柠檬酸摇瓶发酵及提取by_LeMon

柠檬酸摇瓶发酵及提取 生技08 2班L3eMon小组廖维华刘露刘豫宁麻佳佳 实验目的 1 学习掌握柠檬酸液体发酵工艺2 了解柠檬酸提取工艺3 增强团队协作能力 柠檬酸 C6H8O7物化性质 白色结晶粉末 无臭 熔点 153 味极酸 在潮湿的空气中微有潮解性 它可以以无水合物或者一水合物的形式存在 柠檬酸从热水中结晶时 生成无水合物 在冷水中结晶则生成一水合物 加热到78 时一水合物会分解得到无水合物 加热至175 C时它会分解产生二氧化碳和水 剩余一些白色晶体 所以 柠檬酸提取过程中 温度控制很重要 分子式 实验原理 高度亲水性 实验原理 柠檬酸发酵为典型的有机酸发酵 淀粉质原料经淀粉酶作用水解为葡萄糖 葡萄糖经EMP途径氧化为丙酮酸 丙酮酸进一步被氧化脱羟生成乙酰CoA 就一般能量代谢过程而言 生成的乙酰CoA与草酰乙酸缩合成柠檬酸后进入三羟酸循环 通过三羟酸循环进行有氧呼吸的能量代谢 但就柠檬酸产生菌 黑曲霉菌 而言 在实验pH下 其顺乌头酸酶和异柠檬酸脱氢酶活性很低 而柠檬酸合成酶的活性很高 因而大量积累柠檬酸 柠檬酸的发酵的过程 80 的糖代谢走EMP途径 黑曲霉中存在TCA的酶系 柠檬酸发酵的条件1 合适的碳源 淀粉 麦芽糖 甘露糖等 高浓度的糖 2 合适的pH值 黑曲霉在pH为2 3的环境中发酵糖 产物以柠檬酸为主 当pH接近中性时则大量产生草酸 而柠檬酸产量很低 3 发酵液中溶氧量要高 摇床的转速200r min 生产菌种 黑曲霉Aspergillusniger半知菌亚门 丝胞纲 丝孢目 丛梗孢科 曲霉属 真菌中的一个常见种 生长适温37 最低相对湿度为88 柠檬酸产量最高的菌种 且能利用多样化的碳源 生产方法 深层液体发酵法发酵周期短 产率高 节省劳动力 占地面积小 便于实现仪表控制和连续化 实验流程斜面发酵培养基 接种 补糖 4d 28 提取 马铃薯葡萄糖琼脂培养基 摇床 每48h补一次 2C6H8O7 H2O 3CaCO3 Ca3 C6H5O7 2 4H2O 3CO2 H2O中和终点pH 6 0 6 8温度 50 70 菌液过滤中和酸解过滤脱色去金属离子浓缩结晶 Ca3 C6H5O7 2 4H2O 3H2SO4 4H2O 2C6H8O7 H2O 3CaSO4 2H2O 85 在此温度下各种变体石膏的溶解度均最小 并有利于形成片状的半水石膏 便于过滤 加热至80 90 加热的作用 终止发酵 使蛋白变性凝固 降低发酵液黏度 使菌体中的柠檬酸释放 活性炭 1 3 85 搅拌30min 强酸型阳离子交换树脂 50 60 常压浓缩易分解成乌头酸 且结晶色泽变深 提取工艺流程 1 菌种 黑曲霉Aspergillusniger2 培养基 PDA 马铃薯葡萄糖琼脂 培养基 发酵培养基 土豆200g煮汁 蔗糖20g NH4NO32g KCl0 15g MgSO40 25g 水1000ml pH 5 3 器材 三角瓶2个 棉塞2个 纱布若干 接种环 小烧杯 水浴加热锅 离心机 离心管 PH试纸 电子天平 滤纸 大试管 电炉 加石棉网 摇床 玻璃棒 无菌tip头 移液枪 碱式滴定管 电子显微镜4 试剂 无菌水 酚酞 0 1429 0 1430mol LNaOH溶液 CaCO3 10 H2SO4 40 蔗糖溶液 实验器材 实验步骤 2 发酵培养基配制及分装 以实验室为单位 配方 土豆200g煮汁 蔗糖20g NH4NO32g KCl0 15g MgSO40 25g 水1000ml pH5 总糖100g L 基础20g L 补糖80g L 分装 每小组2瓶 每瓶100ml 棉塞或8层纱布 0 08Mpa 20min 3 制备孢子悬液及接种 以小组为单位 向每支斜面菌种加入5ml无菌水 用接种环刮菌苔表面或用无菌tip头轻轻吹打制备孢子悬液 将悬液接入灭菌并冷却至室温的培养基 注 勿接入过多孢子 否则菌丝过于浓密 影响产酸和后处理中的过滤 4 摇瓶发酵 补料及参数检测 摇瓶条件 200rpm 32 发酵4天补料 发酵48h补糖 每瓶 100ml 加入灭菌40 蔗糖液27ml 参数检测 接种后每24h取样测定 记录发酵液pH 5 发酵液酸度测定 酸度 是指100ml发酵液所含柠檬酸的克数 酸度测定方法 取发酵液滤液或离心液1ml 以酚酞为指示剂 用0 1429 0 1430mol L标准NaOH溶液滴定至淡粉红色 所消耗的NaOH毫升数即为发酵液酸度 通过对柠檬酸酸度的测定 可以推出从葡萄糖到柠檬酸的转换率 6 柠檬酸提取 部分 1 2C6H8O7 H2O 3CaCO3 Ca3 C6H5O7 2 4H2O 3CO2 H2O 2 Ca3 C6H5O7 2 4H2O 3H2SO4 4H2O 2C6H8O7 H2O 3CaSO4 2H2O 3 浓缩结晶 C6H8O7 H2O分子量210 14CaCO3分子量100 1Ca3 C6H5O7 2 4H2O分子量570 50硫酸分子量98 比重1 84 1g柠檬酸 0 714g碳酸钙 1 357g柠檬酸钙 0 7g浓硫酸 0 38ml浓硫酸 3 8ml10 硫酸 柠檬酸的产量可以根据酸度值算出 中和 酸解 菌丝过滤 发酵液经2 4层纱布过滤 如需要可再用滤纸过滤一次 或经离心 菌丝球很小的过滤太慢 取滤液 测量滤液体积 将发酵液倒于小烧杯 置70 水浴加热 中和 根据酸度测定结果计算出滤液中所含柠檬酸克数 并计算出与柠檬酸反应所需的CaCO3的量 称取CaCO3 慢慢将CaCO3加入发酵液中 轻轻摇动烧杯 反应至不再有气泡产生 pH6 0 6 5 用滤纸过滤 得白色柠檬酸钙 柠檬酸钙结晶呈成簇的针状 如果发现所得结晶有杂色 如发黄 可将柠檬酸钙结晶从滤纸上刮至小烧杯 加适量水 洗后再次过滤 酸解 将柠檬酸钙结晶从滤纸上刮至小烧杯 加适量水调成 糊 将小烧杯放85 水浴中加热 根据计算 向小烧杯中慢慢加入所需10 H2SO4 边加边轻轻摇动烧杯 使反应进行彻底 过滤 将滤液收集到大试管 过滤时可将试管插在试管架上 滤液即为柠檬酸溶液 用于下一步浓缩结晶 滤纸上的白色物为硫酸钙结晶 显微镜下呈片状或针状 浓缩与结晶 将大试管中的柠檬酸液倒入小烧杯 置电炉 加石棉网 上加热 煮沸浓缩 待观察到浓缩液中有少许白色晶体出现 此时已为过饱和 浓缩液易向外喷溅 即可停止加热 令浓缩液冷却 在冷却过程中 柠檬酸逐渐从浓缩液中结晶析出 滤纸过滤 得柠檬酸结晶 柠檬酸结晶显微镜下呈针状 准备1 发酵培养基2 补料用40 蔗糖溶液配制200ml 分装于2个250ml三角瓶3 标定用NaOH标准溶液配制200ml 装蓝盖瓶4 酚酞指示剂0 1g溶于250ml70 90 酒精 装蓝盖瓶 计算柠檬酸发酵的转化率 即每100克葡萄糖经转化所能生成的柠檬酸克数 柠檬酸发酵的理论转化率按下列反应计算应为106 7 总反应式 2C6H12O6 3O2 2C6H8O7 4H2