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实验四蛋白酶活力的测定 先打开水浴锅 温度设置成40 C 一 实验目的二 实验原理三 器材仪器和主要试剂四 实验操作五 思考题六 值日 一 实验目的 掌握定量测定蛋白酶活性的方法 了解本实验的酶 底物和生成物的相关性 以及本反应的环境条件 进一步理解酶活力和比活力的概念巩固比色法测定物质含量的基础 掌握分光光度计使用方法 学习绘制标准曲线的方法 二 实验原理 1 胰蛋白酶是一种水解酶 将酪蛋白水解成酪氨酸等物质 2 所生成的酪氨酸能与酚试剂反应成蓝色物质 酚试剂又名Folin试剂 是磷钨酸和磷钼酸的混合物 在碱性条件下极不稳定 可被酚类化合物还原产生蓝色 钼蓝和钨蓝的混合物 680nm 3 用分光光度计可以定量比较颜色深浅 测定酪氨酸生成量 根据生成物的含量可以计算胰蛋白酶的活力 胰蛋白酶活力越高 生成的酪氨酸越多 4 蛋白酶活力单位定义 在40 C pH7 5的条件下 反应10min 以每min水解酪蛋白产生1 g酪氨酸为1U 三 器材仪器和主要试剂 可见光分光光度计水浴锅Folin 酚试剂0 5 酪蛋白100 g mlTyr溶液三氯醋酸Na2CO3胰蛋白酶 四 实验操作 1 酪氨酸标准曲线的制作 以酪氨酸的浓度 g ml 为横坐标 A680nm为纵坐标 作出标准曲线 2 蛋白酶活力的测定 按下表操作 然后测定滤液中的酪氨酸含量 滤液各取1ml 进行显色反应 加Na2CO35ml Folin 酚试剂1ml 40 C保温15min 以标准曲线中的1号管调0 测定A样 样品液A680nm值 和A对 对照液A680nm值 3 酶活力计算 胰酶活力定义 40 pH7 5 反应10min 每分钟水解酪蛋白产生酪氨酸1微克为一个酶活力单位 计算 1g蛋白酶所具备的总活力单位为 A样 A对 K V t NA样 样品液光吸收值 A对 对照液光吸收值 K 标准曲线上A680nm为1时的酪氨酸微克数 t 酶促反应的时间 min 本实验t 10min V 酶促反应管的总体积 ml数 本实验V 6 N 本次实验酶液的稀释倍数 6000 五 思考题 酶的试验为何设对照又要设空白 稀释的酶溶液是否可长期使用 说明原因 计算公式中的v 6该如何理解本实验用什么方法终止酶促反应 还有其他方法可以终止反应吗 如何保证本实验测定数据的准确性 胰蛋白酶的
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