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核酸分子杂交技术 李如波中国医科大学法医学院 核酸分子杂交技术 Nucleicacidmolecularhybridization 是检测核酸分子间序列同源性的一种技术 不同来源的核酸单链只要彼此间有一定的互补序列 即可按碱基配对规则以氢键相结合 通常是先对一种核酸进行标记 如放射性同位素35S 32P或生物素等 作为探针 去探测另一种核酸序列 核酸分子杂交可以在DNA与DNA RNA与RNA 或DNA与RNA之间进行 由于这种技术具有高度的特异性和灵敏性 已广泛应用于生物学 医学科学研究 临床传染病和遗传病的诊断 一 核酸分子杂交的基本原理从化学和生物学意义上理解 探针 Probe 是一种分子 它带有供反应后检测的合适标记物 并仅与特异靶分子反应 抗原 抗体 外源凝集素 碳水化合物 亲和素 生物素 受体 配体 ligand 以及互补核酸间的杂交均属于探针 靶分子反应 蛋白质探针 如抗体 与特异靶分子是通过混合力 疏水 离子和氢键 的作用在少数特异位点上的结合 而核酸探针与互补链的反应则是根据杂交体的长短不同 通过氢键在几十 几百甚至上千位点上的结合 核苷酸经某一原子 功能基团或长侧链修饰后仍有可能进行碱基配对 这取决于修饰的部位和修饰物的性质 标记的探针每1kb只掺入10 30个修饰碱基 仅4 12 的单个碱基被修饰的类似物取代了 尽管掺入位点外的碱基配对较弱或不存在 但对整个杂交分子的稳定性影响很小 原位杂交原理示意图 二 核酸探针的种类根据标记方法不同可分为 放射性探针 非放射性探针两大类 根据核酸的性质不同又可分为 DNA探针RNA探针cDNA探针cRNA探针DNA探针还有单链 ssDNA 和双链 dsDNA 之分 所以原位杂交可分为DNA DNA cDNA RNA RNA RNA和寡核苷酸与DNA或RNA等杂交方式 三 核酸探针的标记和检测最早采用也是目前最常用的核酸标记方法是放射性同位素标记 常用的放射性同位素有32P和35S 前者能量高 信号强 最常用 放射性同位素探针虽然灵敏性高 但却存在辐射危害和半衰期限制 由于存在上述缺点 近年来 人们在寻求非放射性标记物方面取得了很大进展 国际上已有多家公司相继推出多种非放射性探针标记试剂盒 在国内也具备生物素类标记物的生产能力 并有相应试剂出售 目前非放射性标记物有以下几类 金属如Hg 荧光物质如FITC 半抗原如地高辛 DIG 生物素 酶类如辣根过氧化物酶 HRP 半乳糖苷酶或碱性磷酸酶 AKP 等 四 核酸标记方法及其显示方法 一 核酸探针的放射性标记技术1 缺口平移标记方法其原理是首先用DNA酶在双链DNA探针的一条链上制造一个缺口 nick 缺口处形成3 羟基末端 在大肠杆菌DNA聚合酶I的催化下将核苷酸残基加在3 羟基本上 同时根据大肠杆菌DNA聚合酶I的5 3 核酸外切酶活性 此酶将缺口5 端核苷酸依次切除 其结果是在缺口的5 端不断消除核苷酸而在3 端则依次添加核苷酸 从而使缺口沿着互补DNA链移动 故称缺口平移 nicktranscription 根据这个原理 用 32PdATP置换先前存在的核苷酸 则可制备高活性的DNA探针 能满足大多数杂交的要求 图9 1利用E coliDNA聚合酶的切口平移反应用DNaseI处理可将单链切口引入DNA 大肠杆菌DNA聚合酶I PolI 则结合到双链DNA的切口或缺口处 PolI的5 3 外切核酸酶活性可将DNA一条链的核苷酸除去 产生同时合成DNA延伸链的模板 然后 沿着DNA分子 通过5 3 外切核酸酶和5 3 聚合酶的联合作用 最初的切口被翻译 如图所示 通过DNA聚合酶的作用 在dNTP存在的情况下 反应中双链DNA的上一条链的切口从左到右被翻译 双链DNA的下一条链中 切口平移为从右到左进行 波浪形箭头代表新合成DNA链的片段 2 DNA快速核酸标记大肠杆菌聚合酶I经枯草杆菌酶切割可得到两条多肽链 其中分子量为76kD的大片断称为Klenow片段 该酶具有完整聚合酶I的5 3 核酸聚合酶活性和3 5 核酸外切酶活性 但缺乏5 3 核酸外切酶活性 利用Klenow片段可以填补由限制性酶消解DNA所产生的3 凹陷末端 因此 用这种方法可以标记双链DNA的凹陷3 末端 用Klenow片段标记末端一般只用一种 32P dNTP 加入反应的 32P dNTP取决于延伸的5 末端序列 3 用T4多核苷酸激酶标记DNA5 末端寡核苷酸探针或短的RNA和DNA探针可选用此方法 T4多核苷酸激酶 polynucleotidekinase PNK 是由T4噬菌体感染的大肠杆菌中提取的 此酶能催化ATP的 磷酸转移至DNA或RNA的5 OH末端 在过量ADP存在时 也可促进磷酸交换反应 使PNK将DNA末端5 磷酸转移到5ADP上生成ATP 然后催化 32P dNTP上的标记磷酸转移至DNA的5 末端 从而使DNA重新磷酸化 并得到标记 注意要用碱性磷酸酶去掉磷酸基团 4 随机引物延伸标记方法是从单链DNA或RNA模板合成高比活性的32P标记探针所选用的方法 原理是使长6 8nt的寡核苷酸片段与变性的DNA或RNA模板退火 在DNA聚合酶I的作用下 以每一个退火到模板上的寡核苷酸片段为引物引发DNA链的合成 在反应时将 32PdNTP掺入合成链 即得到标记 变性处理后 新合成链 探针片段 与模板解离 即得到无数各种大小的探针DNA 因为所用真核苷酸片段很短 在低温条件下可与模板DNA随机发生退火反应 因此 被称为随机引物 randomprimer 这种随机引物可用小牛胸腺DNA或鱼精DNA制备 5 聚合酶链反应聚合酶链反应 polymerasechainreaction PCR 是一种分子生物学新技术 由于美国Cetus公司人类遗传学部的KaryB Mulli于1985年创立 该技术利用两个与相反链杂交并随着于靶DNA两侧的寡核苷酸引物经酶促合成特异的DNA片断 包括膜板变性 引物退火和引物延伸三个步骤的反复循环 最终两引物所夹靶DNA得到千万倍以上的扩增 可用来标记高比活性的DNA探针 PCR技术有很高的特异性 可以在1 2小时内大量合成探针DNA片断 如果在底物中加入 32P dNTP或其它标记的dNTP 则探针DNA合成过程中可得到很好的标记 标记物掺入率可高达70 80 PCR标记技术特别适用于大规模检测和非放射性标记 该法的特点是要合成一对特异性PCR引物 6 体外转录法先把DNA片段克隆到有噬菌体转录启动子的载体中 然后在RNA聚合酶的作用下 以DNA为模板 以含有标记的三磷酸核糖核苷为原料 对启动子下游的序列进行转录 所谓启动子 promotor 又称启动基因 是入出境DNA分子上可与RNA聚合酶特异性结合而使转录开始的部位 而启动子本身并不被转录 体外转录常用的噬菌体转录启动子有沙门氏菌噬菌体SP6和大肠杆菌噬菌体T3 T7 当二个不同的噬菌体转录启动子结合在载体多克隆位点的两侧 而且互相呈相对方向时 则可分别启动插入DNA片段Sense和Antisense的转录 转录前要用限制酶先在cDNA插入点的下游切割 使DNA直线化 做为模板 以标记的三磷酸核糖核苷为原料 转录合成RNA探针 二 核酸探针的非放射性标记技术1 光敏生物素标记核酸有二种光敏生物素 均由一个光敏基团 一个链接臂和一个生物素基团组成 光生物素 光敏基团是 N3 在光作用下可与核酸中的碱基结合 补骨脂素生物素 光敏基团是补骨脂素 在光照 320 400 m 下 可与单链或双链DNA发生反应 反应主要在T上 C上也有一定程度的反应 光敏生物素的连接臂含有6 12个碳原子 用以减少探针杂交时的空间位阻 此方法简单 灵敏度可达ng水平 可用于外源基因的检测 2 酶促生物标记核酸以生物素化的脱氧核苷三磷酸 Bio 11 dUTP Bio 7 dATP Bio 11 dCTP 等代替相应32P标记的脱氧核苷三磷酸 以DNA聚合酶作用掺入DNA Bio dUTP代替dTTP Bio dATP代替dATP Bio CTP代替dCTP Bio 11 dUTP的11是指生物素基团与脱氧核苷酸之间连接臂的碳链长度 常用的酶促生物标记DNA的方法有缺口平移法和随机引物延伸法 3 寡核苷酸的生物素末端标记5 磷酸的化学标记法 将寡苷酸的5 磷酸接上一个乙二胺 然后用琥珀亚胺生物素 将生物素基团连接到磷酸酰胺基上 3 OH的酶捉标记法 用末端转移酶将Bio 11 dUTP加于其3 OH端 脱去一个焦磷酸 4 酶标DNA标记试剂 辣根过氧化物酶 HRP 碱性磷酸酶 AP 通过对苯醌 PBQ 与聚乙烯亚胺 PEI 连接而成 HRP PBQ PEI 此试剂在戊二醛的作用下与变性的DNA结合 使HRP与DNA连接在一起 组成HRP标记的DNA探针 5 酶标寡核苷酸核苷酸5 末端标记HRP法 在HRP中产生一个 SH反应基团 在寡苷酸合成终了加在5 端 带一个C6的 HS 与活化的HRP反应生成5 HRP寡苷酸 内中标记AP法 在合成寡核苷酸过程中将一个5 带连接臂及CF3基团的尿苷3 亚磷酰亚胺合成在寡核苷酸链中 合成后此活化的寡核苷酸与AP即得到AP标记的寡核苷酸 6 DNA半抗原标记其原理与Bio 11 dUTP相同 只是用毛地黄甙抗体检测标记在DNA上的半抗原分子地高辛 Digoxigenin DIG 三 非放射性探针的显示体系1 AP显色体系ASO AP BCIP BCI OH PiBCI OH NBT 紫色ASO 等位基因特异的寡核苷酸BCIP 5溴 4氯 3吲哚磷酸NBT 四氮唑蓝Pi 磷酸2 HRP显色体系HRP H2O2 HRP H2O2 ODA NH2 HRP H2O2 ODA N ODA 棕色 HRP H2OODA 邻 联茴香胺 3 ABC显色体系DNA B SA AP DNA B SA或DNA B SA BAP DNA B SA BAPSA streptavidin 链霉亲合素 BAP 生物素化的磷酸酶B biotin 生物素 ABC avidin botin enzymecomplex 亲合素 生物素 酶复合物 4 非放射发光身显影若将AP或HRP的显色底物根据光化学原理换成一种酶解后产生的光子的化合物 可用自显影技术曝光X线片显示 HRP发光自显影 氨基苯 甲酰肼在HRP与H2O2作用下氧化为氨基苯二甲酸 同时放出N2及发光 AP发光自显影 发光底物金刚烷二氧丁环磷酸盐 AMPDD 其磷酸二脂键在AP作用下水解一个磷酸 进而由分子内过氧键提供能源分解并产生金刚酮和激发态的甲基间 氧苯甲酸阴离子 恢复到基态时发光 五 核酸分子杂交方法和类型 一 固相膜核酸分子杂交将参加反应的一条核酸链先固定在固体支持物上 一条反应核酸游离在溶液中 固体支持物有硝酸纤维素滤膜 尼龙膜 乳胶颗粒 磁珠和微孔板等 杂交后未杂交的游离片断容易洗去 膜上留下的杂交物容易检测能防止和DNA自我复性等优点 故该法最为常用 其类型有 菌落原位杂交 斑点杂交 狭缝杂交 Southern印迹杂交 Northern印迹杂交 细胞或组织原位杂交和夹心杂交等 方法 1 DNA变性 变性能使DNA双链解开 常用SSC 0 1mol LSSC 15mmolNaCl 1 5mmol柠檬酸三钠 碱变性 2 膜上固定 20 SSC中转膜 毛细现象 固定 80 下 2小时或紫外线下1分钟 Crosslink 3 预杂交 塑料袋中预热60 预杂交液中 6 SSC 0 01molEDTA 5 Denhardt氏液 0 5 SDS 100 g ml变性鲑鱼精DNA4 杂交 杂交液中的组成 6 SSC 0 01molEDTA 5 Denhardt氏液 0 5 SDS 100 g ml变性鲑鱼精DNA及探针 5 洗膜 2 SSC 0 5 SDS 0 1 SSC 0 5 SDS 60 2小时 6 显色 放射自显影 感光显影 种类 A 菌落原位杂交 Colonyinsituhybridization 是将细菌从培养平板中转移到硝酸纤维素膜上 然后再将滤膜上的菌落裂解以释放出DNA 将DNA烘干固定膜上与标记的探针杂交 放射自显影 检测杂交信号 与平板上的菌落对位 B 斑点杂交 Dotblot 是将被检标本点到膜上 烘烤固定 简便 快速 可做半定量分析 一张膜上可同时检测多个样品 C Southern印迹杂交 Southernblot 将DNA标本用限制性内切酶消化后 经琼脂糖凝胶电脉分离各酶解片断 然后经碱变性 Tris缓冲液中和 及 高盐下通过毛细作用 将DNA从凝胶中转印到硝酸纤维滤膜上 烘干后即可用于杂交 杂交后放射自显影显示与探针互补的DNA酶解片断 是研究DNA图谱的基本技术 在遗传病诊断 DNA图谱分析及PCR产生分析生平方面有重要价值 D Northern印迹杂交 Northernblot 是一种将RNA从琼脂糖凝胶中转印到硝酸纤维膜上的方法 转印方法与DNA相似 但是在进样前用甲醛使RNA变性 而不用NaOH 因为会水解RNA的2 羟基团 E 组织原位杂交 简称原位杂交 指组织或细胞的原位杂交 组织或细胞经适当的处理后使细胞通透性增加 让探针进行细胞与DNA或RNA杂交 因此可以确定探针的互补序列在细胞内的空间定位 具有重要的生物学和病理学意义 染色体DNA杂交可显示特定序列在染色体上的定位 与RNA杂交或显示特定RNA在细胞中或组织中的定位 探针可以是双链或单链DNA 也可是RNA探针 长度以100 400nt为宜 寡核苷酸探针 16 30nt 能自由地出入细胞和组织细胞壁 杂交效率明显高于长探针 是优选探针 二 液相杂交参加反应的两条核酸链都在溶液中 是一种最早且操作简便的杂交类型 虽有时被应用 但不如固相杂交普遍 其原因是杂交后的过量未杂交探针在溶液中去除较为困难和误差较高 近来有商业性基因探针诊断盒的应用 原位核酸分子杂交技术 原位核酸分子杂交技术简称原位杂交 insituhybridization 是应用已知碱基顺序并带有标记物的核酸探针与组织 细胞中待检测的核酸按碱基配对的原则进行特异性结合而形成杂交体 然后再应用与标记物相应的检测系统 通过组织化学或免疫组织化学方法在被检测的原位形成带颜色的杂交信号 在显微镜或电子显微镜进行细胞内定位 这一技术为研究单一细胞中DNA和编码各种蛋白质 多肽的相应mRNA的定位提供了手段 使从分子水平研究细胞内基因表达及有关基因调控提供了有效的工具 视为组织化学或免疫细胞化学中革命性的突破 原位杂交技术已应用于基础研究如基因组图 genemapping 转基因检测 基因表达定位 localizationofgeneexpression 核DNA和RNA的mRNA的排列和运输 arrangementandtransportofmRNA 复制 replication 和细胞的分类 sortingofcells 临床应用在细胞遗传学 cytogenetics 产前诊断 prenataldiagnosis 肿瘤和传染性疾病的诊断 生物学剂量测定 biologicaldosimetry 和病毒学的病源学诊断等 一 原位核酸分子杂交技术的发展原位杂交1969年由美国耶鲁大学Gall和Pardue首先创立的 他们用爪蟾核糖体基因探针与其卵母细胞杂交 确定该基因定位于卵母细胞的核仁中 与此同时 Buogiorno Nardelli和Amaldi John及其同事等相继利用同位素标记核酸探针进行了细胞或组织的基因定位 Ortho 1970 应用3H标记的兔乳头状瘤病毒cDNA探针在兔乳头状瘤组织的冰冻切片进行杂交 首次用原位杂交技术检出了病毒DNA在细胞中的定位 由于同位素标记探针具有放射性 既污染环境 又对人体有害 且受半衰期限制等缺点 因此研究用非放射性标记物标记核酸探针进行原位杂交 引起许多学者的重视和探索 Bauman 1981 等首先用荧光素标记cRNA探针做原位杂交 然后用荧光显微镜观察获得了成功 Shroyer 1982 报导用2 4二硝基苯甲醛 DNP 标记DNA 使该DNA探针具有抗原性 然后用兔抗DNP的酶标抗体来识别杂交后探针 最后经免疫过氧化物酶组织化学的方法显示杂交信号 Brigat 1983 首先创立生物素标记的探针在组织切片上检出了病毒DNA 通过生物素与抗生物素结合 过氧化物酶显示系统显示病毒DNA在细胞中的定位 生物素标记探针技术目前已被广泛应用 特别是在病毒学和病理学诊断中 Boeringer MannhemBiochemisca Roche 于1987年将地高辛标记的有关试剂和药盒投放市场 和其它非放射性标记物一样 地高辛较放射性标记系统安全 方便 省时 同时在敏感性和质量控制方面比生物素标记要优越 地高辛标记法显示的颜色为蓝色 标记碱性磷酸酶 抗碱性磷酸酶显色系统 有较好反差背景 更有利于与免疫组织化学相结合 同时可以检测基因表达 二 原位分子杂交技术的基本方法基本方法包括 杂交前准备 包括固定 取材 玻片和组织的处理 增强核酸探针的穿通性和减低背景染色等 2 杂交 3 杂交后处理 4 显示 包括放射性自显影和非放射性标记的组织化学或免疫组织化学显色 一 固定固定的目的是为了保持细胞形态结构 最大限度地保存细胞内的DNA或RNA的水平 使探针容易进入细胞或组织 DNA比较稳定 mRNA易被酶降解 所以取材后应尽快冰冻或固定 1 最常用多聚甲醛固定液 因其不会与广泛的交叉连接 不会影响探针穿透入细胞或组织 2 mRNA原位杂交时应将组织固定于4 多聚甲醛磷酸缓冲液中1 2h 在冰冻前浸入15 蔗糖中4 过夜 次日切片或保存于液氮中 3 组织也可在取材后直接置于液氮中冷冻 切片后将其浸入4 多聚甲醛约10min空气中干燥后保存于 70 可保存数月 4 福尔马林固定 石蜡包埋的切片对检测DNA或mRNA有时也可获得杂交信号 但由于与蛋白质交联的增加 影响核酸探针的穿透 因而杂交信号常低于冰冻切片 同时在包埋的过程中可减低mRNA的含量 二 玻片和组织切片的处理1 玻片的处理 洗涤剂浸泡 清水冲洗 弱酸中浸泡 冲洗 酒精中浸泡 冲洗 最后蒸馏水冲洗 烘干 高热灭菌 粘附剂涂片 有三种 铬矾 明胶液 多聚赖氨酸 Poly L Lysine APES 3 aminopropyltriethoxysalane 氨丙基三乙氧基硅烷 一般2 APES丙酮液中浸泡10秒 然后丙酮中洗1分钟 2 增强组织的通透性和核酸探针的穿透性常用的方法 应用稀释的酸洗涤 去垢剂 detergent 或称清洗剂 如Triton X100或某些消化酶 如蛋白酶K 胃蛋白酶 胰蛋白酶 胶原蛋白酶和淀粉酶 diastase 等 注意不要过度 蛋白酶K proteinaseK 的消化作用的浓度及孵时间视组织种类 应用固定剂的种类 切片的厚薄而定 一般应用1 g ml 于0 1mol LTris 50mmol LEDTA pH8 0中 在37 下孵育15 20分钟 3 减低背景染色 杂交后的酶处理和洗涤均有助于减低背景颜色 在多聚甲醛固定后浸入乙酸酐 aceticanhydride 和三乙醇胺 triethanolamine 中以减低静电效应 减少探针对组织的非特异性背景染色 预杂交是减低背景染色的一种有效手段 预杂交液与杂交液的区别在于前者不含探针和硫酸葡聚糖 dextransulphate 可达到封闭非特异性的杂交目的 减低背景染色 在杂交后洗涤中用低浓度的RNA酶溶液 201 g ml 洗涤一次 以减低残留的内源性的RNA 减低背景染色 4 防止RNA酶的污染 整个实验过程戴消毒手套 器具高温消毒 240 溶液配制用DEPC水 三 杂交 杂交 hybridization 是将杂交液滴于切片组织上 加盖硅化的盖玻片 或用无菌的蜡膜代替硅化的盖玻片 防止孵育过程中杂交液的蒸发 切片放于5 SSC或2 SSC溶液的湿盒中进行孵育 SSC standardsalinecitrate 四 杂交后处理 不同温度 不同盐浓度的漂洗 一般的原则是盐溶液浓度由高到低而温度由高到低 注意漂洗过程中切勿干燥 五 显示 检测系统 前述 六 对照实验和结果的判定1 将cDNA与cRNA探针进行杂交 吸收实验 2 与非特异性 载体 序列和不相关探针杂交 置换实验 3 将切片用RNA酶或DNA酶进行预处理后进行杂交 用同义探针 senseprobe 进行杂交 4 以不中核酸探针杂交液进行杂交 空白实验 5 组织对照用已知确定为阳性或阴性组织进行杂交对照 6 用未标记探针杂交 进行对照 三 RNA原位核酸杂交方法 一 基本原理是指运用cRNA或寡核苷酸等探针检测细胞或组织内RNA表达的一种原位杂交技术 基本原理同前述与DNA杂交区别 1 探针不同 避免了应用双链DNA探针在杂交反应中两条链的复性与第二条链竟争性杂交 RNA杂交体稳定 杂交后RNA酶洗脱 特异性强 2 检测目的不同 内源性基因如细胞内固有基因 异常基因和变异基因和外源性基因 如细菌或病毒3 有较高的灵敏度 不足之处 1 不同种类探针的选择 制备和标记要适合靶核酸和组织的特点 2 有效制止组织和细胞内RNA降解 3 实验过程中严防RNA酶污染 4 对杂交信号有效的放大和技巧 5 阳性结果的判定 不仅要有阳性或阴性标本对照 有条件的还观察Northern杂交和免疫组织化学对同一组织的冰冻切片或石蜡切片中 基因及其产物两者表达之间关系 6 实验过程中熟练运用技术是杂交成功的关键 二 RNA探针种类 1 cRNA探针 是以cDNA为模板 通过体外转录获得 2 寡核苷酸探针 以核苷酸为原料 通过DNA合成仪合成 标记 1 酶反应法 末端标记法 将标记物导入线型DNA或RNA的5 端或3 端的一种标记法 一般携带的标记分子较少 2 体外转录法 是一种与克隆片段序列相同的单RNA探针的方法 先将靶核苷酸序列克隆到含噬菌体转录启动子的载体中 然后在RNA聚合酶的作用下 以DNA为模板 以含有标记的三磷酸苷为原料 对启动子下游的序列进行转录 而启动子本身并不转录 如大肠村菌噬菌体T3 T7 SP6 当两个不同的噬菌体转录启动子结合在多克隆位点的两侧 用适当的限制性内切酶在插入序列的下游将持粒线性化 在4种三磷酸核糖核苷的相应的噬菌体RNA聚合酶的存在下 即转录成RNA 如反应物中有标记的三磷酸核糖核苷 所有的RNA易被标记 常用的非放射性标记技术有 生物素 地高辛 DIG 碱性磷酸酶 AP 辣根过氧化物酶 HRP 和荧光素 图9 2用噬菌体编码的RNA聚合酶体外合成RNA将待转录的DNA片段克隆入多克隆位点区的限制性位点中 多克隆位点的两侧带有两个噬菌体聚合酶启动子 通常为T7和SP6 用可切割转录区下游的限制性内切核酸酶酶切使DNA线性化 以防止环状模板DNA多聚转录物的合成 将适当的聚合酶及rNTP加入适宜的缓冲液时 即可从靠近插入物的启动子开始转录 互补于一条模板链的RNA产物的长度与转录的启动子及线性DNA至靶序列末端之间的距离相等 反应结束时 用无RNA酶的DNA酶消化除去DNA模板 DNA酶消化后产生的未掺入的核苷酸和寡脱氧核着酸可通过SephadexG 75层析除去 纯化 为了去除在探针标记过程中未被标记的剩余dNTP等小分子 常用乙醇沉淀法或酚 氯仿抽提法进行纯化 1 乙醇沉淀法的原理 DNA可被乙醇沉淀 而未掺入DNA的dNTP则保留在上清中 由些反复乙醇沉淀能将两者分开 2 酚 氯仿抽提法 交替使用酚 氯仿这两种不同的蛋白质变性剂 能将溶液中的蛋白质除去 水解 RNA探针的长度以50 150碱基为佳 探针易进行入细胞 杂交率高 杂交时间短 合成长的探针需要水解成短的探针 试剂 40mMNaHCO3 60mMNa2CO37MNH4OAc EtoH时间 温度 60 Lf LoT K Lf LoK 0 11kb minLf 原检测基因的长度 已合成的探针的长度 kbLo 要水解的探针的长度kb BCL 2ISHDetectionKitBCL 2原位杂交检测试剂盒使用说明书产品编号 HK1050保存 置4 工作量 100张切片有效期 一年BCL 2是主要的抗凋亡基因 本试剂盒采用针对人 大鼠 小鼠的BCL 2特异性寡核苷酸探针 经地高辛标记 由于采用多相寡核苷酸探针和高敏感标记技术 并配合使用敏感性加强型的原位检测方法 具有敏感性特别高 背景清晰 结果准确可靠的优点 可以检测出常规福尔马林固定 石蜡包埋标本的BCL 2mRNA序列 针对人的BCL 2的寡核苷酸探针序列 5 TGCGACAGCTTATAATGGATGTACTTCATC3 5 GTGAAGGGCGTCAGGTGCAGCTGGCTGGAC3 5 AGGTGCCGGTTCAGGTACTCAGTCATCCAC3 上述序列和大鼠 小鼠的序列仅3bp 90bp不同 兔和人序列基本相同 适用种属 人 大鼠 免 小鼠组织 试剂盒中内容 胃蛋白酶 10 Pepsin 2ml 2 预杂交液2ml 3 BCL 2寡核苷酸探针杂交液2ml 4 封闭液5ml 5 生物素化鼠抗地高辛5ml 6 SABC POD5ml 7 生物素化过氧化物酶5ml 用户自备试剂 原位杂交专用盖玻片 博士德有售 POLY L LYSINE DEPC 20 甘油缓冲液 3 柠檬酸 1 SSC 0 5 SSC 0 2 SSC 0 5MPBS 一 培养细胞和冰冻切片准备工作 缓冲液的配备3 柠檬酸 100ml蒸馏水中加柠檬酸 C6H8O7 H2O 3g pH2 0左右 2 SSC 1000ml蒸馏水中加氢化钠17 6g 柠檬酸三钠 C6H5O7Na3 2H2O 分子量294 8 8g 0 5 SSC 300ml蒸馏水加100ml2 SSC即可 0 2 SSC 270ml蒸馏水加30ml3 SSC即可 20 甘油 20ml甘油加80ml蒸馏水即可 0 5MPBS 1000ml蒸馏水加氯化钠30g Na2HPO4 12H2O6g NaH2PO4 2H2O0 4g pH7 2 7 6 操作程序 注意 最重要的是及时固定 并在固定液中加入0 1 的DEPC处理 以抑制RNA酶对mRNA的分解作用 此外 过度固定对原位杂交有明显的不利影响 1 玻片的处理 一般采用多聚赖氨酸或APES 切片厚度20 m 2 细胞在多聚赖氨酸处理的盖玻片上进行培养 条件为37 和5 的CO2 所用培养基为Dubecco基础培养基 细胞长好后0 1MPBS pH7 4 洗2分钟 3次 3 培养细胞和冰冻切片均可用下述方法固定 固定液为4 多聚甲醛 0 1MPBS pH7 2 7 4 含有1 1000DEPC 室温固定30 60分钟 蒸馏水充分洗涤 干燥后 20 冰冻可保存2周以上 4 新鲜配制0 5 H2O2 甲醇室温处理30分钟以灭活内源性过氧化物酶 蒸馏水洗涤3次 5 暴露mRNA核酸片段 切片上摘加3 柠檬酸新鲜稀释的胃蛋白酶 1ml3 柠檬酸加2滴浓缩型胃蛋白酶 混匀 37 消化30 120秒钟 有时也可以不消化 0 5MPBS洗3次 5分钟 蒸馏水洗1次 6 预杂交 湿盒的准备 干的杂交盒底部加20 甘油20ml以保持湿度 按每张切片加20 l预杂交液 恒温箱37 40 24小时 吸取多余液体 不洗 7 杂交 按每张切片20 l杂交液 加在切片上 将原位杂交专用盖玻片的保护膜揭开后 盖在切片上 恒温箱40 42 杂交过夜 9 滴加封闭液 37 30分钟 甩去多余液体 不洗 10 滴加生物素化鼠抗地高辛 37 60分钟或20 左右120分钟 05MPBS洗5分钟 4次 勿用其它缓冲液和蒸馏水洗涤 11 滴加SABC 37 20分钟或20 左右30分钟 0 5MPBS洗5分钟 3次 勿用其它缓冲液和蒸馏水洗涤 12 滴加生物素化过氧化物酶 37 20或20 左右30分钟 0 5MPBS洗5分钟 4次 13 DAB显色 使用DAB显色试剂盒1ml蒸馏水加显色剂A B C各一滴 混匀 加至标本上 一般显色20 30分钟 若无背景出现则可继续显色 也可自配DAB显色剂后显色 充分水洗 14 必要时苏木素更染 充分水洗 15 酒精脱水 二甲苯透明 封片 二 石蜡切片如果有条件的话 应尽可能地采用新鲜标本 标本离体后 及时予以固定 固定液为4 多聚甲醛 0 1MPBS pH7 0 7 4 含有1 1000DEPC 标本较大时用刀片切成厚度不超过4mm的小块 固定2小时即可 较大的标本固定不要超过4小时 某些组织对过度固定大其敏感 如动物大脑 固定时间一定不要超过1小时 1 常规脱水 浸蜡 包埋 切片厚度6 8 m 2 玻片的处理 一般采用多聚赖氨酸或APES 3 石蜡切片经常规脱蜡至水 3 H2O2室温处理10分钟 蒸馏水洗涤2次 4 暴露mRNA核酸片段 切片上滴加3 柠檬酸新鲜稀释的胃蛋白酶 1ml3 柠檬酸加2滴浓缩型胃蛋白酶 混匀 37 消化10 60分钟 用户可以比较不同的消化时间 例如10分钟 20分钟 30分钟和60分钟 以找到最佳的消化时间 0 5MPBS洗3次 5分钟 蒸馏水洗1次 其余步骤和冰冻切片6 15步相同 结果观察 BCL 2mRNA的细胞胞浆着色呈棕黄色 注意事项 如果有少量的细胞核着色属于正常情况 如果出现大量的细胞核着色 往往和标本固定时间过长有关 应重新处理标本 有其它明显的非特异性染色现象时 可以用预杂交液对含探针的杂交液进行稀释 一般稀释2 5倍 P53ISH人结肠癌P53原位杂交染色 DAB显色 NM23ISH人前列腺nm23基因原位杂交染色 DAB显色 癌细胞呈强阳性染色 NMDA 2AISH大鼠标本谷氨酸受体NMDAR2A基因原位杂交染色 DBA显色 神经元呈强阳性染色 TIMP 2ISH大鼠病肝脏TIMP 2基因原位杂交染色 DAB显色 病变肝细胞呈强弱不等的染色 MCAS Se WiDr Se MCAS H WiDr H ProtocolforInsituhybridizationofculturedcells1 PutAPEScoatingcoverslipsindishforcellculturetillcellconfluent 2 WashcoverslipswithPBS for5min1timesatR T 3 Fixby4 Paraformadehyde PBSfor15minatR T 4 WashbyPBS for5min 3atR T 5 WashbyautoclavedMilliQwater5min 1atR T 6 Airdrybyblower dryer inCleanBenchfor30min 7 Dryinincubatorfor3hoursorovernightat45 C 8 StorecoverslipsinRNasefreeslidecase treatedwithDEPCwaterand70 EtOH Sealedandstorein 80 C Storeat 20 Cfor1 2months oraluminumfoil 9 ReturnslidecasetoR T 10 RinseinPBSfor5min 3 11 Rinsein0 2NHClfor20minatR T 12 Rinsein0 2 TritonX 100 PBSandshakefor10min 13 DigestedbyProteinaseKinTEbuffer 1 g ml for15 20minat37 C 300 l slide 14 Fixwith4 paraformadehyde 0 1MPBfor5 10minatR T 15 Rinsein0 2 2mg ml Glycine 0 1MPBfor15min 2atR T 300 l slide 16 Rinsein40 formamide 4 SSCfor30minatR T 17 AddhybridizationsolutioncontainingHorSeRNAprobe 10 l 200 300 l onslideandcoverwithcoverslipsinmoistchamber with50 formamideand2 SSC 200 l slide overnightat45 55 200 l slide 18 Removetheslidesin2 SSC 0 1 SDS 19 Washwith2 SSC 0 1 SDSfor15min 2andshakeat45 55 C 20 Washwith0 2 SSC 0 1 SDSfor15min 2andshakeat45 55 C 21 WashwithBufferA 0 1MTris HCl 0 15MNaCl pH7 5 shakefor10min 2 22 AddBlockingSolution 1 BlockingreagentinBufferA for30min 200 l slide 23 RemovetheBlockingsolution 24 Add200 lsolutionofAnti DIGcomplexinBlockingSolutiononcoverslips theninmoistchamberwith2 SSCfor30min orat4 overnight 1 1000 1 2000diluted 1 5 l 1 5ml 25 WashwithBufferB shakefor10min 2 0 1MTris HCl 0 1MNaCl 50mMMgCl2 pH9 5 26 Add2 3drops 100 200 l BCIP NBTsolution DAKO for1hour 2 24hours atdarkchamber checkbymicroscope 27 WashwithBufferCtostopreactionfor10min 2 10mMTri HCl 1mMEDTA pH8 0 28 WashwithH2O MilliQ for10min 3 29 MountwithGlycergel Aqueousmountingmedia DAKO CoatingthecoverslipswithAPES1 Putcoverslipsin0 2NHCl 0 5ml 30ml for20min airdry2 100 EtOHfor20min airdry3 Airdrycompletely4 2 APES acetonefor10sec 200 l 10mlacetone 5 Acetonefor1min 26 Airdry7 Storeinaluminumfoil ReagentsandsolutionsforInSituHybridization1 PBS PhosphateBufferSaline 10 stock 137mMNaClNaCl 58 44 8g802 7mMKClKCl 74 55 0 2g210mMNa2HPO4Na2HPO4 12H2O 358 14 3 58g35 82mMKH2PO4KH2PO4 136 09 0 24g2 4H2O DEPCwater 1000ml1000mlAdjustpHto7 4withHCl usually7 4 notneedadjust pH 7 4in10 stock solution pHdownto7 4afterdiluted Autoclaved 2 0 2MPB PhosphateBuffer Na2HPO4 12H2O 358 14 35 814gNaH2PO4 2H2O 156 01 15 601g 500ml400mlDEPCwater AdjustpHto7 4withNaOH finallyto500ml 0 1MPB0 2MPB500mlDEPCWater500ml 1000ml 3 4 Paraformadehyde PFA PFA4gDEPCwater40mlheat60 65 stirring addjustpHto7 0tilldissolvedwithNaOH andthenaddDEPCwaterto50ml 0 2MPB50ml 100mlstoreat4 4 0 2NHCl1NHCl1000ml1 36 46 1000 1000 1 18 36 85 83mlHCl0 2NHCl 50ml DEPCwater HCl 0 2 36 46 50 1000 1 18 36 0 8583ml4ml36 HCl 249mlDDWsimply 1mlHCl 60mlDDW5 0 2 TritonX 1000 2mlTritonX 100 100mlPBS0 1mlTritonX 100 50mlPBS6 ProteinaseK1 g mlinTEbuffer 7 TEbufferforProteinaseK 0 1MTris HCl 50mMEDTA pH8 0 1MTris HCl pH8 0 10ml0 5MEDTA pH8 0 10mlH2O80ml 100mlstoreat 20 8 0 2 2mg ml Glycine PBSGlycine100mgPBS pH7 4 50mlstoreat4 9 Dehydrateethanol75 95 100 I 100 IIethanolinDEPCwater 10 Acetylation 0 25 aceticanhydridein0 1MTEA 0 1MTEABufferTriethanolamine MW 149 19 SpecificGravity 1 13at20 4 Triethanolamine13 5mlNaCl5 0gHCl4 0mlDEPCwaterto997 5mlAddaceticanhydride2 5mlbeforeuse 1000ml 0 125ml 50ml0 1MTEA 11 40 formamide 4 SSC40mlformamide20ml20 SSC40mlMilliQ autoclaved 100ml12 Hybridizationsolution50 formamide100 50ml100ml10 sodiumdextransulfate50 20ml40ml1 Denhardt ssolution50 2ml4ml10mMTris HCl pH7 5 1M1ml2ml1mMEDTA0 5M0 2ml0 4ml0 6MNaCl5M12ml24ml200 g mlYeastRNA2mg ml10ml20mlMilliQH2O autoclaved 4 8ml 100ml 9 6ml 200ml13 50 Denhardt ssolutionFicoll4000 5gPolyvinylpyrrolidone0 5gBovineserumalbumin0 5gH2O MilliQ autoclaved 50ml storedat 20 14 20 SSC StandardSalineCitrate 3 0MNaClNaCl175 3g0 3MSodiumCitrate 294 1 SodiumCitrate88 2gH2O MilliQ 800ml 1000mlAdjustpHto7 0withNaOH to1000ml15 10 SDS Sodiumlaurylsulfate SDS10gH2O MilliQ 100ml Don tputintoTris HClbuffer PutSDSinautoclavedwater about50 anddissolved 16 0 5MEDTADisodiumEDTA 2H2O186 1gH2O MilliQ 800mladjustpHto8 0with 20gNaOH finallyto1000ml17 BufferA 0 1MTris HCl 0 15MNaCl 1MTris HCl pH7 5 50ml100ml5MNaCl15ml30mlMilliQ autoclaved 500ml 1000ml 18 BlockingSolution 1 Blockingreagent Roche 1g2gBufferA100ml200ml19 BufferB 0 1MTris HCl 0 1MNaCl 50mMMgCl2 1MTris HCl pH9 5 50ml100ml5MNaCl10ml20ml1MMgCl225ml50mlMilliQ autoclaved 500ml 1000ml20 BufferC 10mMTris HCl 1mMEDTA 1MTris HCl pH8 0 5ml10ml0 5MEDTA1ml2mlMilliQ autoclaved 500ml 1000ml21 STE NTE bufferforRNase RNase1mg ml 5MNaCl20ml1MTris HCl10ml0 5MEDTA2mlMilliQ autoclaved 1000ml 参考书目 原位PCR设计及基本步骤 3 1设计思想原位PCR的设计思想就是将PCR的高效扩增与原位杂交的细胞定位相结合 在组织细胞原位检测单拷贝或低拷贝的特定DNA或RNA序列 PCR是在DNA聚合酶的作用下 经过模板变性 特异性引物与模板退火和引物延伸三种温度的热循环 将特异性靶序列迅速扩增 参阅第1章 PCR技术的敏感性极高 细胞内单拷贝或低拷贝数的靶序列经PCR扩增后 一般能扩增105一107倍 就很容易用凝胶电泳或Southern印迹杂交检测 PCR技术不仅敏感性高 特异性强 而且还由于耐热DNA聚合酶的应用及自动化热循环仪的研制成功 使PCR操作简便易行 但是PCR是在液相中进行的 PCR扩增前 要把细胞破坏 从中提取核酸做为模板 因此很难把PCR的结果与组织细胞的形态结构特征联系起来 也很难判定含特异性靶序列的细胞类型 原位杂交是分子杂交与组织化学技术的成功结合 它用标记的DNA或RNA为探针 能在原位检测组织细胞内特定的DNA或RNA序列 运用原位杂交技术 在显示阳性杂交信号的同时 还能判别含有靶序列的细胞类型 以及组织细胞的形态结构特征与病理变化 但有时候 原位杂交的应用受到其敏感性的限制 一般拷贝数较高的序列较易被检出 而细胞内单拷贝DNA序列和低于10 20拷贝的RNA序列 则不能被原位杂交检出 原位PCR的待检样本一般需先经化学固定 以保持组织细胞良好的形态结构 细胞膜和核膜有一定的通透性 PCR扩增所必需的各种成分 如引物 DNA聚合酶 4种三磷酸核昔等进入细胞内或核内 以固定的DNA或RNA为模板 在原位进行扩增 PCR反应在由细胞膜组成的 囊袋 内进行 而扩增产物因分子较大 或互相交织 不易透过细胞膜向外弥散 所以能保留在原位 经过PCR反应 原来细胞内单拷贝或低拷贝的特定DNA或RNA序列呈指数扩增 这样就很容易应用原位杂交技术将其检出 原位PCR综合了PCR技术和原位杂交的特点 既能检出细胞内单拷贝或低拷贝的DNA或RNA序列 而且同时还可对含靶序列的组织细胞进行形态学分析 3 2设计方案从严格的定义讲 原位