免疫检验第十四讲细胞因子检查.pptVIP

第十四章细胞因子与细胞粘附因子检测及应用 在免疫细胞分化发育 免疫调节 炎症反应 造血功能中均发挥重要作用 并参与人体多种生理和病理过程的发生和发展 细胞因子由活化的免疫细胞及部分基质细胞分泌的 主要介导和调节免疫应答及炎症反应的具有高活性 多功能的小分子蛋白质 细胞粘附分子是一类介导细胞与细胞 细胞与细胞外基质间粘附作用的膜表面糖蛋白 在胚胎的发育和分化 正常组织结构的维持 炎症与免疫应答 伤口修复 凝血与血栓形成 肿瘤转移等过程中具有重要作用 一 细胞因子的共同特性与作用方式 与相应受体特异性结合才能发挥作用 细胞因子可以旁分泌 自分泌或内分泌的方式发挥作用 CKs的共同特性1 高效性 靶细胞 受体 高亲和力结合2 多效性 一CK多靶多效3 重叠性 多CK一靶一效4 协同性 一CK强化它CK5 拮抗性 一CK抑制它CK6 网络性 多CK互相平衡 肥大细胞 胸腺细胞 B IL 4 多效性pleiotropy 活化 增殖 分化 增殖 增殖 IL 2 IL 4 IL 5 IL 4 IL 5 B细胞 IL 4 IFN g 拮抗性antagonism 重叠性redundancy 协同性synergy 均有刺激B细胞增殖的功能 更有效地诱导IgE类别转换 IFN g阻断IL 4诱导类别转化的作用 IL 4抑制IFN g B B B 三 T细胞相关细胞因子与功能 一 TH1型细胞因子 介导细胞免疫1 IFN 2 IL 123 IL 184 IL 2 二 TH2型细胞因子 介导体液免疫主要分泌IL 4 IL 5等 三 TH3型细胞因子 免疫调节与免疫抑制1 TGF 肿瘤早晚期2 IL 10 四 TH17型细胞因子 介导炎症反应1 IL 172 TNF3 IL 23 第二节趋化因子及趋化因子受体的特性与功能 趋化因子 8 12kD已发现50余个成员根据结构中C的位置 排列方式和数量 分C CC CXC CXXXC四类 是细胞因子中唯一作用于G蛋白偶联受体的超家族成员 由白细胞与造血微环境中的基质细胞分泌 具有对中性粒细胞 单核细胞 淋巴细胞 嗜酸性细胞和嗜碱性细胞的趋化和激活活性 趋化因子的生物学特性 1 趋化移行效应 趋化单核细胞向炎症部位移行2 不但能使免疫细胞向感染部位移行 也可促使天然免疫应答向获得性免疫应答的转变 3 趋化因子及其受体在T B细胞的分化发育中起重要作用 4 不同极化的T淋巴细胞表达不同的趋化因子受体 第三节细胞粘附分子与细胞粘附分子受体的特性与功能 分类 5 可溶性粘附分子 1 整合素家族 2 免疫球蛋白超家族 3 选择素家族 4 钙粘蛋白家族 整合素家族最初是因此类粘附分子主要介导细胞与细胞外基质的粘附 使细胞得以附着而形成整体而得名 1 整合素家族 免疫系统以及神经系统和其它生物学系统中 许多参与抗原识别或细胞间相互作用的分子 具有与Ig相似的结构特征 即具有1个或多个Ig样或样结构域 这些种类繁多 分布广泛 识别功能多样的分子称之为免疫球蛋白超家族 2 免疫球蛋白超家族 选择素家族最初被称为外源凝集素细胞粘附分子家族 LEC CAM家族 3 选择素家族 钙粘蛋白是一类钙离子依赖的粘附分子家族 钙粘蛋白在维持实体组织的形成以及在生长发育过程中细胞选择性的相互聚集 重排有重要作用 4 钙粘蛋白家族 一般只有胞外区 同样具有粘附活性 检测可溶性粘附分子的增高水平可作为监测某些疾病状态的指标 5 可溶性粘附分子 淋巴细胞活化的辅助信号分子介导白细胞与血管内皮细胞粘附介导淋巴细胞归巢 二 粘附分子的功能 辅助受体和辅助活化信号是指免疫细胞在接受抗原刺激的同时 还必须有辅助的受体接受辅助活化信号才能被活化 最为常见的提供辅助刺激信号的T细胞上粘附分子结合抗原提呈细胞 APC 上相应粘附分子有 CD4 MHC 类分子 CD8 MHC 类分子 CD28 CD80及CD86 CD2 CD58 LFA 1 ICAM 1等 T细胞识别APC细胞提呈的抗原后 如缺乏粘附分子提供的辅助刺激信号 则T细胞的应答处于无能状态 一 淋巴细胞活化的辅助信号分子 二 介导白细胞与血管内皮细胞粘附 淋巴细胞归巢是淋巴细胞的定向游动 包括淋巴干细胞向中枢淋巴器官归巢 成熟淋巴细胞向外周淋巴器官归巢 继而经淋巴管 胸导管进入血液进行淋巴细胞再循环 以及淋巴细胞向炎症部位渗出 三 介导淋巴细胞归巢 第四节临床常用的测定方法 生物学测定法 免疫学测定法 1 基于DNA检测的分子生物学测定法 DNA扩增法RNA印迹法原位杂交法核酸酶保护分析2 生物活性测定法 生物学测定法分类 根据细胞因子特定的生物学活性 应用相应的指示系统 同时与标准品对比测定 从而得知样品中细胞因子的活性水平 一般以活性单位 U ml 表示 生物活性测定法原理 有助于细胞因子检测的活性作用包括 有助于细胞因子检测的活性作用 刺激细胞增殖或集落形成的活性维持细胞生长和存活的特性抑制细胞生长或破坏细胞的效应促进细胞趋化或抗病毒作用 敏感性较高特异性不高操作繁琐易受干扰 生物学活性测定方法学评价 免疫学测定法 ELISA流式细胞分析法酶联免疫斑点试验 enzymelinkedimmunospot ELISPOT 1 双抗体夹心法2 双位点一步法 一 ELISA方法 标本 1 血清 血浆 关节液 胸腔液 脑脊液 腹腔液2 细胞体外培养后的培养上清液 敏感性偏低不能判断细胞因子的生物学活性 ELISA 特异 简便易于推广和标准化等优点可同时检测大量标本且试验废弃物便于处理细胞因子测定的首选方法 优点 缺点 二 流式细胞分析法 1 分离和培养待检细胞2 细胞固定 破膜3 封闭非特异性结合位点4 染色与分析 基本步骤 细胞内细胞因子的测定 细胞表面的粘附分子或细胞因子受体 区分不同分泌特性的细胞亚群 Th1细胞IFN Th2细胞IL 4 三 酶联免疫斑点试验 enzymelinkedimmunospot ELISPOT 1个斑点代表1个细胞因子分泌细胞 斑点的颜色深浅程度与细胞分泌的细胞因子量相关 基本原理 ELISPOT ELISPOT方法学评价 优点 特异性高操作简便 快速 无需依赖细胞株影响因素较少且易控制 重复性好 方法容易标准化 缺点 所测定的只是细胞因子的蛋白含量 与其生物活性不一定呈正比结果与所用的抗体来源及亲和力有很大的关系敏感性相对较低标本中细胞因子的可溶性受体 会影响特异性抗体对细胞因子的结合 四 其他检测技术 偏振荧光检测技术激光共聚焦显微镜发光技术免疫组织化学技术 第五节细胞因子与细胞粘附分子测定的临床应用 细胞因子的测定主要应用于 特定疾病的辅助诊断机体免疫状态的评估临床疾病治疗效果的监测和指导用药疾病预防 一 临床应用原则 细胞因子和粘附分子的异质性 功能交叉性和多样性 来源的复杂性和组织细胞的非特异性 决定了在进行这些分子检测时 必须对方法选择和结果判断作出综合考虑 细胞因子的检测方法多种多样 各有利弊 高敏感性方法 特异性的降低 废弃物难处理活性测定方法 定性试验基因分析法 利于细胞内定位分析 操作烦琐 一 方法的联合应用 常用临床标本 抗凝全血并分离获得单个核细胞 血清或血浆炎症局部细胞因子的水平 局部分泌液细胞因子或粘附分子的细胞内定位检测 相应细胞相应细胞因子的基因和mRNA表达 相应细胞疗效观察和预后判断 疾病急性期和恢复期双份标本进行动态观测免疫荧光染色和流式细胞分析 注意待检细胞的活性和状态 以保证结果的特异性 二 标本的适当选取 意义 举例 T细胞 巨噬细胞和上皮样细胞分泌相应细胞因子的功能 IL 1 IL 2 IFN 和GM CSFTh1 Th2细胞平衡状态 IL 2 IL 4 IL 10和IFN 三 细胞因子的联合检测 二 特定疾病诊断的辅助指标 一 细胞因子检测在特定疾病诊断中的意义 感染性疾病 免疫炎症 移植排斥反应 TNF IL 1 IL 6 IFN 肝脏损伤的两种炎症介质 TNF IL 6活动性结核 IL 4 IFN 及IL 2 结核性胸膜炎 IFN 及IL 2 IL 4 类风湿关节炎 TNF IL 1 IL 6 IL 8 MCP 1 溃疡性结肠炎 IL 15 哮喘 IL 5 二 粘附分子检测在特定疾病诊断中的意义 E 钙粘素 表达缺失 提示胃腺癌及其分化程度的早期辅助诊断 突变与动脉粥样硬化有关 CD44 高表达 提示肿瘤转移 三 评估机体的免疫状态 判断治疗效果及预后 TNF 自身免疫性疾病GM CSF 血液病IFN 肿瘤 1 细胞因子和细胞粘附分子的特性是什么 可分为几类 2 细胞因子生物活性测定法的种类 各用于哪些细胞因子的检测 主要优缺点 3 ELISPOT的原理 用途 与ELISA的异同是什么 4 在应用流式细胞术分析细胞因子时 需