医学实验动物学.doc

医学实验动物学 实验设计 姓名：骆成林 班级：2015级4班 专业：外科学（普外） 学号：406521215102 日期：2016年6月5日 肝癌的诊断检测及抗肿瘤药物研究一、立题依据（研究背景、立题意义）（一）研究背景肝细胞性肝癌(hepatocellular carcinoma, HCC)的发病率和死亡率呈逐年上升趋势。据世界卫生组织2002年数据显示，全球每年新增病人约63万例，死亡人数约60万人，为癌症第三号杀手。我国年发病人数约35万，每年约有32万人死于此病，发病率和死亡率均占癌症中的第二位。HCC高死亡率的原因是早期转移和复发，尤其是HCC根治性切除术后的高复发率严重影响肝癌总体外科疗效。国内外较大系列的临床资料表明HCC术后的3年复发率为40% 50%左右。肝细胞癌(HCC)是我国常见恶性肿瘤之一，其死亡率在消化系统恶性肿瘤中居第三位，仅次于胃癌和食管癌。其发病率有上升趋势，严重危害人类健康与生存。（2） 、立题意义和大多数恶性肿瘤一样，肝癌的发生是一个多因素多基因综合调控的过程。本实验通过对肝癌细胞CuZn-SOD的mRNA及其蛋白表达水平的检测，帮助临床对肝癌的诊断，并讨论青蒿素对肿瘤细胞的抑制作用从而指导临床治疗用药。二、实验内容及方法步骤（一）、大鼠肝癌模型的制备及观察研究 1. 实验材料与方法 1.1 实验动物与药品 动物 清洁健康的SD大鼠150只，体重150-200g。所有大鼠分别分笼单独饲养，给予相同标准化光照，自由进食，定期打扫鼠笼，适应环境7天。之后全部大鼠按随机抽样法分为实验组(135只)和对照组(15只)。 方法 实验组饲以含DEN的饮水，连续喂养12周后改为自由饮水。对照组，常规自由饮水。每天观察动物的精神状态、饮食状况及背毛的变化等一般情况。于实验第4、8、12、16、18、20、22、24、25周，随机抽取模型组动物各10 15只，打开腹腔, 大体观察暴露肝脏, 记录肝脏的形态、颜色、质地。 1.2 常规切片制备与HE染色 1.2.1 主要试剂及设备 (1)常用试剂： 0.01mol/L PBS溶液(PH：7.2-7.4)； 0.01mol/L柠檬酸盐缓冲液； 4多聚甲醛；HE染(苏木精和伊红染液)；石蜡；蒸馏水；各浓度的酒精；二甲苯；戊二醛固定液等。 (2)设备：光学显微镜；制片机；刀台；超薄切片机；恒温烤片机；大中号毛笔；水浴箱；载玻片和盖玻片等。 1.2.2 切片制备 (1)取材与固定：分别选取实验组大鼠肝癌细胞和对照组大鼠肝脏细胞，一般切取组织块为0.20.3cm，用4多聚甲醛固定液将所取标本固定24小时，以便观察研究所用。 (2)洗涤与脱水：用蒸馏水将渗入标本中的固定液洗去，再用90、80和70酒精脱去组织中的水分。 (3)透明与浸蜡 (4)包埋与切片：用石蜡包埋组织，切片前的一般准备工作包括石蜡组织切片机（或冰冻切片机）和恒温烤片机的调试；大中号毛笔、切片刀的准备（必须保证切片刀锋利）等一般组织细胞学制片所必须充分准备的工作；还需要对载玻片和盖玻片进行特殊处理。 (5)贴片和染色：将已切妥的切片放于温水中铺平，稍晾干后再烤片。 (6)封片：染色后用胶封片。1.2.3 HE染色 石蜡切片染色程序：切片脱蜡、二甲苯、各510分钟；无水乙醇5分钟；95%乙醇各5分钟；75%乙醇 5分钟；染细胞核（苏木素）35分钟；水冲洗510分钟；染细胞浆（伊红）12分钟；95%乙醇、各5分钟；二甲苯透明；封片贴号。 1.2.4 分别用光学显微镜下观察实验组和对照组切片 结果预测： (1)肉眼病理观察：实验组肝脏体积明显增大，重量显著增加，表面不满大小不一、形态各异的结节；对照组肝脏无异常。 (2)光镜下观察病理切片：实验组可见肝细胞排列呈巢状，分化程度差异较大，血管多，间质少。癌细胞大小不一，形态各异。对照组肝细胞形态正常。 （二）、检测CuZn-SOD的mRNA表达水平和蛋白表达水平 CuZn-SOD可能是肝癌发生的相关基因之一,它在mRNA水平和蛋白水平的表达下降和肝癌的发生发展可能互为因果。肝癌细胞中CuZn-SOD的mRNA和蛋白表达水平均应明显低于癌旁组织,并且分化较低的肝癌组织的蛋白表达水平下调更显著。 1.1 实验动物与药品 (1)实验动物：大鼠肝癌模型 (2)药品：Trizol 试剂；链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶免疫组化染色( SP) 试剂盒 1.2.1 借助于逆转录多聚酶链反应(RT-PCR)技术检测肝癌细胞中的CuZn-SOD的mRNA的 基因表达水平。 1.2.2 分别选取实验组与对照组大鼠的肝脏组织细胞进行RT-PCR测序及免疫组织化学分析 用Trizol 试剂经一步法提取组织总RNA, 再经RT-PCR合成cDNA。以管家基因B-actin作为内参照，后用凝胶成像分析系统进行半定量分析。 免疫组织化学染色 即用型链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶免疫组化染色( SP) 试剂盒进行免疫组化结果判断及半定量分析。 统计学处理。 （三）、实验讨论青蒿素对肿瘤细胞生长的抑制作用 青蒿素是我国首先发现的新构型的抗疟药，体内代谢活性产物为双氢青蒿素，抗疟活性高，毒性小。药动学研究证实青蒿素类药物在体内吸收快，分布广，排泄快。近年来发现青蒿素及其衍生物具有明显的抗肿瘤活性。 提取实验组小鼠肝癌H22细胞株，进行传代培养，之后分瓶为新的实验组、阳性对照组和阴性对照组。 向实验组培养液中加入青蒿素，阳性对照组中加入等量的丝裂霉素，阴性对照组不加任何试剂。 细胞活力测定，分别计数三组培养瓶中的肝癌细胞数，根据计数结果，描绘细胞生长曲线。 统计分析，针对计数结果进行统计学分析，尽量减少误差。 动物实验模型设计3、 技术路线青蒿素对肝癌的影响检测CuZn-SOD的蛋白表达水平检测CuZn-SOD的mRNA表达水平 分 析 实 验 结 果四、实验预期结果大鼠肝癌模型制备成功； 肝癌细胞排列呈巢状，分化程度差异较大，血管多，间质少。癌细胞大小不一，形态各异； 肝癌细胞中CuZn-SOD的mRNA和蛋白表达水平均应明显低于癌旁组织； 青蒿素对肿瘤细胞有抑制作用，青蒿素组肝癌细胞生长明显受到抑制。参考文献 1 邓小荣, 余和平, 王克强, 李学明.青蒿素对肝癌抑制作用的实验研究J. 实用临床医学, 2007, 8(11): 1-7. 2 Efferth T, Dunstn H, Sauerbeey A, et al. The Ant-i malarial Artesunat I salsoActiveAgainst-cancerJ. Int J Oncol, 200l,18(4): 767-773. 3 吴孟超. 我国肝脏外科学研究进展J. 中华外科杂志, 1999, 27(9): 518-521. 4 李笑岩, 白咸勇, 刘同慎, 韩玉贞, 刘利德.二乙基亚硝胺诱发大鼠肝癌模型的建立及病理学改变J. 滨州医学院学报, 2007-12, 30(6): 401-406. 5 LimMS, AdamsonA, linZ, etal. ExpressionofSkp2, ap27(kip1)ubiquitin ligase, inmalignant lymphoma: correlationwith p27(kip1) andproliferation index J. 2002, 100(8): 2950-2956. 6 DAS SK, TANJ, RAJAS, et al . Estrogen targets genes in-volved inproteinprocessing, calciumhomeostasis, and Wnt sig-naling in themouseuterus independent of estrogen receptor-A and-BJ. J Biol Chem, 2000, 275(37): 28834-28842. 7 韦薇, 李瑗, 苏建家, 曹骥, 欧超, 杨春, 班克臣, 岳惠芬.铜锌-超氧化物歧化酶在肝癌组织中的异常表达及意义J. 肿瘤, 2006-2, 26(2): 123-138. 8 HETC, ZHOUSB, LUIS T, et al . Asimplified system for generating recombinant adenovirusesJ. Proc Natl Acad Sci USA, 1998, 95(5): 2509-2514. 9 黄承诚, 吴孟超. 人肝癌组织中铜、锌-超氧化物酶含量的变化J. 中华消化杂志, 1990, 10(5): 284-286. 10 MULLERT, BAING, WANGX, et al . Regulation of epithe-lial cell migration and tumor formation byB-catenin signaling J. Exp Cell Res, 2002, 280(1): 119-13311 Parkin DM, Bray F, Ferlay J, et al. Global cancer statistics,2002.CA Cancer J Clin,2005,55:74-10812 沈锋,吴孟超.肝癌切除术后的抗复发治疗.中华医学杂志,2005,85(41):2886-288813 Wakai T, Shirai Y, Yokoya