蒲黄总黄酮对3T3L1脂肪细胞过氧化物酶体增生物激活受体家族mRNA基因表达的影响.doc

蒲黄总黄酮对3T3L1脂肪细胞过氧化物酶体增生物激活受体家族mRNA基因表达的影响【摘要】 观察蒲黄总黄酮（Pollen Typhae total flavones, PTF）对脂肪细胞糖脂代谢和过氧化物酶体增生物激活受体（peroxisome proliferatoractivated receptor, PPAR）家族基因表达的影响，并分析其改善胰岛素抵抗的可能机制。方法：蒲黄总黄酮干预3T3L1脂肪细胞，实时定量荧光多聚酶联反应检测脂肪细胞分化相关基因PPAR家族，包括PPAR、PPAR和PPAR/ mRNA的表达。结果：蒲黄总黄酮可上调PPAR、PPAR mRNA的表达，下调PPAR/ mRNA的表达，与正常对照组比较，差异有统计学意义（P<0.01）。结论：蒲黄总黄酮可能通过提高3T3L1脂肪细胞PPAR和PPAR mRNA的表达改善胰岛素抵抗。 【关键词】 脂肪细胞 蒲黄总黄酮 游离脂肪酸 PPAR家族 Objective: To explore the effects of Pollen Typhae total flavones (PTF) on the mRNA expressions of peroxisome proliferatoractivated receptors (PPARs) , , / so as to analyze its possible mechanism in improving the insulin sensitivity of 3T3L1 adipocytes. Methods: Adipocytes were treated with PTF, and expressions of PPAR、PPAR、PPAR/ mRNAs relating to the adipocyte glucose and lipid metabolism were determined by reverse transcription polymerase chain reaction. Results: PTF obviously upregulated the expressions of PPAR and PPAR mRNAs, all showing significant differences as compared with those in the normal control group (P<0.01). Conclusion: With its function as an insulin sensitizer, PTF may enhance the PPAR and PPAR mRNA expressions in 3T3L1 adipocytes. Keywords: 3T3L1 adipocyte; Pollen Typhae total flavones; free fatty acid; peroxisome proliferatoractivated receptors 游离脂肪酸（free fatty acid, FFA）的溢出是早期胰岛素抵抗及其靶器官代谢异常的中心环节之一，也是近年来代谢领域研究的重点1。脂肪组织是机体能量调节器官，其脂肪代谢及糖代谢的异常在早期胰岛素抵抗发生发展中起着极其重要的作用。蒲黄是调节血脂的常用中药，对胰岛素抵抗亦有改善作用2。在临床上广泛应用于糖脂代谢异常的患者。本研究所在前期的细胞学实验中也发现蒲黄的有效成分蒲黄总黄酮（Pollen Typhae total flavones, PTF）可改善成熟脂肪细胞的葡萄糖消耗和游离脂肪酸的溢出3。本次研究通过观察蒲黄总黄酮对3T3L1脂肪细胞过氧化物酶体增生物激活受体（peroxisome proliferatoractivated receptor, PPAR）家族基因表达的影响，进一步探讨蒲黄总黄酮改善胰岛素抵抗的机制。 1 材料与方法 1.1 药物和试剂 罗格列酮（rosiglitazone，ROS）由浙江天马制药有限公司提供；蒲黄总黄酮由上海信谊药业有限公司提供；达尔伯克改良伊格尔培养基（Dulbeccos modified Eagles medium, DMEM）和TRIzol由GIBCO公司提供；地塞米松、异丁基甲基黄嘌呤和胰岛素购自Sigma公司；油红O购自Sigma公司；牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA)为SinoAmerican Biotech公司产品；逆转录酶AMV第一链cDNA合成试剂盒为BioBasic公司产品；聚合酶链式反应（polymerase chain reaction, PCR）扩增试剂盒购自Invitrogen公司。 1.2 细胞培养及分组 3T3L1细胞株购自America Type Culture Collection公司，其培养与诱导分化方法同文献4。将3T3L1前脂肪细胞接种于培养板，用含10%小牛血清的高糖DMEM培养，待细胞融合2 d后，加含0.5 mmol/L异丁基甲基黄嘌呤、0.25 nmol/L地塞米松和10 g/ml胰岛素的10%胎牛血清高糖DMEM培养48 h，换以含10 g/ml胰岛素的含10%胎牛血清培养液再培养48 h，随后以10%胎牛血清高糖DMEM继续培养，2 d换培养液1次，诱导分化812 d，3T3L1细胞90%呈脂肪细胞表型1。将24孔培养板中分化成熟的脂肪细胞以含0.2% BSA的DMEM培养基培养12 h后，分为空白对照组（不加药）、蒲黄总黄酮组（0.2 g/L）和罗格列酮组（5 mol/L），药物均使用去离子水配置，药物干预培养24 h。 1.3 PPAR mRNA表达 采用实时定量PCR法检测。药物处理同上，抽提细胞总RNA，以AMV第一链cDNA合成试剂盒逆转录为cDNA。上下游引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。PPAR上游引物：5TTT CAA GGG TGC CAG TTT CG3；下游引物：5GGG AGG CCA GCA TCG TGT A3。PPAR上游引物：5TAC GGC AAT GGC TTT ATC AC3；下游引物：5CCC TCC TGC AAC TTC TCA AT3。PPAR/上游引物：5TGC GGC AAC GTG AAA GGA AT3；下游引物：5ACG CGG TAT CCA CGT CAA GTA3。看家基因甘油醛3磷酸脱氢酶（glyceraldehyde3phosphate dehydrogenase, GAPDH）上游引物：5AAG GTC GGA GTC AAC GGA TT3；下游引物：5CTG GAA GAT GGT GAT GGG ATT3。参照试剂盒说明书，反应体系为25 l，内含5PCR Buffer 5.0 l，Mg2+ 0.3 l，dNTP 0.75 l，引物1.0 l，25SYBR Green1.0 l，校准液 1.0 l，ExTaq酶0.25 l，ddH2O 14.7 l，模板1.0 l。实时定量PCR反应在Cotbett RotoGene 3000实时定量PCR仪中进行。反应程序为：95 预变性10 s，60 (GAPDH)退火30 s，55 延伸10 s，共80个循环，每个循环结束后采集荧光信号。最后绘溶解曲线以确定反应产物无引物二聚体及非特异性扩增。当荧光信号强度超过基线时，其域值循环数（cycle threshold，Ct）被记录下来。在实时定量PCR中，Ct值被认为与被扩增基因的初始浓度密切相关。扩增后根据Ct值及标准曲线计算出目的基因拷贝数与106 GAPDH的相对值。 1.4 统计学方法 采用SPSS 11.0 for Windows统计软件对实验结果进行统计分析，组间比较采用单因素方差分析，计量资料数据用xs表示。 2 结 果 蒲黄总黄酮组3T3L1细胞PPAR、PPAR mRNA表达量均明显高于正常对照组，差异有统计学意义（P<0.01），但低于罗格列酮组，差异亦有统计学意义（P<0.01）。蒲黄总黄酮组3T3L1细胞PPAR/ mRNA表达量低于正常对照组和罗格列酮组（P<0.01）。见表1。表1 3T3L1脂肪细胞PPAR、PPAR和PPAR/ mRNA表达 3 讨 论 脂肪代谢的改变及其对糖代谢异常的影响在早期胰岛素抵抗的中心作用一直是国内外研究的热点。研究药物对脂肪细胞糖脂代谢的影响，对于防治与胰岛素抵抗密切相关的2型糖尿病、血脂异常、脂肪肝和动脉粥样硬化等代谢性疾病的发病及减轻其危害具有重要意义。近年来FFA在胰岛素抵抗的发生发展中的核心作用正成为倍受关注的研究热点。前期研究已经证实，蒲黄总黄酮可直接抑制成熟3T3L1脂肪细胞FFA的外溢，同时可改善脂肪细胞对葡萄糖的摄取和利用，提示蒲黄总黄酮可改善脂肪及葡萄糖代谢，由此对胰岛素抵抗特别是早期胰岛素抵抗有一定的改善作用3。 PPARs属激素核受体超家族成员，由PPAR、PPAR、PPAR/ 3个亚型组成。其中，PPAR在脂质代谢中起着关键的调节作用5。PPAR活化可以调节与脂肪酸氧化有关的基因的转录，参与脂质代谢、能量动态平衡和胰岛素敏感性等生物学过程的调节等。PPAR最具脂肪组织特异性，对脂肪细胞的分化起着重要作用6，并在一定程度上抑制脂肪组织分泌TNF等脂肪细胞因子，有利于改善胰岛素抵抗7。PPAR/近年才受到广泛关注，也被发现与脂肪生成和脂质代谢调节有密切关系8。大量研究表明，PPARs的调节剂有望成为2型糖尿病、肥胖、高脂血症和动脉粥样硬化等疾病的治疗药物。PPAR的激动剂贝丁酸和PPAR的激动剂噻唑烷二酮类（thiazolidinediones, TZD）药物，已被临床成功用作降脂药和胰岛素增敏剂。PPAR/的激动剂可能会通过对骨骼肌的作用而成为另一个新型胰岛素增敏及降脂药物。因为3种PPAR亚型在代谢综合征的发病中作用不完全相同，所以近来的研究集中于开发一种全新的药物，使其要么具有更高的选择性，要么具有两个或全部PPAR活化特性。PPAR/PPAR激动剂tesaglitazar就被认为可改善脂肪餐后的糖脂代谢9。 TZD类药物罗格列酮是目前治疗胰岛素抵抗的代表药物，它促进PPAR表达增加和脂肪细胞的分化，促进葡萄糖转运，增加脂肪组织胰岛素敏感性，但却有肥胖等脂质积聚的副作用6。我们的实验结果表明蒲黄总黄酮可提高PPAR和PPAR mRNA的表达，说明它能在一定程度上改善胰岛素抵抗引起的糖脂代谢紊乱。而且蒲黄总