Promega双萤光素酶报告基因ppt课件.ppt

ReportSmartly 萤光素酶报告基因技术 自然界的萤光 发光海星发光甲壳虫 发光真菌 发光节虫 自然界的萤光 发光鱼发光甲虫 自然界的萤光 萤火虫 报告基因的作用 细胞信号转导途径启动子 增强子受体结合病毒 细胞相互作用转录因子药物诱导作用或 效果 荧光 Fluorescence萤光 Luminescence Luminescencevs Fluorescence 各种报告基因的优点和缺点 萤光素酶报告基因的主要优点 非放射性检测快 比CAT等 灵敏度高 可比CAT检测灵敏度高100倍 半衰期短 在理想条件下 可检测到10 20摩尔的萤光素酶分子 在哺乳动物细胞中半衰期3小时 在植物细胞中半衰期3 5小时 而CAT在哺乳动物细胞中的半衰期约50小时 线形范围广 在10 16M 10pg L 至10 8M 1mg L 范围内 光强度与萤光素酶浓度成正比 一般比显微镜检测的荧光更灵敏 对多孔板而言 生物萤光比荧光更稳定 因为自然界进化的酶能保护光子发射器通过基因工程可以延伸生物萤光的性能和能力 萤光素酶报告基因的使用 原理 制备含有luc Rluc的DNA转染提供刺激测量萤光 调节序列 Luc 在活细胞中做报告基因检测 外界刺激 导引物 萤光素酶基因 蛋白质折叠 调节序列 加工 转录 转录因子 信号转导 翻译 反义RNA 受体 蛋白 蛋白相互作用 RNA酶 病毒感染和增殖 RNAi抑制 启动子 增强子分析 碰撞启动子 全序列 2 逐步缺失 Promoter luc Light Promoter luc Light Promoter luc FireflyandRenilla 萤火虫生物萤光的化学 萤光素 ATP O2 萤光素酶 Oxyluciferin AMP PPi CO2 Light 萤光素酶 单体 61 000Daltons 辅 底物 ATP Mg2 萤光素 Mg2 海肾萤光素酶反应 Coelenterazine O2 萤光素酶 Coelenteramide CO2 Light 萤光素酶 单体 36 000Daltons 萤光素 Coelenterazine Enzymestructures Firefly Renilla 为什么要使用双报告基因 报告基因A 首要信号 报告基因B 第二信号 特异生物学反馈 非特异生物学反馈 非特异生物学反馈 检测结果 比较首要与第二信号确定特异生物学反馈 细胞可能有内源脱乙酰基酶 Gal或GUS活性 CAT Gal和GUS检测是终点检测 不能同时对在一个管中组合了萤光素酶和CAT 或 Gal 的两个报告基因的检测都灵敏而快速 传统的双报告基因的缺点 双萤光素酶报告基因系统比用CAT和 Gal做内对照的优点 速度样品不需预处理 不需孵育 两次检测在几秒种内完成灵敏两个萤光素酶的线性范围超过7个酶浓度数量级 内源萤光素酶背景极低方便一管完成检测 样品不必分份 实验质粒 对照质粒 用海肾萤光素酶作对照归一实验变化 归一反应 对照的 海肾萤光素酶 实验的 萤火虫萤光素酶 萤火虫萤光素酶 海肾萤光素酶 用两个萤光素酶做报告基因 萤火虫 海肾 数据处理举例 第一天萤光素酶活性 RLU 比率归一的活性样品处理重复 F R 变化倍数对照 5 1282 511 7 5533 815 10 5555 4137 7453 9131 981 00处理 5 13764 467 40 7123 57488 7877 6546 02925 23211 525 82处理B1587 6355 144988 3478 8323409 8813 564661 9545 847113 2157 18第二天对照 15 52920 4330 76 21 89730 8410 7110 76013 6200 7916 06221 6310 741 00处理 850 23920 843 578 95114 830 943 87321 788791 02119 15441 3055 81处理D114 86519 3 058 96712 28413 76720 24612 53317 2780 730 99 活性倍数 F R 样品 F R 对照第二天处理 计算如下 活性倍数 791 021 19 154 16 062 21 631 55 81 GloMax 20 20Singletubeluminometer GloMax 96luminometer Whitemicroplatesforluminescence Promega公司出品的双报告基因实验产品 质粒萤火虫萤光素酶质粒海肾萤光素酶质粒叩头虫萤光素酶质粒检测系统非均质双报告基因检测系统 通量较低 均质的双报告基因检测系统 适合高通量 自动化 载体 萤火虫萤光素酶载体 pGL3家族pGL3 BasicpGL3 ControlpGL3 EnhancerpGL3 Promoter pGL3 BasicMap pGL3 ControlMap pGL3 EnhancerMap pGL3 PromoterMap 辅助报告基因的相对萤光单位 RLU 启动子交叉交谈或互相干扰实验刺激给辅助报告基因的不必要的调节 内对照载体可能存在的问题 载体 海肾萤光素酶报告基因载体 Renilla萤光素酶载体系列 内含子 T7启动子 CMV即时早期增强子 启动子 phRL CMV HSVTK启动子 phRL TK SV40晚poly A SV40早期增强子 启动子 phRL SV40 MCS phRL null hRL基因 TK启动子 phRL TK Int MCS phRG B 合成poly A 信号转录停止位点 三个读码框的终止密码子 phRG TK 合成poly A 信号转录停止位点 三个读码框的终止密码子 TK启动子 hRL基因 SV40晚poly A Renilla萤光素酶载体系列 用萤火虫和海肾两个萤光素酶做报告基因 Dual Luciferase 双萤光素酶报告基因系统 非均质检测 E1910 100次E1960 E1980 1000次Dual GloTM萤光素酶检测系统 均质检测 E2920 10mlE2940 100mlEE2980 10X100ml 均质检测与非均质检测 发光 细胞 培养基 添加试剂 细胞 培养基 除去培养基 发光 清洗细胞 裂解细胞 添加试剂 均质检测 非均质检测 Dual Luciferase 报告基因检测系统组分 检测缓冲液II底物 冻干粉 Stop Glo 缓冲液Stop Glo 底物 50X被动裂解液 5X Dual Luciferase 报告基因检测步骤 裂解细胞被动裂解除去培养基 PBS洗 加1XPLB 振荡15分钟 检测主动裂解除去培养基 PBS洗 在1XPLB中刮下细胞 细胞转移到试管或小瓶中 1 2次冻融 检测检测 双萤光素酶检测方案 1支试管2步检测30秒钟 LuciferaseAssayReagentII Passivelysisbuffer Stop GloReagent DLRTMForHTS DLR 双报告基因检测系统应用举例 黑色素刺激激素 MSH 对由人酪氨酸酶启动子 增强子控制的萤光素酶的表达的诱导 PromegaeNotes 目的 监测细胞对 MSH诱导的应答材料 实验载体 pGL3 Try14A 人酪氨酸酶启动子 增强子 Luc 阳性对照 pGL3 Control阴性对照 pGL3 Basic内对照 pRL SV40B16 F1细胞 鼠黑素瘤细胞系CRL 6323 DLR 双萤光素酶检测试剂盒 步骤前一天 接种细胞 六孔板X3第二天 共转染 pGL3 Try14A和pRL SV40 分成两组 pGL3 Control和pRL SV40pGL3 Basic和pRL SV40裂解细胞 测量萤光 Dual Glo 萤光素酶检测系统 检测特点均质检测 为高通量检测而设计萤光信号稳定 2hrs内检测自发萤光低于检测水平 Dual GloAssay 同一样品中检测两种萤光信号 Stableluminescencesignalsforbothreporters t1 2 3 5hrs 10 000 foldsignalseparationbetweenthefireflyandRenillabioluminescence Primaryreporter Fireflybioluminescence Secondaryreporter Renillabioluminescence Cellsinculturemedium Addfireflyassayreagent Addcombinationfireflyquenchreagent Renillaassayreagent Dual Gloassay 选择性淬灭萤火虫萤光 Selectivequenchoffireflyluminescence Dual Glo 萤光素酶检测系统 试剂盒组成Dual Glo 萤光素酶缓冲液Dual Glo 萤光素酶底物 冻干粉 Dual Glo Stop Glo 缓冲液Dual Glo Stop Glo 底物 操作步骤 试剂制备简单将Dual Glo 萤光素酶缓冲液倒入Dual Glo 萤光素酶底物中用Dual Glo Stop Glo 缓冲液按1 100稀释Dual Glo Stop Glo 底物所有的缓冲液存于室温 所有的底物存于 20 C两步加入试剂 加 读 加 读 10 000倍信号分离 淬灭 用两个萤光素酶做报告基因Chroma LucTM载体Chroma Glo 检测试剂 E Coli表达的Chroma LucTM基因 Chroma LucTM基因和载体 三个基因 1 CBRluc 发红光的萤光素酶2 CBG99luc 发绿光的萤光素酶99 0 DNA相同于CBRluc3 CBG68luc 发绿光的萤光素酶68 9 DNA相同于CBRluc两种载体骨架 1 对照 置换了pGL3 Control的luc pCBR Control pCBG68 Control andpCBG99 Control 2 Basic 置换了pGL3 Basic的luc pCBR Basic pCBG68 Basic andpCBG99 Basic 合成的Chroma LucTM萤光素酶载体骨架 ControlBasicEnhancer SV40启动子 SV40增强子 SV40增强子 合成的或天然的基因 Chroma Glo 检测的化学 Luciferin ATP O2 Luciferase Oxyluciferin AMP PPi CO2 Light Luciferase Monomeric 61 000Daltons Co substrates ATP Mg2 Luciferin 不同颜色 同样试剂 C2 C2 旋转 较少能量 红光 不旋转 较多能量 黄绿光 Chroma LucTM萤光素酶滤光片选择 510 60nm 610nmLongpass Chroma Glo 检测的特点 为高通量检测设计 检测96 384 孔板均质检测需要带滤光片的萤光发光计 pGL4 ANewFamilyofReporterVectors Nextgenerationreportervectors pGL4 ImprovedReporterPerformance ImprovedExpressionofluc2 Provides5 10 xhigherexpressionthanluc inmammaliancells Largereductionofconsensussiteswhereinappropriateinteractionswithhostmayoccur Sitesremovedfromvector reportergenes andselectablemarkers RestrictionsitesVertebrateTFbindingsitesPromotermodulesEukaryoticspliceacceptoranddonorsitesEukaryoticpolyAsitesKozaksequences ReductioninConsensusBindingSites IncreasedResponseUsingRapidResponseLuciferases Comparedtoregularluciferase RapidResponse luciferasesgavehigherinductioninshortertime Inductionat3h 192 79 150 为什么需要快速反应萤光素酶基因 现存报告基因的缺点 研究者想要报告基因应答与细胞事件在时间上更快地耦联需要更强的应答较长的敷育时间可能导致检测到次级效应 假阳性 RapidResponseTM报告基因技术 不稳定的萤光素酶基因 细胞内报告基因池 信号 新表达的报告基因 为什么快速应答的报告基因应答性更强 快速应答 非 快速应答 新表达的报告基因 信号 基于报告基因稳定性的动力学模型 pGL4RapidResponseReportersGeneDesign VectorGeneDesignpGL4 10 luc2 luc2pGL4 11 luc2P luc2PpGL4 12 luc2CP luc2CPpGL4 70 hRluc hRlucpGL4 71 hRlucP hRlucPpGL4 72 hRlucCP hRlucCP 快速应答报告基因的设计 蛋白降解序列来自PEST鼠鸟氨酸脱羧酶的序列 40aa 来自酵母CL1序列 18aa RNA降解序列根据saimiri疱疹病毒小核RNA合成的富AU因子 ARE 萤光素酶基因为哺乳动物细胞表达优化了密码子优化了翻译起始序列 如 Kozak序列 缺失了多数已知的转录因子保守结合位点序列 NewMultipleCloningRegion pGL4载体系列的优势 更亮的萤光Codo