新药临床前毒理学评价ppt课件.ppt

新药临床前毒理学评价PreclinicalToxicologicalEvaluationofNewDrug 1 Contents 目的意义急性毒性试验 acute 长期毒性试验 chronic 特殊毒性试验 遗传 生殖 致癌 其它毒性试验 过敏 刺激etc 药物非临床研究质量管理规范 GLP SFDA新药审评会案例学习 2 目的意义 新药评价的核心内容确保临床用药安全 限量 改变途径 有毒 3 Toxicity Everywhere 1274宋慈指出万物皆毒CA化学品约一千万 USA每年上市新化学品1500种左右1992年联合国环境与发展大会 有毒化学品 21st 1 7 环境问题 4 DrugHazards 5 TheCOX 2Hypothesis 1992 Prostanoids ArachidonicAcid Prostanoids ProtectionofGastricMucosaPlateletFunction Pain Inflammation Fever RenalEffects GastropathyandAntithromboticEffects EffectsonNa Balance Anti inflammatoryandAnalgesicEffects NSAIDs COX 2 COX 1 SelectiveCOX 2Inhibitors 6 COX 2 PGI2 COX 1 COX 1 BP TXA2 COX 1 COX 2 COX 2 CardiacFibrosis 7 Merckpullspopularpaindrugduetorisksofheartattacks Sept 30 2004 8 95 97 98 99 00 01 02 03 04 05 96 94 VioxxMilestones NDAsubmit AcutePain DYSM OA INDforAlzheimer s3 98COX IISafetyAC FirstIND 2 01AACMeetingReviewofadditionalinformationInternalBriefingsCOX IISafety Arthritis DSaRMCOX IISafetyMeeting GIDACMeeting APPROVe 4 02LabelUpdate10 02PCPSProstateCa prevention10 02MerckPooledCVanalysis12 02AdvicelettertoMerck 3 04UpdatedAlzhCVData3 04Migraineapproval8 04JRAapproval8 04KaiserStudyAbstract 9 04APPROVeresultsOngoingStudiesStoppedProductWithdrawn 6 00VIGORresults INDforAPPROVe 4 99AACmeeting5 99NDAapproved 9 SabrinaBriertonJohnson 10 11 RiskofSeriousCVEventsofCelecoxib SolomonSD etal NEnglJMed352 2005 Inthisanalysis seriousCVevents includedeathfromCVcauses MI stroke orheartfailure 671 AE ADR 12 Thursday February17 2005 12 00Lunch1 00OpenPublicHearing 13 DearFDA WhenIwas6yearsold Ihadfun AllofthatendedwhenIcamehomefromthefirstgrade notfeelingverywell MyparentsgavemeChildren sMotrin butinsteadofgettingbetter IgotStevens JohnsonSyndrome TakingChildren sMotriniswhyIamblindtoday 14 IwouldliketoasktheFDAtorequireawarninglabelaboutSJSonChildren sMotrinandonanyotherdrugsthatcancausethishorribledisease SabrinaBriertonJohnson age7 15 SabrinaBriertonJohnson Stevens JohnsonSyndrome 16 ThePillCamera 1 Opticaldome2 Lensholder3 Lens4 IlluminatingLEDs lightemittingdiodes 5 CMOSimagesensor6 Battery7 ASIC ApplicationSpecificIntegratedCircuit transmitter8 Antenna Dimensions Height 11mmLength 26mmWeight 3 7gm 17 AControlledStudyofNSAID inducedSmallBowelInjuryUsingVideoCapsuleEndoscopy VCE Results Severeinjuryvsanyinjury p 0 001 Severedamagewasassociatedwithhighdoseindomethacin naproxen andibuprofenuse 18 Ulceration 19 Voice Stopanimaltesting HumaninvitrotestingComputer basedmethodsMicrodosingtechnologyStemcelltechnologyPharmacogenomics 20 SuccessfulExamples 化学物质致癌 致畸 己烯雌酚防流产而使子代女性出现阴道癌 致突变 生殖毒性 致癌试验模型青霉素严重过敏反应 过敏模型 豚鼠 21 目的意义 DOSTAR 毒性剂量ToxicDose安全剂量范围Safetymargin毒性反应Toxicreaction 性质 程度 量毒关系 产生 达峰 持续时间及反复产生毒性反应时间 迟发性 蓄积性 耐受性寻找毒性反应靶器官TargetOrgan毒性反应是否可逆Reversibility解毒或解救措施Antidote 确保临床用药安全 重点监测指标 22 AcuteToxicityTest 概念 目的意义传统方法基本内容和要求有关问题其它实验方法 23 Concept 动物单次或24h内多次给予受试物后 一定时间内 14天 所产生的毒性反应毒理研究早期阶段进行 24 目的意义 阐明药物毒性作用及强度 计算相对毒性参数了解毒性靶器官为长毒 特殊毒性试验剂量设计为 期临床试验起始剂量选择为临床毒副反应监护提供参考其它 DOSTAR 25 OECD口服急性毒性分级 26 相对毒性参数 治疗指数TI LD50 ED50安全系数SF LD5 ED95可靠或确实安全系数CSF LD1 ED99安全范围SM LD1 ED99 1 X100 SED50 ED50 越大越安全LD5基本无害量ED95基本有效量LD1肯定无害量ED99肯定有效量 27 为临床毒副反应监护提供参考 中毒症状 起始 持续 恢复时间中毒靶器官对抗试验为临床急救提供依据 28 为长毒等试验选择剂量提供依据 长期毒性剂量设计LD50法 1 10 1 50 1 100 MTD法 1 1 3 1 10 生殖毒性试验高剂量为母鼠MTD主要药效学剂量限度 一般药理学和药动学剂量设计也要参考急性毒性的LD50 29 为特殊毒性试验选择剂量提供依据 致突变试验啮齿类动物微核试验高剂量为1 2LD50果蝇伴性隐性致死试验的高 低剂量分别为1 2LD50和1 4LD50精原细胞染色体畸变试验高剂量 1 2LD50短期致癌试验高剂量 MTD 30 I期临床选择起始剂量提供参考 细胞毒类抗癌药 I期临床起始剂量 1 10LD50 31 其它 系列化合物的合格率分析 除理化性质为主外 也参考LD50复方药物的相互作用 也可通过拆方及合用的LD50来判别相互作用性质比较不同途径的LD50 获得一些生物利用度信息 为剂型开发提供参考 32 基本原则 执行GLP具体问题具体分析随机 对照 重复 33 动物 获得尽量多信息前提下 使用尽量少动物啮齿类 小鼠或大鼠非啮齿类 犬或猴二种动物 啮齿类及非啮齿类 小鼠18 22g 大鼠120 150g 犬用成年犬初始体重不应超过或低于平均体重的20 各半 勤俭办事 服从命令 34 受试物 工艺稳定 符合临床用质量标准标明名称 来源 批号 含量 或规格 保存条件及配制方法等 附质检报告辅料 溶剂 试剂等应标明批号 规格和生产厂家 符合试验要求 35 受试物 原料药临床拟用剂型复方制剂 复方 拆方 增毒 新毒 易降解 含降解产物量最高的受试物进行急毒试验 并与临床样品的急毒试验结果比较 36 给药途径 临床拟用途径 原型药物较完全进入循环途径 如静脉注射 啮齿类ig给药前应禁食12h 不禁水 37 剂量和分组 给药剂量 未见毒性量 严重毒性量设空白和 或溶媒 辅料 对照小动物4 6个剂量组 组距0 65 0 85 求LD50大动物可用50 等量递升法 近似致死剂量法 求出ALD和MTD 不必达到致死量 38 给药容积 不等浓度等容量给药常规及最大给药容量为 39 观察指标及时间 药后4h内详观 后每天上下午各一 观察 14d记录毒性反应 死亡情况 中毒症状 发生时间 持续时间 严重程度 恢复期及动物最短 最长死亡时间其它指标 一般指标 体重变化等 40 急性毒性研究的一般观察和指征 41 病理学检查 大体解剖 濒死动物 死亡动物 存活动物 组织病理学检查 体积 颜色 质地等改变时 42 结果处理 实验资料用Bliss法计算LD50 必要时求不同性别LD50表 XXX急性毒性结果及LD50计算剂量对数剂量动物数死亡动物数死亡率机率单位LD50及可信限 mg kg X 只 只 Y mg kg 43 44 结果处理 剂量 反应 时间 反应关系反应可能涉及组织 器官或系统肉眼病变和组织病检 初步判断毒性靶器官病检报告应附 病检者签名 单位盖章 病理照片 确定NOAEL MTD ALDetc 初步判断受试物的安全范围 45 综合评价 判断反应与药物作用相关性 时间 发生率 剂量 反应关系动物种属及背景数据病理学检查结果同类药物特点安全范围 毒性严重程度及可恢复性毒性作用靶器官毒性可能涉及部位大体解剖和组织病理学检查结果 46 注意问题 光化学治疗药和辐射增敏剂急毒试验照光 不照光分别测定LD50复方 a b 中各组分毒性相互作用评价 47 注意问题 充分重视预试毒理学界对LD50看法试验结果 信息 的一部分LD50测定不足 动物消耗量大获得信息有限测得数值不准 48 EPAPolicies DiscouragestheuseoftheClassicalLD50test UsesStructurallyRelatedActivities SRA toobviatetheneedfortestingonanimalsRecommendstheLimittest 49 EPAPolicies BeyondtheLimit recommendsapproximatelethaldosetheup and downmethods 50 近似致死剂量法 非啮齿类动物 6只健康Beagle犬或猴 犬6 12m 猴2 3y估计可能引起毒性和死亡的剂量范围 按50 递增法 设计出剂量序列表 51 First 52 最低致死剂量 最高非致死剂量 最低致死剂量 最高非致死剂量 OR 近似致死剂量范围 近似致死剂量范围 Second 53 MTD法 最大允许浓度和最大允许容积仍未测出LD50 可只求MTD值一次或24h多次 总量 5g kg 给20只动物观察14d 未见死亡 则MTD XXg kg 个别死亡 则写成LD50 XXg kgiv要求pH5 8 速度 大 小鼠10 20sig时空腹 即禁食12 16h左右 54 常用容量和最大容量 ml 55 最大无毒性反应剂量 noobservedadverseeffectlevel NOAEL 指受试物在一定时间内 按一定方式与机体接触 用灵敏的现代检测方法和观察指标未发现损害作用的最高剂量 最小毒性反应剂量 动物出现毒性反应的最小剂量 最大耐受量 maximaltolerancedose MTD 不引起受试动物死亡的最高剂量 最小致死剂量 minimallethaldose MLD 引起个别受试动物出现死亡的剂量 半数致死量 medianlethaldose LD50 在一定试验条件下引起50 受试动物死亡的剂量 56 长期毒性试验Long termToxicityStudy 目的意义基本内容和要求有关问题Mechanic Innovative 57 目的意义 DOSTAR 毒性剂量ToxicDose安全剂量范围Safetymargin毒性反应Toxicreaction 性质 程度 量毒关系 产生 达峰 持续时间及反复产生毒性反应时间 迟发性 蓄积性 耐受性寻找毒性反应靶器官TargetOrgan毒性反应是否可逆Reversibility解毒或解救措施Antidote 确保临床用药安全 重点监测指标 58 基本原则 执行GLP整体性研究结果与其它药理毒理试验互为印证 说明和补充具体问题具体分析随机 对照 重复 59 Procedure AnimalsHousingDrugRouteDosageGroupDurationIndexRecoveryTimeReport 动饲药径剂组周指恢时报告 60 Animal invitro体系筛选实验动物种属或品系理想动物对受试物生物转化与人体相近对受试物敏感已有大量历史对照数据 61 Animals rodentnon rodentratbeagledogmousemonkey 62 Animal 二种动物 啮齿类首选大鼠 非啮齿类用Beagle犬 必要时用猴 猪等符合等级要求来源 品系 遗传背景清楚 有动物质量合格证大鼠6 9w Beagle犬6 12m 体重CV 20 各半必要时 可用疾病模型动物进行试验Duration 6m naturaldeath rat 1y 15 1 5y 50 2y 70 80 勤俭办事 服从命令 63 Housing T humidity light ventilation animalfeedsRat 5 cageorseparated acclimation 1wDog TBtest anthelminticacclimation 1 2w 1m 64 饲养管理 65 Drug testarticle solvent excipientname batchNo source specification purity preservecondition etcsamequalitycriterion 66 Route 与临床用药途径一致临床iv 大鼠给药 1月 ip代替im或sc应变换注射部位必要时改变给药途径但应说明原因 67 DoseandGroup 三个给药组 单位 mg ml IU kg或 m2不等浓度等容量给药低剂量组 高于有效剂量 不出现毒性中剂量组 轻微或中等度毒性高剂量组 明显 严重毒性 或个别动物死亡空白对照 溶媒或赋形剂溶媒或赋形剂有毒性时则增加正常对照组阳性对照 68 DoseandGroup 3月 大鼠 各10只 组 3月 大鼠 各20 30只 组大动物 各3 6只 组 69 Corresponddurationofclinicalad withanimalad 70 注 表中给药期限均为最短给药期限 不包括恢复期 均为完整试验 71 Index ClinicalExaminations rodentnon rodentsignsofillhealth pupil Tbehavioralchangesbreath sialosisreactiontotreatmentvomitingDeadormoribundanimal necropsywithin1h 72 Index Hematology 受试物对造血系统有影响 应重视骨髓检查 73 Index ClinicalChemistry 74 Index Urinalysis 75 Index Pathology称重并计算系数 calculateorganweightsrelativetobodyweight pairedorgansweightogether 76 Index Pathology病检脏器组织 77 Index Pathology病检脏器组织 78 Index Pathology heartliverspleenlungkidneybrainadrenalspancreasstomachduodenumjejunumileumcoloncecum 盲 pituitarythymusspinalcordprostatetestesepididymidesuterusovariesopticnerveinjectionsiteboneandmarrowurinarybladderlymphnodes mesenteric local thyroid parathyroidlobes 79 脏器解剖 80 脏器取材样式 SOP 肺脏 脑 81 01 肝脏 02 03 04 05 肾脏 膀胱 心脏 肺 06 脾脏胸腺 07 甲状腺 08 气管 09 脑垂体 10 胃 切片中组织排列和方向 82 Embedding Cutting Staining ImagingAnalysis Facilities LSConfocalMicroscope Microscope 83 大鼠组织脏器取材 组合和排列 84 Index ECG Eye 大动物长期毒性必须做ECG观察指标 心率 P波电压 P R间期 R波电压 QRS时间 ST段 T波电压和Q T间期 85 Recovery Observation 1 3 1 2animal 2 6wLatetoxicreactionandreversibilityItems sameastreatmentperiod 86 测试次数 能反映动态变化一般行为 食量每天观察记录大鼠体重每周一次大动物生理指标每半月一次大动物ECG 导联 给药前 给药期间 停药及恢复期均要检测发现有阳性指标应加大观察密度 87 Observations WesternChineseRecombinant3 4times 2timesantibody 6m rat 9m dog Toxicreaction properties degree dose toxicityrelationship initiatingtime peaktime lastedtime latereactiontoxicity accumulatingtoxi city tolerance 88 Frequencyoflab investigations rat 3mrat6mNon rodentlastad interimtwicepretreatmentrecoveryendlastad onceevery1 3mrecoveryendlastad recoveryend 89 资料整理 首页试验指导者 课题负责人 病理学检查 血液生化指标测定 血液学指标测定及给药观察者第二页摘要第三页正文合理的统计图 表有差异的指标应进行统计处理 90 1首页 2摘要 3正文 91 Problems PretestAnimal HousingRouteDoseDurationObservationIndexToxicokinetcsDatahandlingArchives 92 Pretest Whatdependon Overseaspre clinical clinicaldataAcutetoxicity pharmacodynamicsandpharmacokineticsorintendedclinicaldoseHowlong 2w 1mBiologicalproduct antibody 93 Dose LD50MTDMBSACD3m6m1 10110Cmax50 10030 501 501 35Cmax30 5015 251 1001 10Cmax10 205 10halffordogandmonkey 94 常用动物等效剂量折算表 95 Dose 高剂量原则上应使动物产生明显毒性低毒性药物高剂量的选择 问题 临床拟用剂量可靠吗 高剂量与临床剂量的比值 与动物有效剂量的比值 办法 是否线性动力学 药物完全吸收了吗 毒代动力学证据是否达最大给药浓度和体积 限制性因素 96 分组 分别随机分组开始实验时体重CV 20 大动物 给药前生理生化指标过高或过低的去掉 97 Index PossibleToxicReactionspharmaco chemicalpretestingpublishedlogicaleffctsstructureresultsdata 98 Index hematology chemistry ReticulocytecountASTALPBUNAlb 99 Index pathology Tissue freeoffathalfrationed nochanges 0 suspected 0 5 mild 1 median 2 severe 3Localinflammation WBCinfiltration localbleeding haemostasis suspectedcelldegeneration self infected sacrificeinduced 100 测试方法 简便快速灵敏准确公认 101 Toxicokinetics 毒性剂量系统暴露的代谢动力学可以描述系统暴露与暴露剂量 暴露时间和毒理学结果之间关系目的在于解释长期毒性试验结果 102 Toxicokinetics 合适采样点 获得AUC Cmax Tmax等参数结合药物血浆蛋白结合率评价系统暴露量长毒试验各剂量全部或部分动物 以估算高剂量药物的动力学过程是否属非线性鼓励创新药物进行毒代动力学研究 103 DataHandling Rationdata x s internationalunitvscontrolanddosagegroup vsd0Statistics ttestorFtest Riditanalysis 104 资料整理 rawdata documentation records protocol andamendmentsthereto specimens reservesamplescontrolarticlefinalreport signed 原始资料应保存完好 我国规定原始资料至少保存至生产后5年 105 均值和单个数据 Rodent 组均值 单个动物 背景数据和文献数据可参考Non rodent 数量少 个体差异大 单个动物的试验数据具有重要毒理学意义 须与给药前 对照组和背景数据进行多重比较 文献数据参考价值有限 106 统计学意义和生物学意义 有统计学意义并不一定有生物学意义判断因素数据变化剂量 反应关系其他相关参数改变与历史背景数据比较异常数据合理解释 107 正确判断毒性反应 给药组和对照组之间差异来源与受试物有关的毒性反应动物对药物适应性改变正常生理波动判断关注剂量 反应关系参数变化幅度和性别差异分析毒理学变化参数关联和机制单个参数变化判断应慎重结合TK 108 毒性反应对于临床试验意义 种属差异无关毒性 高剂量 非线性动力学代谢特异反应难以检测 头痛 头昏 头晕 腹胀 皮肤搔痒 视物模糊 疑毒从有 109 综合评价长毒结果 结合药学 药理学 PK TK和其它毒理学研究 临床研究 综合评价找到 不良反应 T D R 毒性靶器官 O 安全范围 S 临床需重点检测指标 及临床监护或解救措施 A 110 Innovative Animal Dose Route Index Datahandling 111 Summary ImportanceObjective DOSTAR MethodsStandard innovative 112 Contents 目的意义急性毒性试验 acute 长期毒性试验 chronic 特殊毒性试验 遗传 生殖 致癌 其它毒性试验 过敏 刺激etc 药物非临床研究质量管理规范 GLP SFDA新药审评会案例学习 113 特殊毒性试验 致突变试验 遗传毒性试验 生殖毒性试验致癌试验 114 目的意义 研究是否会引起畸胎 肿瘤 对遗传物质是否有损伤等特殊毒性试验存在着种属差异性定性差异定量差异 115 定性差异 116 定量差异 致畸剂量在人与动物 动物与动物间差异明显 117 人类与动物致畸剂量比较 118 致突变试验 微生物回复试验 Ames试验 哺乳动物培养细胞基因突变试验 果蝇伴性隐性致死试验染色体畸变试验 啮齿动物显性致死试验 精原细胞染色体畸变试验动物微核试验 程序外DNA合成 UDS 试验 SOS显色试验 119 生殖毒性试验 一般生殖毒性试验致畸敏感期毒性试验围产期毒性试验 120 致癌试验 短期致癌试验哺乳动物培养细胞恶性转化试验小鼠肺肿瘤诱发短期试验长期致癌试验 121 何时做致癌试验 受试品或其代谢产物与已知致癌物结构相似受试品长期毒性试验中发现有细胞毒作用或某些脏器 组织细胞异常显著活跃受试品致突变试验结果为阳性临床用药 6m报送致癌试验资料 先做短期 阴性者不必做长期 122 Peroxisomeproliferator activatedreceptors 123 DrugLeadScreening Docking ComplementarityShapeChemicalElectrostatic 124 PPARSignalingPathway 西格列羧 125 有关问题 受试物配制不能注射给药 可改为灌胃 研磨均匀细菌或细胞试验时 灭菌后使用剂量设计参考LD50 MTD制备困难 价格昂贵 允许用多少倍ACD或MTD来表示染色体畸变试验 毒性很低不能测出50 细胞生长抑制浓度时 最高浓度 10mM 126 有关问题 结果判定阳性 有统计学意义 量 效关系 可重复阴性 结合是否达到MTD 有无阳性对照 127 其他试验 皮肤给药毒性试验皮肤给药的急性毒性试验皮肤给药的长期毒性试验皮肤刺激试验皮肤过敏试验皮肤光敏性试验 128 其他试验 腔道用药毒性试验眼刺激试验滴鼻剂和吸入剂急性毒性试验滴鼻剂和吸入剂刺激试验直肠 阴道用药急性毒性试验直肠 阴道用药刺激试验 129 其他试验 药物依赖性试验身体依赖性试验自然戒断试验替代试验催促试验诱导试验精神依赖性试验 130 皮肤给药急性毒性试验 给药前24h脱毛 10 体表面积 必要时破损皮肤 膏剂 液体 粉末 用赋形剂 羊毛脂 凡士林等 混匀 确保与皮肤良好接触24h 观察 14d观察指标同急性毒性 131 皮肤给药长期毒性试验 给药前24h脱毛 10 体表面积 必要时破损皮肤 膏剂 液体 粉末 用赋形剂 羊毛脂 凡士林等 混匀 确保与皮肤良好接触6h给药周期 观察指标同长期毒性 132 皮肤刺激试验 给药前24h脱毛 必要时破损皮肤 左右自身对比膏剂 液体 粉末 用赋形剂 羊毛脂 凡士林等 混匀 0 5ml 确保与皮肤良好接触 4h贴敷结束除去受试物并用温水或无刺激性溶剂清洁 133 皮肤刺激试验 去药后30 60min 24 48 72h肉眼观察评分持久性损伤 延长期一般 14d中度及以上刺激性进行病检多次给药每次去除药物后1h以及再次贴敷前观察及记录 并对红斑及水肿进行评分末次给药后的操作与单次给药相同 134 皮肤刺激反应评分标准 135 皮肤刺激强度评价标准 136 眼刺激试验 家兔 3只 组 生理盐水对照 左右侧自身对比受试物 0 05 0 1ml或0 1g 轻合眼睑10秒单次给药 药后1 2 4 24 48和72h眼检72h未见任何刺激症状 试验结束 如存在持久性损伤 观察期延长 21d多次给药 临床用药频率相同 连续给2 4周 每天给药前眼检每组总积分除以动物数得最后分值 判断刺激性 137 眼刺激试验 角膜评分 138 眼刺激试验 虹膜评分 139 眼刺激试验 结膜评分 140 眼刺激性评价标准 141 过敏性试验 皮肤过敏试验豚鼠 GPMT GuineaPigMaximizationTest 用佐剂 BT BuehlerTest 小鼠 MEST Mouseearswellingtest LLNA Locallymphnodeassay 注射给药过敏试验全身主动过敏试验 activesystemicanaphylaxisASA 豚鼠 被动皮肤过敏试验 passivecutaneousanaphylaxisPCA 大鼠 142 皮肤过敏试验 GPMT和BT试验动物皮内注射或涂皮给药 经10 14天诱导后激发阳性药 巯基苯并噻唑 苯佐卡因 二硝基氯苯动物 受试物组 20只 对照组 10只剂量 皮内注射剂量达轻 中度刺激性 作为诱导剂量 激发剂量以不产生刺激性为高剂量 143 MaximizationTest MT cliphair 4 6cm2 saline FCA testsubstance testsubstance FCA 0 05ml site皮内 1 PrimaryInduction Day1 D1 7 8 21 22 23 24 induction induction SLS challenge judge 144 10 SLSinvaseline 0 25gopensmear 2 SecondInduction MaximizationTest MT Closedpatchoftestarticle 0 4ml g 2 4cm2patch For48h 24hlater Day7 Day8 145 3 Challenge 4 Removepatchandjudge MaximizationTest MT 1 5 1 5cm2patch 0 1mlor0 1gtestarticle Closedpatchfor24h Day21 cliphair Judge1 1hJudge2 24hafterpatchremovalJudge3 48h Day22 24 146 Skinreaction 半定量方法 照片 Subjectivegrading DraizescoreShouldkeepphotos 147 皮肤过敏反应评分标准 148 皮肤过敏性评价标准 当过敏反应发生率为0时 可判为未见皮肤过敏反应 149 Disadvantageofguineapigtests Subjectivelongduration MT 24d Buehler 38d moreanimals highcost 150 MouseModel mouseearswellingtest MEST locallymphnodeassay LLNA 1 Objective endpoints 2 shortduration3 lessanimals lowcostDisadvantage lowsensitivity OECDGuideline406 MESTLLNA Firststage guineapigtests Maynotbenecessary guineapigtests mustbeconducted 151 LLNA试验方案 甲基脱氧胸腺嘧啶5 碘去氧脲苷 152 LLNA分析评价 计算每一个动物 或一个剂量组全部动物 3H Tdr渗入淋巴细胞的dpm受试物dpm 对照物dpm Tdr胸腺嘧啶脱氧核苷 dpm每分钟衰变数 153 10 14dlaterGetserum Sensitizeanimal iv antigen Evansblue Challenge id normalanimal0 1ml 3 4cm2 blueleakagearea Evansblue 30minlater cutbackskin diameter 5mm Positive ivoriporscrat 隔日1次 3 5次 24hlater 稀释 阴性对照阳性对照低剂量组高剂量组 n 6 被动皮肤过敏试验PCApassivecutaneousanaphylaxis 154 155 156 IgE antigenmastcellandbasophilreleasegranule mediatorSystemicallergy Sensitizeanimal 10 14dlateriv AntigenChallenge immediateallergy Judge ivoriporscGP