现LRD的机会高 但原因尚不清楚CVS不应在小于孕10周的条件下进行 产前诊断中心 南京鼓楼医院 绒毛穿刺取样 方法 经宫颈 transcervical 经腹 transabdorminal 产前诊断中心 南京鼓楼医院 CVS方法 经宫颈取样 B超采用高分辨的扇扫式或凸阵式实时超声诊断仪 经腹探头频率3 5MHz 经阴道探头频率5 7MHz 采用特制较细的滋养层活检导管 多聚乙烯导管 其塑料导管外径1 4 1 6mm 长20cm 带有导管芯 导管前端稍弯 外形似宫腔探子 导管另一端连接10 20ml含有2 4ml生理盐水的注射器 产前诊断中心 南京鼓楼医院 CVS方法 经腹取样 双针活检系统由1根长15cm 外径1 2mm的18号引导套针 及1根长20cm 外径0 8mm的22号活检针组成 在超声引导下 先将引导套针经腹壁及子宫穿刺入胎盘绒毛边缘部分 拔出针芯 然后将活检针经引导套针内送入胎盘绒毛组织 连接含2 4ml生理盐水的20ml注射器 以5ml的负压上下移动活检针吸取绒毛组织 产前诊断中心 南京鼓楼医院 CVS注意事项 动作要轻柔穿刺部位在胎盘绒毛叶抽吸次数不宜过多 产前诊断中心 南京鼓楼医院 羊膜腔穿刺 历史 1956年Fucks进行羊膜腔穿刺行胎儿性别鉴定及胎儿Rh溶血诊断1966年Marksteele和RoyBreg从羊水中分离出羊水细胞培养成功并行胎儿核型分析 产前诊断中心 南京鼓楼医院 羊膜腔穿刺 时间 16 20周 产前诊断中心 南京鼓楼医院 羊膜腔穿刺 抽取量 20 30ml 产前诊断中心 南京鼓楼医院 抽取的羊水用途 核型分析 诊断染色体病DNA分析 诊断单基因病生化测定 诊断NTD 代谢性疾病 产前诊断中心 南京鼓楼医院 羊水穿刺 穿刺前孕妇俯卧位摇动腹部超声波定位引导采用22号或21号带芯长腰穿刺针头垂直 快速进针抽取羊水2ml弃置 换空针抽取羊水 产前诊断中心 南京鼓楼医院 羊膜腔穿刺 并发症 胎儿丢失羊膜腔感染羊水渗漏穿刺部位的出血 血肿 产前诊断中心 南京鼓楼医院 羊穿并发症 胎儿丢失 1976年 NihdRegistry报道流产率3 5 1986年 Taboretal报道流产率1 7 1995年 Bombardetal报道流产率1 3 2000年 Antsaklis报道流产率2 1 产前诊断中心 南京鼓楼医院 脐带血穿刺 历史 1972年 Valenti用儿科膀胱镜在中期妊娠孕妇行子宫切开术插入羊膜腔 获取脐血标本 1979年 Rodeck和Campell应用胎儿镜行脐带血管穿刺 但由于并发症高 应用受到限制 1983年 TernandDaffos超声引导下经皮脐血管穿刺取血 Cordocentesis 产前诊断中心 南京鼓楼医院 脐带血穿刺 时间 16周 分娩 最佳24 28周 产前诊断中心 南京鼓楼医院 脐带血穿刺 取血量 3 5ml20周后抽取6 8ml对胎儿循环无不良影响 产前诊断中心 南京鼓楼医院 脐带血穿刺 适应症 胎儿核型分析或基因检测 胎儿畸形 严重的FGR 羊水或绒毛细胞培养失败 羊水或绒毛培养结果为嵌合体 非免疫性胎儿水肿 脆性X综合症等 胎儿血液疾病分析 血型 血小板计数等 胎儿感染 弓形虫 病毒感染等 胎儿情况评估 酸碱平衡 甲功等 遗传性疾病 单基因病 凝血障碍 血红蛋白病 代谢性疾病等 胎儿治疗 宫内输血 宫内药物治疗等 产前诊断中心 南京鼓楼医院 脐带血穿刺 并发症 穿刺部位的出血脐带血肿短暂性胎心减慢宫内感染胎儿丢失 流产 早产 大多数并发症为短暂性和非致命性 产前诊断中心 南京鼓楼医院 脐带血穿刺并发症 胎儿丢失 Maxwell1991年报道胎儿超声结构筛查示正常超声者脐穿的流产率为1 1 76 异常超声者流产率为7 5 76 胎儿结构明显异常者流产率为25 9 36 Antsaklis1998年报道胎儿超声结构筛查示正常超声者脐穿的流产率1 2 191 异常超声者流产率为13 11 84 产前诊断中心 南京鼓楼医院 脐带穿刺部位 产前诊断中心 南京鼓楼医院 脐血穿刺 确定胎儿血样 血红蛋白电泳Kleihauer Betke试验 胎儿红细胞在酸中稳定APT试验 NaOH中胎儿血为粉红色有核红细胞的出现 产前诊断中心 南京鼓楼医院 脐血穿刺 排除脐血中母血污染 X染色体DMD基因内部5对CA重复序列的连锁分析 绒毛组织 羊水细胞 脐血细胞培养 产前诊断中心 南京鼓楼医院 绒毛组织的培养 直接法培养法 悬浮培养 贴壁培养 产前诊断中心 南京鼓楼医院 绒毛组织的染色体检查 直接法 孕早期Langhan s细胞有较高的有丝分裂活性 能提供足以分析的良好有丝分裂相 较绒毛培养简易可靠 操作简单快速 产前诊断中心 南京鼓楼医院 绒毛组织的染色体检查 直接法 绒毛组织的分离洗脱加秋水仙素 终浓度2ug ml 可一次加 也可分次少量加 37OC5 CO2培养箱培养45分钟低渗 1 枸橼酸钠低渗10分钟或1 枸橼酸钠和0 075mol l1 1低渗40分钟 预固定 甲醇 冰醋酸3 1 10分钟固定 甲醇 冰醋酸3 1 10 20分钟冰醋酸解离绒毛细胞 轻吹打 制片 产前诊断中心 南京鼓楼医院 绒毛组织的染色体检查 悬浮培养法 绒毛挑选洗脱绒毛组织剪成小块入培养瓶 25ml培养瓶每瓶10mg 加特定培养液3ml培养3 6天收获 加秋素 低渗 固定 制片 产前诊断中心 南京鼓楼医院 绒毛组织的染色体检查 贴壁培养法 绒毛组织挑选洗脱绒毛组织剪成小块加0 25 0 02 EDTA5ml37OC摇床中20分钟加培养基终止消化 离心后弃上清加培养基接种培养5 10天收获 产前诊断中心 南京鼓楼医院 羊水细胞培养 细胞类型 成纤维样细胞 F细胞 上皮样细胞 密集型上皮样细胞 E细胞 镰刀样上皮细胞 圆形上皮细胞 羊水样细胞 AF细胞 产前诊断中心 南京鼓楼医院 羊水细胞培养 收获方法 原位法消化法刮取法 产前诊断中心 南京鼓楼医院 羊水细胞培养中存在的问题 污染 细菌真菌支原体病毒其他细胞 产前诊断中心 南京鼓楼医院 羊水细胞培养中存在的问题 母体细胞污染 若胎儿为男性 由于母体细胞污染误将胎儿诊断为嵌合体母体细胞在培养中占优势 产前诊断中心 南京鼓楼医院 羊水细胞培养中存在的问题 母体细胞污染的预防 羊水穿刺时 把最先抽得的1 2ml羊水弃掉染色体多态现象的测试羊水细胞 母体细胞的HLA组织定型鉴别 产前诊断中心 南京鼓楼医院 羊水细胞培养中存在的问题 细胞不生长 不贴壁 最常见的原因是支原体污染培养基PH不适当 偏酸 6 4或偏碱 7 4均不利最合适的穿刺时间16 20周 产前诊断中心 南京鼓楼医院 羊水细胞培