氨基酸含量的测定及分离鉴定ppt课件.ppt

实验七氨基酸的分离鉴定 纸层析法 1 一目的通过氨基酸的分离 学习纸层析法的基本原理及操作方法二原理纸层析法是利用各物质不同的分配系数 使混合物随流动相时而得到分离的方法 纸层析法是以滤纸作为惰性支持物的 滤纸纤维与水亲和力较强 而与有机溶剂亲和力弱 所以纸层析以滤纸纤维和结合水为固定相 以有机溶剂为流动相 当有机相沿滤纸流动经过样品点时 样品点上的溶液在水相和有机相之间进行分配 样品移动速率与样品的极性及水亲和力有关 因此 极性氨基酸移动较慢 而非极性氨基酸移动较快 物质被分离后在纸层析图上的位置用Rf值表示Rf 原点到层析点中心的距离 原点到溶剂前沿距离在一定条件下某种物质的Rf值是常数 2 溶液前沿层析点原点 溶剂前沿苯丙氨酸丙氨酸天冬氨酸 3 器材1层析缸2毛细管3喷雾器4培养皿5层析滤纸 4 操作步骤1取层析滤纸一张 在纸的一端距边缘2 3 处用铅笔划一条直线 在直线上约每隔3 4 做一次记号 共记四次 2用毛细管将各种氨基酸样品分别点在4个记号点上 干后再点一次 尽量点成圆形 并在各点表上样品名 3手通过纸将滤纸卷成圆筒形 并用针缝 共3针 每缝一针打个结 第三针的线留长一点 4将缝好的纸 装入 垂直放入装有扩展剂的层析缸内 点样的一端朝下 滤纸不应碰到缸壁 5约2个小时后 将滤纸取出 拆掉线后 放入烘干机内烘干 约10分钟后取出即显色 6画出溶液前沿线 确立个层析点中心 计算各氨基酸的Rf值 5 实验结果 原点到溶剂前沿距离为L 原点到层析点中心距离为d 6 氨基酸的定量分析 甲醛滴定法 一 目的 初步掌握甲醛滴定法测定氨基酸含量的原理和操作要点 7 水溶液中的氨基酸为兼性离子 因而不能直接用碱滴定氨基酸的羧基 甲醛可与氨基酸上的 N H3结合 形成 NH CH2OH N CH2 OH 2等羟甲基衍生物 使N H3上的H 游离出来 这样就可以用碱滴定N H3放出H 测出氨基氮 从而计算氨基酸的含量 二 实验原理 8 若样品中只含有单一的已知氨基酸 则可由此法滴定的结果算出氨基酸的含量 若样品中含有多种氨基酸 如蛋白质水解液 测不能由此法算出氨基酸的含量 脯氨酸与甲醛作用后 生成的化合物不稳定 导致滴定后结果偏低 酪氨酸含酚基结构 导致滴定结果偏高 9 三 材料 试剂与器具 一 试剂1 0 5 酚酞酒精溶液称0 5g酚酞溶于100ml50 酒精中 2 0 1mol L甘氨酸溶液取3 75g甘氨酸溶于500ml蒸馏水 3 标准0 0200mol L氢氧化钠溶液4 中性甲醛溶液取甲醛溶液50ml 加0 5 酚酞指示剂约3ml 滴加0 01mol LNaOH溶液 使溶液呈微红色 临用前中和 二 实验器具锥形瓶 碱式滴定管 移液管洗耳球 天平容量瓶 试剂瓶 量筒 玻棒与烧杯 10 四 操作步骤 1 取5只50ml锥形瓶 按下表加入试剂 11 2 用0 0200mol LNaOH溶液滴定至溶液变微红色注意 滴定管中溶液的初始位置和滴定结束时的位置 滴定管的使用方法 3 用0 0200mol LNaOH溶液滴定至溶液变微红色 4 记录每次滴定所用的0 0200mol LNaOH溶液的体积 12 五 计算 标准甘氨酸氨基氮的回收率 VNaoH 0 0200mol L 理论计算值 14 008 理论计算值 取用氨基酸的体积乘以浓度 再乘以14 008 VNaoH两次测定所用氨基酸的体积的平均值 13 每毫升氨基酸溶液中含氨基氮的毫克数为式中 V1为滴定样品消耗氢氧化钠的体积 ml V2为滴空白消耗氢氧化钠的体积 ml MNaOH标准NaOH溶液的摩尔浓度 14 1 甲醛法测定氨基酸含