流式细胞术基本原理PPT课件.pptx

流式细胞术 原理 操作及应用 1 教学参考书 实用流式细胞术彩色图谱 王树奎 周振英主编 2004 4临床流式细胞分析 王建中主编 上海科学技术出版社 2005 8流式细胞术原理与应用教程 吴后男编 北京大学医学出版社 2008 2实用流式细胞术 血液病篇 刘艳荣主编 北京大学医学出版社 2010 9流式细胞术 陈朱波 曹雪涛编 科学出版社 2010 10 2 主要内容 一 流式细胞仪结构和原理流式细胞术简介流式细胞仪的结构组成流式细胞仪的光信号检测流式细胞术数据的存贮 显示与分析流式分选二 流式细胞术操作与技巧三 流式细胞术在生物医学中的应用 3 1 1流式细胞术简介 流式细胞术 FlowCytometry FCM 是以流式细胞仪为检测手段的一项能快速 精确的对单个细胞 或生物学颗粒 的理化特性进行多参数定量分析和分选的技术 流式细胞仪 FlowCytometer 是集细胞与分子生物学 流体力学 激光技术 光电子技术 计算机技术 细胞荧光化学技术 单克隆抗体技术为一体的一种新型高科技仪器 4 流式细胞术的特点 检测对象 单细胞悬液或生物颗粒 检测参数 多参数 检测特点 单细胞水平分析 检测速度 高速 最高达上万个细胞 秒 检测结果 精度高 准确性好 可对目标细胞进行分选 5 流式 单个细胞分析 收集每个细胞的数据 更精准 WB 群体分析 得到多个细胞的平均值 6 流式细胞仪的发展及商品化 1934Moldavanl Firsttry 固定式细胞分析 流动式 1953Crosland Taylor 鞘流系统 解决难题 1956Coulter原理 血细胞计数器 1965Kamentsky 分光光度计定量细胞成分和散射光应用 1967Kamentsky等设计了细胞分选的装置 1969Vandilla等 第一台荧光检测细胞计 鞘流聚焦 激光 1972斯坦福大学 研制出荧光激活细胞分选仪 FACS 1973BD公司与斯坦福大学合作 研制生产第一台商用流式细胞仪 FACS 1975Kohler和Milstein 单克隆抗体技术 促进流式发展 7 1979年国家科委重点项目 研制国内第一台激光流式细胞仪 1982年国内第一台三参数激光流式细胞仪诞生 1984年国家科委组织科研成果的鉴定验收 1985年获国家卫生部科技成果乙等奖 1985年 1990年灵敏度 信噪比 更多参数 流式分选仪研制开发 计算机四参数软件 样品制备 医学生物学应用 8 流式细胞仪的分类 分析型流式细胞仪细胞样本分析后最终进入废液桶 不能回收利用 分选型流式细胞仪既能流式分析 还能对分析的目的细胞进行分选 进样管道较长 还需要保持无菌状态 所以分选型流式细胞仪一般只用于分选 9 BD公司分析型流式细胞仪 FACSCalibur双激光四色 市场覆盖率最高 LSRII双激光六色 三激光八色 四激光十色 分析型最高配 FACSCantoII双激光六色 三激光八色 FACSVerse双激光六色 三激光八色 10 BD公司分选型流式细胞仪 FACSVantageSE FACSAriaIII Influx 11 BeckmanCoulter流式细胞仪 EpicsXL单激光四色 市场覆盖率高 分析型 CyAn三激光九色 分析型 FC500单激光或双激光五色 市场覆盖率高 分析型 Gallios三激光十色 分析型 MoFloXDP高端分选型 12 1 2流式细胞仪的结构组成 液流系统流动室液流驱动系统光学系统激发光源光束收集系统电子系统光电转换器数据处理系统细胞分选系统喷嘴电偏转板样本收集器 13 1 2 1液流系统 鞘流技术 根据层流原理发展起来的技术 可以实现两种液体的同轴流动 样本细胞流位于轴心稳定流动 外面包裹有鞘液 sheath 流体动力学聚焦 稳定的液流从截面积较大的部分流入截面积较小的部分后 有一个聚焦收缩作用 细胞流直径被约束在10 20um 避免了多个细胞重叠进入检测区 鞘液 鞘液 细胞流 激光照射点 流体动力学聚焦示意图 14 一 流动室和液流驱动系统 流动室 flowcell flowchamber 是流式细胞仪的核心部件 流动室中 被测细胞逐个通过 并在此与激光正交 流动室结构图 单细胞发生器 15 液流驱动系统 16 二 进样速率控制 通过改变样本压力可以调节样本的进样速率 而这并不是提高样本流的流速 而是改变了细胞之间的距离 高速时样本流变宽 单位时间内流经激光照射区的细胞数就增加 这样会导致变异系数增加 17 1 2 2光学系统 一 激发光源 激光器气体激光器 氩离子 488nm 355nm 氦氖 633nm 氪离子 647nm 氪氩 568nm 染料激光器 如氩离子激光泵浦的Rhodomin6G水溶液染料激光器 发出550 650nm可变波长激发光 半导体激光器 价格低 结构简单 寿命长 BD的FACSCalibur已采用635nm半导体激光器 激光特点 单波长 高能量 小发射角 高稳定性光照 现在仪器常配有仪器选配2 4根激光器 波长多为488nm 633nm和355nm 405nmUV 18 二 光束成行系统 19 FCM的单细胞照明技术 这种椭圆形光斑的检测区保证样本中的细胞是一个一个分别受到最大光照 细胞流动方向 20 三 光收集系统 滤光片的组成长通滤片 LP 只允许特定波长以上的光束通过 短通滤片 SP 只允许特定波长以下的光束通过 带通滤片 BP 只允许一定波长范围内的光束通过 21 22 FACSCalibur流式细胞仪信号检测系统 透射光路 23 全反射光路 FACSAria流式细胞仪器信号检测系统 PE Cy7 PerCP Cy5 5 PE TexasRed PE FITC SSC 24 1 2 3电子系统 光电检测器将光信号转换成电子信号 前置放大电路将信号等比例放大 输出电脉冲信号 模数转换器将模拟的电脉冲信号转换成数字信号 数据处理系统计算机系统数据采集 分析 25 一 光电检测器 photodetector 光电二极管 photodiode 光灵敏度低 测定强信号 FSC 光电倍增管 photomultiplier PMT 光灵敏度高 测定弱信号 SSC FL1 FL2 FL3 FL4 26 二 电信号两种放大方式 由于光信号比较弱 需将其等比例放大 方便计算机分析处理 一般信号的放大可以使用线性或对数两种方式 线性 linear lin 对数 logarithmic log 一般FSC和SSC变异范围较小 故使用线性放大 荧光信号变异范围较大 多使用对数放大 27 三 电脉冲信号的面积A 高度H和宽度W CreationofaVoltagePulse QuantificationofaVoltagePulse Width Area Height 28 29 通道 channel 一个光电检测器就是一个通道 有多少个光电二极管 倍增管 就有多少个通道 散射光通道 FSC通道和SSC通道 荧光通道通道命名方式 以FL fluorescence 加数字命名 如FL1 FL2 FL3等 以该通道接收的主要荧光素命名 如FITC通道 PE通道 APC通道等 Forexample FACSCalibur有488nm和633nm两根激光器 488nm能检测FSC SSC FL1 FITC FL2 PE FL3 PerCP 635能检测FL4 APC 代表Calibur有6个通道 最多能同时检测4个荧光 6种参数 30 1 3流式细胞术光信号检测 光信号的类型散射光信号 与标记荧光素无关 是细胞的固有参数 前向散射光 forwardscatter FSC 侧向散射光 sidescatter SSC 荧光信号自发荧光 微弱特异荧光 标记的荧光素分子发出的荧光 比自发荧光强很多倍 31 1 3 1散射光信号 一 前向散射光FSCFSC信号方向与激光束平行 偏离度一般在1 6度范围内 亦称小角度散射光 主要反映被测细胞的体积大小和活力 32 二 侧向散射光SSC SSC方向与激光束和液流形成的平面相垂直 亦称90度散射光 其信号强度反映细胞内部颗粒度和精细结构的变化 33 三 散射光的作用 实验中 常利用FSC和SSC这两种参数的组合 区分不同的细胞群体 去除碎片 死细胞和粘连细胞的干扰 粒细胞 单核细胞 淋巴细胞 红细胞 死细胞和碎片 34 死细胞或碎片 粘连细胞 肿瘤细胞株FSC SSC散点图 死细胞 加药处理后FSC SSC散点图 通过FSC SSC散点图 gate出目标细胞进行分析 35 三 阈值Threshold 阈值 溶液中的杂质或者死细胞 很容易产生微小的干扰信号 所以必须设置阈值 排除杂质 细胞碎片或体积较小的死细胞 FSC反映细胞体积的大小 FCM应用时常选取FSC设定阈值 5 32 默认阈值 升高阈值后 36 1 3 2荧光信号 一 荧光 物质中的电子吸收光的能量由低能状态转变为高能状态 再回到低能状态时释放出的光 发射波长 荧光波长 Emissionwavelength 激发波长Excitationwavelength 37 二 常用荧光素 499nm蓝色荧光 Blue 500 549nm 绿色荧光 Green 550 584nm 黄色荧光 Yellow 585 615nm 橙色荧光 Orange 616 700nm 红色荧光 Red 700nm 远红外荧光 Far Red 标记抗体的荧光素 38 核酸荧光染料PI 碘化丙啶535 623 可选择性的插入核酸双螺旋碱基对中 常用于DNA分析 需要用RNase处理细胞排除RNA对DNA荧光定量的影响 PI不能透过活细胞膜 常用于鉴定死细胞 7 AAD 7 氨基放线菌素D545 647 以插入的方式与DNA链的G C碱基对结合 不能透过活细胞膜 常用于鉴定死细胞 DAPI 4 4 6 二脒基二苯基吲哚358 456 可以非嵌入方式与DNA链上的A T碱基对特异性结合 变异系数明显小于其他染料 一种理想的DNA定量染料 Hoechst 343 450 常见为Hoechst33342和Hoechst33258 非嵌入的方式与DNA链上的A T碱基对结合 能对活细胞染色 用于活细胞DNA定量分析 如精子分选 还用于侧群细胞的分选 PY 派若宁560 573 RNA染料 能进入活细胞 AO 吖啶橙509 525 DNA RNA染料 染色后DNA呈黄绿色荧光 RNA呈橙黄色荧光 可进行DNA RNA双参数分析 39 其他常用荧光染料 40 三 荧光抗体的选择 A根据流式细胞仪选择抗体流式细胞仪能检测的通道数 由激光器种类 数量和使用的光学滤片决定 如FACSCalibur 多色标记荧光素搭配原则 每个通道只能选择一种荧光素 各个通道之间的荧光素可以随意搭配 FACSCalibur常用四色搭配 FITC PE PerCP APC 41 三 荧光抗体的选择 本实验室的FACSCantoII配置两根激光器激发六色荧光 第一激光器 488nm蓝色固态激光器激发四色 第二激光器 633nm红色氦氖激光器激发二色 荧光滤片 488nm激光 530 30nm 585 42nm 695 40nm 780 60nm633nm激光 660 20nm 780 60nm总共可以检测6色荧光可选择的荧光如下 带通滤片 530 30nm 代表允许530nm 15nm波长 515 545nm 的光通过 42 B根据抗原表达强弱合理选择抗体不同的荧光素强度有所不同 高表达的抗原可用不太 亮 的染料 更 亮 的荧光素分配给表达低的抗原 CD4 FITC CD25 APC Foxp3 PE C选择荧光波谱间光谱重叠较小的荧光染料进行组合 同时需要正确的调节补偿 CD5 43 1 4FCM数据存储 显示与分析 标准的FCM数据采用列表模式 listmode 记录了每个细胞的所有参数的信息 每个细胞检测5个参数 那么获取10000个细胞 容量为5 10000 字或双字 44 FCM数据显示方式 单参数直方图 Histogram 双参数数据显示 散点图 DotPlot 伪彩图 Pseudo colorPlot 等高线图 ContourPlot 密度图 DensityPlot 假三维图 Pseudo3DPlot 三维图 3DPlot 常用分析软件CellQuestDivaFlowJOWinMDIFCSExpress 45 直方图Histogram 细胞的某一单参数数据的统计分布图 横坐标表示荧光信号或散射光信号相对强度的值 单位是道数 纵坐标一般是细胞数 Counts FITC荧光强度 46 横坐标既可以是线性的 也可以是对数的 DNA倍体分析 抗原表达分析 Overlay图 47 散点图 散点图中每个点代表一个细胞 X轴与Y轴分别代表一种参数 优点是比直方图直观 48 散点图和伪彩图 49 等高图和密度图 等高图 类似于地图中的等高线 同一条线上的细胞数目相等 越在里面的曲线代表细胞数目越多 密度图 点密度越大的地方细胞越多 点密度越小的地方细胞少 50 假三维图和三维图 51 设门与数据分析 门 Gate 简写G 是流式细胞术中的一个重要术语 FCM数据分析过程实际上就是选门和设门的过程 椭圆形 圆形 52 矩形 任意形状 R Region 区域 门可以是单一区域 G R1 也可以是几个区域组合在一起 G R1andR2 G R1orR2 G R1notR2 53 十字门 线性门 54 1 5流式分选 电荷式分选超声振动器 15 100kHz 液流充电系统高压偏转板收集装置 流式管 培养板 lasers 断裂点 充电 高压偏转板 55 四路分选原理 电荷式分选装置 56 液滴延迟 在含有分选细胞的液滴上准确加电是有效分选的关键 但是细胞经过检测区 激光照射点 到加电位置 断裂点 有一个时间差 这称为液滴延迟 dropdelay 延迟时间直接影响着分选纯度 准确测定延迟时间是一个重要步骤 液滴延迟 照射点 57 分选指标 分选速度 分选纯度和分选收获率 相互影响 分选时间由三方面决定 进样速度 目标细胞所占比例 需要收集的细胞数 分选时间表 机器流速10000个 s时 58 分选纯度指被分选出来的细胞所占的百分比 一般能达99 以上 分选收获率是指被分选出的细胞与原来总细胞的百分比 分选纯度和收获率永远是相互矛盾的 纯度提高 收获率降低 反之亦然 富集模式 enrichmode 纯化模式 purifymode 单细胞模式 singlecellmode 59 流式分选和磁珠分选 FACS Fluorescence ActivatedCellSorting 流式分选MACS Magnetic ActivatedCellSorting 磁珠分选 磁性标记 未标记的细胞先行流出 洗脱阳性细胞 阳性分选策略 60 流式分选与磁珠分选比较 流式分选结合磁珠分选的方法 常应用于分选低比例细胞群 如分选调节性T细胞CD4 CD25 CD127low 先用磁珠分选纯化CD4 T细胞 再用流式分选的方法分选CD4 CD25 CD127low调节性T细胞 61 二 流式细胞术操作与技巧 流式细胞术操作流程 62 2 1单细胞悬液制备2 2免疫荧光标记2 3对照的设置2 4光谱重叠与补偿 63 2 1单细胞悬液制备 2 1 1新鲜实体组织的样本制备对于不同组织来源的实体组织和实体瘤标本 应该根据各自特点选择不同的分散细胞方法 以期达到单细胞产量高 损伤小的目的 常用方法有 酶消化法机械法化学试剂处理法 64 酶消化法 根据分散组织类型来确定使用的酶类 胰蛋白酶 水解酯键 肽键 胶原酶 降解几种分子类型的胶原 溶菌酶 水解糖蛋白 肽的糖苷键 弹性蛋白酶 消化糖蛋白 弹性蛋白的纤维 将新鲜组织置于离心管中 加入1 2ml酶消化20 30min 恒温37 或室温 间断振荡或吹打 终止消化 收集细胞悬液 300目尼龙网过滤 除去细胞团块 低速离心除去细胞碎片 将制备好的单细胞悬液进行荧光标记或保存备用 注意 酶的使用浓度 温度 消化时间 酶活性的pH值 65 机械法特点 易造成细胞碎片和团块 实际操作时 应注意碎片和团块的去除 常与其他方法 如酶消化法 配合使用 组织解离器 机械法 有剪碎法 网搓法 研磨法等 利用机械方法 物理方法给予组织交大的压力 使细胞从组织间分散开来 66 化学处理法 作用原理 将组织细胞间起黏着作用的钙 镁离子置换出来 从而使细胞分散开来 常用试剂有EDTA EGTA TPB等 EDTA是一种螯合剂 可以和组织间的钙 镁离子形成螯合物 实际运用中常采用螯合物加酶法 主要是胰蛋白酶 特点 用化学法细胞存活率低 细胞产额低 细胞碎片和聚集量不稳定 67 机械法往往造成严重的细胞损伤 而结果却是较低的细胞产量 注意去除细胞碎片和团块以免影响FCM结果 如低速离心去碎片 尼龙网过滤团块等 酶消化法 化学试剂处理法对实体组织的分散效果较理想 但会造成所测化学成分的不良影响 根据实验目的去选择合适的单细胞悬液制备方法 最终要求细胞呈单个分散状态 细胞碎片 团块尽量少 细胞活性不受到明显损伤 保证下一步荧光染色 68 2 1 2石蜡包埋组织样本制备 切片 将石蜡组织切成50um厚的组织片4 5片 放入1试管中 脱脂 加入二甲苯3 5ml脱脂 室温下1 2天 脱净后弃二甲苯 水化 依次加入100 95 70 50 梯度乙醇5ml 每步10min 去乙醇后加入蒸馏水3 5ml 3 5min后弃水 消化 加入5ml0 5 胃蛋白酶 pH1 5 2 0 37 恒温水浴30min 每隔5 10min振荡一次 终止消化 加冷的PBS或生理盐水终止消化 过滤 用300目尼龙网过滤 未消化好的组织可做第二次消化 收集细胞悬液 将过滤液离心沉淀 再用PBS漂洗1 2次 低速离心沉淀去除碎片 根据实验目的标记荧光抗体 或保存细胞备用 69 2 1 3血液 骨髓样本制备 外周血单个核细胞PBMC的分离 注意 由于多核粒细胞比较大 粒细胞沉降在红细胞层 所以该法不适合粒细胞研究 该法操作过程中可能丢失一些有意义的细胞或细胞亚群 所以临床上一般不主张分离血液或骨髓的单个核细胞 70 红细胞裂解液去除红细胞原理 红细胞裂解液成分为低渗的NH4Cl溶液 利用双凹型的红细胞膜抗性差 白细胞膜抗性比较好的特点 加入低渗透压的红细胞裂解液时 红细胞膜胀破 而白细胞膜不受影响 从而达到去除红细胞的目的 溶血 免洗 lyse nowash 技术临床上应用溶血 免洗技术 既简化了操作步骤 又避免了洗涤过程中可能造成的某些亚群细胞的丢失 尤其在检测严重污染性标本时 避免了因离心等处理可能导致气溶胶产生引起病毒感染的可能 71 2 1 4培养细胞单细胞悬液制备 2 1 5体液脱落细胞样本制备 悬浮生长细胞 吸管反复吹打 贴壁生长细胞 消化处理 离心获得单细胞悬液 洗脱液尿液胸腹水 离心收集细胞 用生理盐水或PBS洗涤3次 300目尼龙膜过滤后离心沉淀去上清 单细胞悬液 72 FCM可检测下列细胞成分 表面标记物胞浆标记物核内标记物可溶性成分 2 2免疫荧光染色 73 荧光素偶联抗体抗体上偶联荧光素 FITC PE等 通过抗原抗体反应让目标细胞特异性的带上荧光 染色过程即抗原抗体反应过程 荧光染料 荧光化合物PI DAPI等插入核酸链中 CFSE和蛋白质共价结合 AnnexinV FITC检测凋亡 荧光蛋白如GFP 不需要染色 直接检测 74 免疫荧光染色主要包括直接和间接免疫荧光染色两种方法 间接标记的方法难以进行多色标记 而且操作复杂 信噪比高 所以一般首先直标荧光抗体 荧光抗体 荧光二抗 第一抗体 直接标记 间接标记 75 一般检测时 获取1 2万个细胞 标记0 5 1 106细胞即可 下述情况细胞量需相应增加 检测胞内 核内抗原 离心次数多 细胞周期乙醇固定损失细胞多 检测细胞在标本中比例低 0 5 1 106个细胞 孵育体积50 100ul 上机体积200 500ul终浓度约1 106个 ml 加染料 洗涤后补加液体 细胞表面抗原标记 76 表面抗原分析是流式应用中最广泛的 标记步骤也相对简单 标记 取0 5 1 106细胞 加入适量抗体 根据抗体说明书 充分混匀后 总体积50 100ul 4 避光孵育10 30min 洗涤 加入1mlPBS洗液 300g离心洗涤5min 上机检测 弃去上清后加入200 500ulPBS 重悬细胞后立即上机检测 如不能及时上机检测 则加入同样体积的1 多聚甲醛 混匀后置于4 冰箱内保存 一般不超过24h 77 胞内抗原荧光标记 细胞内抗原 如MPO 核内抗原 如FoxP3 细胞内细胞因子 胞内因子 IFN r IL 4 IL 17等 固定 4 多聚甲醛破膜 透化0 05 皂素 saponin 0 01 TritonX 10070 乙醇 78 膜表面抗原染色 分别加入相应的荧光素标记抗体和适量细胞标本 充分混匀后避光孵育10 30min 洗涤 加1mlPBS洗液 300g离心5min 固定 去上清后加入500ul4 多聚甲醛 固定20min 透化 离心洗去固定剂后 加皂素500ul 透化10min 胞内抗原染色 离心洗去透化液后 加入相应荧光素标记抗体 混匀后室温避光孵育30min 洗涤 加1mlPBS