蒲公英多糖的超滤分离及其清除自由基的作用研究.doc

蒲公英多糖的超滤分离及其清除自由基的作用研究 作者：杨晓杰，陈静，程加春，李学花【摘要】 目的研究蒲公英多糖的超滤分离和自由基的清除作用。方法采用不同孔径的超滤膜分离蒲公英多糖，用Fenton反应体系和邻苯三酚自氧化法测定对羟自由基和超氧阴离子的清除作用。结果超滤分离得到蒲公英多糖3个组分，测定了组分DP1和DP2对自由基的清除作用，两组分对羟自由基清除作用强，且DP1高于DP2；两组分清除超氧阴离子的效果不明显，DP1略高于DP2。结论超滤膜能较好地分离蒲公英多糖，其中DP2组分多糖含量较高，占53.71%。DP1和DP2组分均能清除羟自由基和超氧阴离子，对羟自由基清除能力较强，且DP2高于DP1，当浓度达到5 mg/ml时，DP2的清除率达到61.21%。 【关键词】 蒲公英多糖； 超滤分离； 羟自由基； 超氧阴离子Abstract：ObjectiveTo research on the ability to scavenge free radical of dandelion polysaccharide by ultrafiltration separation.MethodsDandelion polysaccharide were ultrafiltrated by ultrafiltration membrane of different aperture,and the scavenging effect on hydroxyl free radical and superoxide anion free radical were determined by Fenton system and the pyrogallol autoxidation method.ResultsThree parts were obtained by ultrafiltration membrane.The ability to scavenge free radical of DP1 and DP2 were determined.Two parts could scavenge hydroxyl free radical powerfully and DP2 had stronger activity than DP1.But the ability to scavange superoxide anion free radical of dandelion polyscccharide was not obvious,DP1 had slightly stronger activity than DP2.ConclusionDandelion polyscccharide can be well separated by ultrafiltration membrane.DP2 has higher polysaccharide content accounting for 53.71%.Hydroxyl free radical and superoxide anion free radical can be scavenged with DP1 and DP2,but the ability is more powerful to scavenge hydroxyl free radical and DP2 is better than DP1.Activity rate of DP2 is up to 61.2%,when the concentration of polyscccharide is up to 5 mg/ml.Key words：Dandelion polysaccharide; Ultrafiltration separation; Hydroxyl free radicals; Superoxide anion free radicals 多糖具有广泛的药理作用，如作为免疫调节剂,激活巨噬细胞、T淋巴细胞、LAK细胞等多种免疫细胞，促进细胞因子生成,活化补体，可抗肿瘤、抗病毒、抗感染、抗消化性溃疡、抗氧化、防衰老、降血糖血脂等,而且毒性相对较低,因此,越来越受到研究人员的重视1。超滤作为一种新型的分离技术，用于多糖、酶等活性物质的分离与纯化，收率高且极少破坏，是当前天然多糖分离研究中十分活跃的领域2。蒲公英Taraxacum mongolicum是菊科舌状花亚科多年生草本,全草均可入药,有清热解毒、止痛散淤等功效,是中医临床上常用的中草药。蒲公英根、叶、花3种器官的多糖都有一定的清除自由基的活性3。本文主要通过超滤分离将蒲公英根多糖分为两个组分，研究并对比了其清除羟自由基和超氧阴离子的活性。1 材料与仪器1.1 材料蒲公英，采自黑龙江省五大连池市。1.2 器材UEIP503、UEOS503型中空纤维膜组件，752N紫外可见分光光度计。2 方法2.1 多糖提取工艺流程蒲公英根干粉热水浸提离心分离微滤超滤分离乙醇沉淀脱蛋白真空干燥蒲公英粗多糖。2.2 超滤及其预处理浸提液在超滤前用0.45 m微滤膜除去粗提液中的固形物以降低对超滤膜的污染。控制超滤压力为0.08 MPa，将蒲公英多糖的浸提液先用孔径10 KDa的超滤膜进行超滤处理。滤过液继续采用6KDa的超滤膜进行超滤处理，分别测定10 KDa超滤膜的截留液、6 KDa超滤膜的截留液、6 KDa超滤膜的滤过液中的总糖、还原糖含量，计算各部分多糖含量，分析蒲公英多糖的大致分子量分布情况。图1显示了各部分的比例和含量。2.3 多糖含量的测定总糖含量的测定采用蒽酮浓硫酸法4；还原糖含量的测定采用3,5二硝基水杨酸比色法4，5。 多糖含量=总糖含量-还原糖含量62.4 蛋白含量的检测蒲公英粗多糖溶液经木瓜蛋白酶和三氯乙酸（TCA）脱蛋白后，测定其在260 nm和280 nm处的吸光值7。2.5 多糖清除OH的测定清除OH试验的方法：采用Fenton反应体系8。清除率E(%)计算公式为： E(%)=A0(AxAi)/A0 100% 式中：A0为空白对照液的吸光度；Ax为加入多糖溶液后的吸光度；Ai为不加显色剂H2O2 多糖溶液的本底的吸光度。2.6 多糖清除O2-的测定多糖清除O2-的试验采用邻苯三酚自氧化法9。清除率E(%)计算公式为： E(%)=(A对照A样品)/(A对照A空白) 式中：A空白空白组的吸光度；A对照为对照组的吸光度；A样品为多糖液的吸光度。3 结果3.1 蒲公英多糖的分子量分布称取30 g蒲公英根粉末加入30倍的水80浸提两次，3 h/次。浸提液经抽滤后加水定容至1 500 ml。浸提液中总糖含量为2.14 mg/ml,还原糖的含量为0.31 mg/ml,多糖含量为1.83 mg/ml。根据上述超滤方法得到蒲公英多糖不同组分多糖分布如图1所示。由图1可知，蒲公英多糖分子量大于10 KDa(DP1)占蒲公英多糖的35.50%，分子量在6 KDa与10 KDa之间(DP2)占蒲公英多糖的53.71%，而分子量小于6 KDa(DP3)只占蒲公英多糖的10.79%。本实验采用多糖分布量较大两个部分DP1 、DP2继续研究它们的清除自由基的活性，DP1 、DP2经木瓜蛋白酶和TCA脱蛋白后在260 nm和280 nm处检测无明显吸收。3.2 蒲公英多糖清除OH的作用分别配5 mg/ml DP1、DP2溶液，根据Fenton反应，其对OH的清除率见表1及图2。由表1、图2可知，蒲公英多糖DP1、 DP2对OH有清除作用，并随着多糖加入量的增加清除率上升，即清除率与多糖的用量之间存在一定的量-效关系。其中DP2的清除率高于DP1，当浓度达到5 mg/ml时 DP2的清除率达到61.21%而DP1为49.78%。表1 不同组分多糖对OH的清除率（略）3.3 蒲公英多糖清除O2-的作用根据邻苯三酚自氧化法，蒲公英多糖DP1、DP2清除O2-的作用见表2、图3所示。表2 不同组分多糖对O2-的清除率（略）由表2、图3可知，蒲公英多糖DP1、 DP2对O2-具有一定的清除作用，并随着用量的增加清除率逐渐上升但清除能力不如对OH明显。这两个组分中DP1的清除能力略高于DP2，当浓度达到2.5 mg/ml的时DP1清除率为14.65%略高于DP2的13.14%。4 结论 目前人们已经提出各种学说来解释机体的衰老、疾病等生理现象，如自由基学说、免疫功能下降学说、生物膜衰老学说、代谢失调学说等，其中被人们普遍接受的是氧自由基学说，最能解释机体衰老、生病的机理。研究表明，毒性氧离子包括O2-，H2O2OH等，这些毒性氧自由基能够使细胞膜脂质过氧化，增强细胞膜通透性，使细胞内容物流出，同时还损伤蛋白质和DNA。本文通过对蒲公英粗多糖超滤分离后，可得到3个组分即DP1、DP2H DP3，其中DP2多糖含量最高，占蒲公英多糖含量的53.71%，对两个含多糖较多的主要组分DP1和DP2清除羟自由基和超氧阴离子的能力进行了初步研究，显示两组分均能