实验四血清蛋白的醋酸纤维薄膜电泳ppt课件.ppt

celluloseacetatemembraneelectrophoresis 实验四血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳 1 实验目的 掌握电泳法分离血清蛋白质的原理掌握血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳的操作方法及临床意义 2 电泳 带电粒子在电场的作用下 向着与其电性相反的电极移动的现象电泳技术 利用电泳现象对混合物进行分离分析的技术 实验原理 3 H OH H OH pH pIpH pIpH pI 4 电泳速度 带电粒子在电场中运动时 单位电场强度内粒子运动的速度 以u表示 即 V 粒子运动的速度X 电场强度Q 粒子所带电荷r 粒子的半径 介质的粘度 5 影响电泳速度的因素 1 样品本身 分子形状 形状越小 与支持物介质摩擦越小 u越大 球形分子 纤维状分子 Q越多 u越大 分子小 r越小 u越大 6 2 缓冲溶液 pH值 pH pI 越大 Q越多 u越大 离子强度 I I越大 电动电势越小 u越小 I越小 电动电势越大 u越大 但样品易扩散 离子强度如果过低 缓冲液的缓冲容量小 不易维持pH恒定 选择离子强度时要两者兼顾 一般离子强度的选择范围在0 02 0 2之间 7 电场强度 电泳支持物上每厘米的电位降 也称电势梯度 3 电场强度 X X越大 u越快 支持物越短 X越大 u越快 电场强度越大或支持物越短 电流将随之增加 产热也增加 影响分离效果 在进行高压电泳的时候必须用冷却装置 否则可引起蛋白质等样品发生热变性而无法分离 8 4 支持介质 纤维薄膜 玻璃纤维薄膜 醋酸纤维薄膜 凝胶 琼脂糖凝胶 聚丙烯酰胺凝胶 9 负极 正极 表面带负电荷 带正电荷的水层携带粒子向负极移动 如果样品原本是移向负极的 则泳动的速度加快 如果样品原本是移向正极的 则泳动的速度减慢 电渗作用 电渗 在电场作用下液体对固体支持物相对移动的现象 以纸电泳为例 10 区带电泳的分类 一 支持物物理性状1 滤纸及其它纤维 如玻璃纤维 醋酸纤维 聚氯乙烯纤维薄膜 电泳2 粉末电泳 如纤维素粉 淀粉电泳 3 凝胶电泳 如琼脂 琼脂糖 聚丙烯酰胺凝胶电泳 4 丝线电泳 尼龙丝 人造丝电泳 11 二 支持物装置形式 1 平板式电泳 支持物水平放置 2 垂直板式电泳 聚丙烯酰胺凝胶可做成垂直板式电泳 3 垂直柱式电泳 聚丙烯酰胺盘状电泳 12 三 pH连续性 1 连续pH电泳 即整个电泳过程pH保持不变 如常用的纸电泳 醋酸纤维薄膜电泳等 2 非连续pH电泳 缓冲液和电泳支持物间有不同的pH的电泳 如聚丙烯酰胺凝胶盘状电脉 等电聚焦电泳等 13 醋酸纤维薄膜为支持物pH 8 6的巴比妥缓冲液血清蛋白的pI均小于8 6负电荷电泳时向正极移动由于迁移率不同而被分离 14 分子越小 泳动速度越快带电量越多 泳动速度越快 15 膜条经过氨基黑10B染色后显出清晰色带 2 定性 定量 各色带蛋白质含量与染料结合量基本成正比 可将各色带剪开 分别溶于碱性溶液中 用分光光度法计算各种蛋白质的百分数 16 醋酸纤维薄膜 醋酸纤维加工的细密且薄的微孔膜广泛应用医学临床各种生物分子的分离分析 血清蛋白 血红蛋白 球蛋白脂蛋白 糖蛋白甲胎蛋白 类固醇及同工酶等 17 优点 简单快速缺点分辨率较低 聚丙烯酰胺凝胶电泳 PAGE 不适于制备 薄膜厚度约10 100 m 样品用量很少 18 器材及试剂 1 器材 醋酸纤维薄膜 2 8cm 常压电泳仪竹镊点样器人血清或鸡血清粗滤纸 2 试剂 巴比妥缓冲液氨基黑10B0 25染色液漂洗液透明液 19 操作 一 仪器与薄膜的准备 1 醋酸纤维素薄膜的润湿与选择 2 电泳槽的准备 3 电极槽的平衡 20 二 点样 取出薄膜 无光泽面向上平放在滤纸上点样区距阴极端1 5cm血清均匀涂在点样器表面将点样器轻轻印在点样区内 使血清完全渗透至薄膜内形成一定宽度 粗细均匀的直线实验的关键 是获得具有清晰区带的电泳图谱的重要环节 21 三 电泳 点样端薄膜平贴阴极电泳槽支架滤纸桥 点样面朝下 另一端平贴在阳极端支架要求 薄膜紧贴滤纸桥并绷直 薄膜之间相隔几毫米盖电泳槽盖 平衡10min打开电源开关 调节电流强度为0 3mA 片 通电10min调节电流强度为0 5mA 片 电泳60 90min电泳后调节旋钮电流为O 关闭电泳仪切断电源 22 DYY 5型稳压稳流电泳仪 DYY 型电泳槽 23 24 25 实验注意事项 不要用手触摸纤维素膜注意区分醋酸纤维素薄膜的光面和毛面点样位置要在1 5厘米以内 不要距边缘太近不要重复点样膜放进电泳槽时 将点样面向下 点样端靠近阴极 26 用点样器点样时不要点的太多 但也不能太少线条均匀 用力水平 电泳槽放膜条支架上尽量不要有缓冲液 27 四 染色和漂洗 取出薄膜 直接浸入染色液中 染色5min自来水冲洗 漂洗液漂洗更换3次漂洗液 脱去颜色 得到色带清晰的电泳图谱 28 实验结果 绘出电泳图谱并标明各条带含义 29 30 临床意义 血浆蛋白是血浆最主要的固体成分 含量60 80g L绝大部分由肝脏合成 仅 球蛋白由浆细胞合成正常值 白蛋白57 72 1球蛋白2 5 2球蛋白4 9 球蛋白6 5 12 球蛋白12 20 31 临床上还可用A G比来表示清球蛋白的量的关系 正常人A G 1 5 2 5 32 血浆蛋白的主要功能 维持血浆胶体渗透压调节血浆pH值 维持酸碱平衡运输营养物质 代谢物 激素 药物及金属离子等免疫作用 33 白蛋白降低 合成能力不足 肝功能下降合成原料不足 饥饿 腹泻 肿瘤晚期去路增加 肾病综合症 严重烧伤 大出血等消耗过多 糖尿病 甲亢等 34 球蛋白增加 感染 多发性骨髓瘤 自身免疫性疾病等 球蛋白降低 皮质功能亢进 免疫缺陷病 35 肝病 A 2 G G 1 G G A G下降甚至倒置 肾病 早期 选择性蛋白尿 Mw较小蛋白质丢失 含量下降 如白蛋白后期 非选择性蛋白尿 Mw较小的蛋白质丢失 含量下降分子量较大的蛋白质 如 球蛋白 丢失 含量下降 36 实验思考 1 电泳时 点样端置于电场的正极还是负极 为什么 2 电泳后 泳动在最前面的是何种蛋白质 各谱带为何种成分 请分析原因 37 常见问题及原因 1 电泳图谱不齐 点样时血清滴加不均 2 电泳图谱出现条痕 点样后薄膜过干 或电泳槽密闭性不良 或电流过大 造成水分蒸发薄膜干燥 3 分