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文档简介

小鼠IL 4R 基因shRNA有效靶点的筛选 王旻 北京大学人民医院耳鼻喉科 变应性鼻炎的治疗策略 避开致敏原 几乎不可能药物治疗 部分患者疗效不肯定副作用免疫治疗 适应症窄 寻求一种有效的治疗方法可不容缓 治疗进展 转录后的抑制是变应性疾病的治疗热点 反义RNA和小干扰RNAs siRNAs 是最为常用的方法 AndrewFire CraigMello Nature1998 391 6669 806 11 2006年诺贝尔医学奖获得者 小干扰RNAs的原理 RNA干扰是存在于真核细胞内的一种自我保护现象 既能对抗降解如病毒 自身异常基因产生的mRNA 主要发生在基因转录后 即mRNA的修饰或翻译水平上 具有特异 高效和持久的特点 小干扰RNAs的优势 siRNA是双链结构 更稳定 siRNA不需要化学修饰 RNAi技术不存RNaseH酶或立体结构抑制作用 RNAi技术具有效应放大作用 IL 4R 变应性疾病的重要作用 IL 4和IL 13酪氨酸激酶偶联受体信号通路 Jak Stat途径 在IgE依赖的变应性反应中起着关键作用IL 4R 是该通路的核心分子 目的 本研究探讨设计IL 4R 的短发夹RNA shRNA 序列 并合成IL 4R 的RNA干扰载体 筛选有效shRNA干扰靶点 实验步骤 目的基因RNA干扰载体制备融合蛋白表达载体构建RNA干扰有效靶点筛选 目的基因RNA干扰载体制备 shRNA载体的构建 酶切pGCsi载体以使其线性化双链DNAoligo制备克隆连接转化鉴定 PCR鉴定 挑选阳性克隆菌液送测序 融合蛋白表达载体构建 构建融合表达载体pEGFP N1 Il4ra 通过外源性靶点的筛选 所以首先要构建融合蛋白 即包含有绿色荧光蛋白的载体同IL 4R 的序列融合在一起 PCR阳性克隆鉴定图片 正确克隆于表达载体的目的基因片段能够与EGFP融合表达 荧光镜检图片 RNA干扰有效靶点筛选 采用荧光镜检检测目的基因不同的RNAi靶点干扰情况下的敲减效率 PCl组为单转染过表达融合蛋白质粒的细胞组 NC为共转染阴性shRNA对照组 1 3 为共转染不同靶点shRNA组 PCNC1 2 3 采用WesternBlot检测目的基因不同的RNA靶点干扰情况下的敲减效率 3 靶点对外源表达的目的基因 对蛋白水平有最明显的knockdown作用 灰度分析显示 3 靶点对Il4ra
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