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酸性磷酸酶Km及Vmax值测定清洗试管24支 1 酸性磷酸酶 催化磷酸单酯的水解反应存在于人的肝脏 前列腺等处植物中以发芽的种子中含量最为丰富 是生物体中重要的一种酶类 为某些疾病的检测指标 一 概述 2 酶液磷酸苯二钠苯酚 磷酸氢二钠folin 酚测定酚的浓度计算出反应速度 用产物生成量 min来表示 根据双倒数法计算出Km及Vmax 二 实验原理 3 4 5 三 实验步骤 1 豆芽中的酸性磷酸酶的粗提取2 制作酶反应时间与产物生成量的关系曲线3 制作酚标准曲线4 S 与V0关系实验5 双倒数作图法计算Vmax和Km 6 buffer substrate enzyme CertainTime blank Stopthereaction Colordeveloped 7 生化实验课老师 于晓虹实验报告请交到讲台上来酶液稀释取上清液 微升 稀释 倍 用大试管装科代表李博恒 8 1 磷酸酶原液的制备 称取5g绿豆芽茎 去头去根 加入pH5 6的HAC缓冲液2ml研磨成浆并静置30分钟 纱布过滤 取1 8ml滤液 以6000rpm 离心20min 取上清 上清液用pH5 6的HAC缓冲液稀释30倍 用于实验 9 2 制作酶反应时间与产物生成量的关系曲线 目的 选取合适的反应时间 10 加液程序表管号1234560磷酸苯二钠0 50 50 50 50 50 50 5酶液0 50 50 50 50 50 5精确反应时间3510152025碳酸钠溶液2222222酶液 0 5Folin 酚溶液0 50 50 50 50 50 50 5Folin 酚溶液已稀释好 注 进行酶促反应时 注意预热 使所有的反应在同等条件下开始 35 保温10分钟 11 结果 以反应时间为横坐标 A680nm为纵坐标 绘制反应进程曲线 并从该曲线上求出酸性磷酸酶反应初速率的时间范围 12 3 制作酚标准曲线 目的 可从酚标准曲线上查出A680nm所相当的酚含量 并计算出反应速度 用每分钟产物生成量来表示 13 加液程序表 35 保温10分钟 14 结果 以酚含量 mol 为横坐标 A680nm为纵坐标 绘制标准曲线 以0号管作空白 在可见光分光光度计680nm波长处读取各管的吸光度 A680nm 15 4 S 与V0关系实验 16 实验加液程序表管号1234560磷酸苯二钠0 100 150 200 250 300 500 50醋酸缓冲液0 400 350 300 250 20 酶液0 500 500 500 500 500 50 精确反应15分钟35度碳酸钠溶液2222222Folin 酚溶液0 50 50 50 50 50 50 5酶液 0 535 保温10分钟测680nm处吸光度注 进行酶促反应时 注意预热 使所有的反应在同等条件下开始 17 实验中需注意事项 酶反应作用时间精确控制 18 实验结果 1 酚含量从酚标准曲线上查得2 V0反应初速率 mol min 为酚含量除以酶反
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