胚胎干细胞来源的饲养细胞支持自体胚胎干细胞生长.doc

胚胎干细胞来源的饲养细胞支持自体胚胎干细胞生长?470?上海交通大学(医学版)JournalofShanghaiJiaotongUniversity(MedicalScience)Vo1.26No.5May2006【文章编号】02585898(2006)05047006?基础研究?胚胎干细胞来源的饲养细胞支持自体胚胎干细胞生长施英唐.唐帆.褚建新(上海交通大学医学院新华医院发育生物学研究中心,上海200092)【摘要】目的探讨小鼠胚胎干细胞(mESCs)来源的饲养细胞是否具备支持自体mESCs未分化生长的能力.方法先诱导mESCs形成类胚体(EB),进一步诱导其分化为成纤维细胞(mEBdFE),以用作饲养细胞.采用形态学,集落形成率,细胞分化率,免疫细胞化学,碱性磷酸酶染色和RTPCR对生长在mEBdF上的mESCs的未分化特性进行鉴定.采用RTPCR和诱导mESCs体内外分化方法鉴定mESCs多分化潜能特性.结幂从EB三个发育阶段(EB贴壁l0,l5,20d)分离出48个mEBdF系,其中5个(来自15d的EB)能维持mESCs未分化生长和多潜能性达l0代以上.生长在这种饲养层上的mESCs与生长在小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)上一样,其特性无明显差异,均表达碱性磷酸酶和特殊的mESCs标记,包括SSEAl,OCT-4,NANOG,在体外形成EB和体内形成畸胎瘤;其他43个mEBdF系则不具有这种能力.结论研究不仅为mESCs体外培养提供了一种新的饲养细胞,避免了MEF作饲养细胞的许多不足;而且还提示mESCs可诱导出不同功能的成纤维样细胞,其差异的分子机制值得进一步研究.【关键词】小鼠胚胎干细胞;类胚体;饲养细胞【中圈分类号】R329.1;R329.28;Q26【文献标识码】AMouseEmbryonicStemCellsDerivedFeederCellsSupporttheGrowthofThemselvesSHIYing-tang,TANGFan,CHUJian-xin(CenterforDevelopmentalBiology,XinhuaHospital,SchoolofMedicine,ShanghaiJiaotongUniversity,Shanghai200092,China)Abstract:ObjectiveTotestwhetheredercellsderivedfrommouseembryonicstemcells(mESCs)c0uldsup.portthegrowthofmESCsthemselves.MethodsmESCswereinducedtoformmouseembryoidbodies(EB),andthenfibroblastlikecellswerederivedfromfurtherdifferentiatedmEB(mEB.dF),whichservedasfeedercells.TheundifferentiationofmESCsgrownonmEBdFwasconfirmedbymorphologicalanalysis,colonyefficiencyandcelldif-ferentiationrateofmESCs,immun0cyt0chemistry,alkalinephosphatasestainingandRT.PCR.ThepluripotencyofmESCsgrownonmEBdFwasexaminedbyRT.PCR,inducingtheirdifferentiation0andinitro.ResultsFortyeightfibroblastlikecellslineswerederivedfromthesameEBatthreeperiods(d10,d15andd20),andfiveofthem,mostlyderivedfromd15EB,wereabletomaintainmESCsinundifferentiatedstatusandpluripotentia1abili.tyover10passages.mESCsculturedonthesefeedercelllinesexpressedalkalinephosphataseandspecificmESCsmarkers,includingSSEA一1,OCT-4,NANOG,andformedEBinvitroandteratomasvivo.HOWever.themaj0ritvofmEBdFlines(43/48)hasnosuchability.ConclusionThisstudynotonlyprovidesan0velfeedersvstemformESCsculture,avoidinglotofdisadvantagesofmouseembryofibroblastsusedasthefeeder.butals0indicatesthatfibroblastlikecellsderivedfrommESCstakeondifferentfunctions.Themolecularmechanism0fdif_feI-entf.uncti0n0fthesefibroblastcellsisworthyoffurtherinvestigations.Keywords:mouseembryonicstemce11s;embry0idbedy:feederce11s【基金项目l国家重点基础研究发展规划(“973”)项目(2001CB509904)【作者筒介l施英唐(1975一),女,福建泉州人,博士生【通讯作者l褚建新,E-mall:NO.5施英唐,等:胚胎于细胞来源的饲养细胞支持自体胚胎于细胞生长卜20多年前,小鼠胚胎干细胞(mouseembryonic$temcells.mESCs)的分离和维持是以小鼠胚胎成纤维细胞(mouseembryofibroblast,MEF)作为饲养层进行共培养而获得的.对MEF能够维持mESCs长期生长的特殊作用目前了解甚少.一般认为,MEF提供mESCs最佳的生长环境,有利于信号网络的相互作用以及解毒等.3.至今,仅有少数饲养细胞体系能支持mESCs的生长,如MEF,SIM小鼠胚胎来源的抗硫代氨基酸和哇巴因细胞(SIMmouseembryoderivedthioquanineandouabainresistant,STO)和幼仓鼠肾脏细胞(babyhamsterkidneycells,BHK21)等J,其中MEF最常用.然而它们都是来源于异种或同种异体的饲养细胞,存在引入种间和种内病原体的可能性;此外,还需不断培育胎鼠制备MEF,以及其最佳应用期为46代不等.最近有研究者报道,人胚胎干细胞(humanembryonicstemcells,hESCs)来源的成纤维细胞可作为饲养细胞体系支持自体hESCs生长.在mESCs培养中尚未见类似报道.为试验mESCs来源的成纤维细胞能否支持自身mESCs生长,我们分离了48个小鼠类胚体来源的成纤维样细胞系(mouseembryoidbody-derivedfibroblast,mEBdF),发现其中5个能够保持mESCs未分化状态和多潜能,而大多数(43/48)没有这种作用.本研究不仅提供了一种支持mESCs生长的新饲养细胞,而且还提示mESCs可诱导出不同功能的成纤维样细胞.材料与方法小鼠成纤维样细胞的诱导mESCsD3(CRL一11632,ATCC)按常规培养.培养液成分包括DMEM(Gibco),15%胎牛血清(fetalbovineserum,FCS)(Hyclone),1000U/mL白血病抑制因子(1eukemiainhibitoryfactor,LIF)(Sigma),0.1mmoL/LB一巯基乙醇(Sigma),1%非必需氨基酸(MEMnonessentialaminoacidsolution,NEAA)(Gibco)和1%青霉素/链霉素(penicillin/streptomycin,P/S)(Gibco).为诱发类胚体(embryoidbodies,EB)产生,将mESCs悬浮培养56d,诱导液成分包括DMEM,10%FCS,0.5Imol/L全反式视黄酸(Sigma)和1%P/S.为进一步诱导EB分化,将形成的EB贴壁培养于预涂0.1%明胶的培养皿中,诱导液包括DMEM,10%FCS,10%马血清(Sigma),1%NEAA,1%鸡胚提取液(chickembryoex-tract,CEE)(AccurateChemical&ScientificCorporation),10ng/mL表皮生长因子(epidermalgrowthfact0r.EGF)(Sigma)和1%P/S,隔日换液,培养到第10天,用0.05%的胰酶/EDTA(Gibco)消化从mEBs迁移出的细胞进行培养.其余贴壁的EB进一步培养,经5d和10d分别重复培养消化下细胞的步骤.以上三个阶段被消化下来的细胞称为原代细胞,原代细胞培养510d达到90%融合时,用0.05%的胰酶/EDTA消化传代,传代细胞改换培养液进行培养(培养液为DMEM,20%FCS,1%NEAA和1%P/S),直到形态全为成纤维样,统称为mEB-dF.mEB.dF作为饲养层将第520代的mEBdF(48个细胞系)用细胞霉素c处理后,接种于预涂有0.1%的明胶培养皿中为饲养层,接种密度为1000012000cells/cm.将mESCs接种于mEBdF饲养层上进行培养,以MEF饲养层为对照,每日换液.集落边缘出现分化前用0.05%胰酶/EDTA进行消化传代,接种于备好的饲养层上.mESCs接种于饲养层上的集落形成率和分化率按以下公式计算:集落形成率=(集落数/510)100分化率=(分化集落/总的集落数)100每次集落计数20个视野(100),重复3次.碱性磷酸酶染色结果示未分化集落为全染色集落,分化集落包括部分染色和未染色集落.结果以s表示.mESCs的核型分析mESCs与mEBdF共培养前后,按G一带方法对其进行核型分析,每个细胞样品均取20个染色体中期进行计数.免疫细胞化学和碱性磷酸酶染色:贴壁细胞用4%多聚甲醛固定15min.0.1%TritonX一100/PBS处理10min.用3%BSA/PBS阻断3omin后加入已稀释的一抗,置湿盒中4孵育过夜;用PSA替代一抗作为阴性对照.使用的第一抗体包括Vimentin(博士德),OCT-4(SantaCruz),SSEA一1(Chemicon),二抗标记FITC或辣根过氧化物酶(horseradishperoxidase,HRP)(Jackson),后者用DAB底物(博士德)显色.苏木素复染.结果在显微镜下观察并拍照(A80;Olympus).碱性磷酸酶(alkalinephosphatase,APase)活性用BCIP/NBT底物(Roche)显色.体外分化为检测mESCs在mEB-dF上生长后的多潜能特性,第8代mESCs被悬浮培养形成EB,并且通过将EB贴壁培养进一步诱导其分化.EB贴壁培养3周后进行RTPCR分析.体内分化以mEBdF为饲养层,将mESCs培养数代后注射到NOD/LtSzscid小鼠的大腿肌肉内,每只鼠注射310510个细胞.1012周后观察取材,将生成瘤块用4%多聚甲醛固定过夜,常上海交通大学(医学版)规石蜡切片,苏木素染色观察.小鼠由中科院上海实验动物中心提供,生产许可证号:SCXK(沪)2002-0010,使用许可证号:SYXK(沪)20020033.RT.PCR用Trizol(Invitrogen)提取细胞总RNA,然后用DNAseI(Promega)37处理20min以降解DNA,用M.MLV逆转录酶和随机引物(Promega)合成第一链.PCR所用引物如表l.PCR反应条件:94预变性4min;然后9430S,56oC(62cI=:REX-1)30s,7230s,共4o个周期,最后7210min.表1PCR引物Tab1PCRprimersProductsGenesPrimerq”“(bp)A.i.”“.结果mEB-dF的生长特性EB贴壁生长10d,有大量细胞迁出,其中约85%为成纤维样细胞(图1A),其余为上皮样细胞.将迁出的细胞进行消化培养,贴壁的EB仍继续培养,5d后大量细胞迁出,细胞形态各异,成纤维细胞比例下降到约55%(图lB).再将迁出细胞消化培养.保留贴壁EB继续培养5d,有更多异质性细胞迁出(图1C).将三个阶段(第一阶段10d,第二阶段15d;第三阶段20d)分离出的细胞传35代后,几乎所有细胞呈成纤维细胞形态(图1D)即为mEB-dF.这些细胞表达两种成纤维细胞的标志:Vimentin和P4HB(图lE,F).细胞每隔24d按l:3传代,在本培养条件下所有细胞可传至27代左右.总计48个细胞系,三个阶段各有l6个.mEB.dF在冻存和复苏后成活率约75%.本研究以第5代至20代的mEB-dF作为饲养层.以mEB-dF为饲养层的mESCs生长特性将mESCs与48个mEB.dF细胞系进行共培养,发现其中5个细胞系能有效地支持mESCs未分化生长超过l0代.这5个细胞系称为有效成纤维细胞(efficientfibroblasts,EF),细胞系一个来自EB分化第一阶段迁出的细胞,4个来自EB分化第二个阶段迁出的细胞.以这5个细胞系为饲养层,mESCs仍保持它们典型的形态(图2A),其生长速度与生长在MEF上的相似,即每隔23d按l:6传代.当mESCs与EF共培养8代后,其集落形成率和分化率与同MEF共培养4代后的相似(表2).相反的,当mESCs与其它43个细胞系共培养时,第一代细胞分化率超过95%(图2B,表2).此外,早期l4代虽然能形成集落,但绝大部分的集落呈分化状态(图2B,表2).因此,将这43个细胞系称为无效成纤维细胞(ineffi.cientfibroblasts,IF)细胞系.当mESCs在IF上生长到第6代已无法再形成集落(数据未显示).这些结果表明EF和MEF一样能够支持mESCs未分化生长.mESCs与EF共培养前后的核型相同(数据未显示).表2以mEB-dF为饲养层的mESCs的集落形成率和细胞分化率(is)Tab2ColonyefficiencyandcelldifferentiationrateofmESCsgrownonmEB-dF(is1以mEB-dF为饲养层的mESCs未分化特性经mESCs未分化标志抗原免疫细胞化学和RT.PCR检测证明,mESCs和EF共培养8代后仍然表达OCT-4,SSEA-l,REX-l和APase(图3A,C,E;图4A);而mESCs和IF共培养l代后OCT4和SSEA.1几乎不表达(图3B,D,F),APase为部分表达,共培养6代后仍有REX.1表达(图4A).以mEB-dF为饲养层的mESCs多潜能特性以EF为饲养层,mESCs生长8代后仍能形成EB(图5A),EB贴壁培养后有分化细胞迁出(图5B,C,D).通过RT?PCR分析证明含三个胚层的细胞(图4B).态m2个J止纤维细胞特蛛标得到确认总【l48个戍纤维样咆乐束于相同呐?个发育阶段,遗些细胞系可恃20代上仃意义的是其巾5十(多数朱门帮_二阶段)能生持n佛IIIESCs未分化逃I”代上生K该饲粹细胞j的mESCs侏宵啄米特征,遮特l-塘过集绋彤志学表1mESCs特琳标记,以琏证悼01-肜_J芷FH和住体内形成l啼腑州等讣估得倩认;mESCs集潜孵成败琦暑细胞舒化率生&任MEl”的IIIESCs也相似结表明.我分离的IEBdF巾少部什支持l体mESCs长的J能且要澉瓤功,亓和复苏的影响一为mESC培养提供一种新的饲养细恤,畦免丁MEF作锕养胞的多缺点值得盥的是一来源的mBdF中大多数(1,3/48)白吏持mESCs丰仆化乍的能力血就址砒.mESCs诱甘出的这些成纤维绑胞最+少数可戈持mESCs生乇,而擞大多数缺乏这种作用这些细胞J能缺乏立持mESGs生乇的因子或胞外筚质拈llJrC1mmbers等指缺王分泌L【F功能的ME井小能阻止mESCs的抒七搓近舛柯仔【究袁叫l墚L1外诬仃其它f号建径在维持hESCs_IESCs持续增蚯,r1找新j1舒化巾起到跫谜n.用.这些信号缝径包括BMP4,SCF”IGF.誓No.5施英唐,等:胚胎干细胞来源的饲养细胞支持自体胚胎干细胞生长?475?131,FGF,WNT3等.最近Li等在分离的多种饲养层细胞支持同源ES的实验中发现,凡是能够高表达LIF,bFGF,BMP4,SCF,TGF.Bl,WNT3的细胞就能够有效支持其同源ES的生长,而那些不表达或低表达这些信号的细胞恰恰缺乏支持ES生长的能力.这样的结果似乎可以解释其分离的不同饲养层细胞具有不同的支持能力.在本实验中EF和IF是不是也存在着相同的信号途径差异还是另有原因,进一步探讨这一现象的本质将有助于理解mESCs自我更新的机制.至于支持自体mESCs未分化生长的mEB.dF为什么多数来自第二阶段的EB,这是不是与分离MEF作为饲养层需来自胎鼠发育特定阶段(14.5d)一样,因为这个特定发育阶段的成纤维细胞才具有有效的支持作用,但其中的机理目前尚不清楚.据文献”报道,有2种方法可获得hESCs来源的饲养细胞:一种方法是hESCs在无饲养细胞培养体系中培养一周后自发分化为成纤维样细胞,通过传代可用作饲养细胞.另一种方法是先诱导hESCs形成EB,再诱导其进一步分化,l014d后从贴壁EB迁出的成纤维样细胞,通过传代可用作饲养细胞.在本研究中,按前一种方法培养mESCs.D3,细胞增殖形成分化集落,无分化成成纤维细胞的现象,57d后细胞融合达90%,传代后大多细胞退化或死亡,少数细胞贴壁,但失去增殖能力,一周后衰老.该方案不能诱导mESCs分化出饲养细胞.用另一株小鼠胚胎干细胞(mESCs.S8,来自本实验室)进行同样实验结果相似(数据没显示).当按照第二种方法(本实验稍做修改),先诱导mESCs形成EB,进一步诱导其分化为成纤维样细胞并建立细胞系,其中少数细胞系有支持自体mESCs未分化生长能力.提示mESCs和hESCs来源的成纤维样细胞的特性有所不同,这种不同可能不是培养条件所导致,而是种间不同所致,这与目前认为人和小鼠的ESCs存在许多差异的看法是一致的.【参考文献】1EvansMJ.KaufmanMH.EstablishmentincultureofpluripotentialcellsfrommouseembryosJ.Nature,1981,292(5819):154156.2XuC,InokumaMS,DenhamJ,eta1.Feeder-freegrowthofundif-ferentiatedhumanembryonicstemcellsJ.NatBiotechnol,2001,19(10):971974.3LiraJW.BodnarA.Proteomeanalysisofc0nditionedmediumfrommouseembryonicfibrcblastfeederlayerswhichsupportthegrowthofhumanembryonicstemcellsJ.Proteomics,2002,2(9):11871203.4MfopouJK,SwillemsE,LeynslL,eta1.ExpressionofregulatorygenesforpancreasdevelopmentduringmurineembryonicstemcelldifferentiationJ.IntJDevBiol,2005,49(8):915922.5DowningGJ,BatteyJF.Technicalassessmentofthefirst20yearsofresearchusingmouseembryonicstemcellLinesJ.STEMCELLS,2004,22(7):11681180.6ChambersI,SmithA.Serf-renewalofteratocarcinomaandembryonicstemcellsJ.Oncogene,2004,23(43):71507160.7HodgsonDM,BehfarA,ZingmanLV,eta1.Stablebenefitofembryonicstemcelltherapyinmyocardialinfarction.JAmJPhysiolHeartCircPhysiol,2004.287(2):471479.8OdoricoJS,KaufmanDS,ThomsonJA.MuhilineagedifferentiationfromhumanembryonicstemcelllinesJ.STEMCELLS,2001,19(3):193204.9RichardsM,FongCY,ChanWk,eta1.Humanfeederssupportpro.1ongedundifferentiatedgrowthofhumaninnercellmassesandembryonicstemcelllinesJ.NatBiotechnol,2002,20(9):933936.10StojkovcP,LakoM,StewartR,eta1.AnautogeneticfeedercellsystemthatefficientlysupportsgrowthofundifferentiatedhumanembryonicstemcellsJ.STEMCELLS,2005,23(3):306314.11YooSJ,YoonBS,KimJM.Efficientculturesystemforhumanembryonicstemcellsusingautologoushumanembryonicstemcell-.de-.rivedfeedercellsJ.Exp.Mo1.Med,2005.37(5):399407.12WangQ,FangZF.JinF.eta1.Derivationandgrowinghumanembryonicstemcellsonfeedersderivedfromthemselves.JSTEMCELLS,2005,23(9):12211227.13ChambersI,ColbyD,RobertsenM,eta1.FunctionalexpressioncloningofNanog,apluripotencysustainingfactorinembryonicstemcellsJ.CELL,2003,113(5):643655.14FangZF,JinF.GaiH.eta1.HumanembryonicstemcelllinesderivedfromtheChi