PCR技术及其应用.ppt

第六章PCR技术及其应用 1PCR技术原理 2PCR技术应用 第一节PCR技术原理 一 PCR技术简史 DNA的复制聚合酶链反应的发明 PCR技术简史 DNA的复制聚合酶链反应的发明 引物酶 引物酶 PCR技术简史 DNA的复制聚合酶链反应的发明 DNA聚合酶 DNA聚合酶 PCR技术简史 DNA的复制聚合酶链反应的发明 PCR技术简史 DNA的复制聚合酶链反应的发明 KaryB Mullis 1989年美国 Science 杂志列PCR为十余项重大科学发明之首 比喻1989年为PCR爆炸年 Mullis荣获1993年度诺贝尔化学奖 引物 引物 Mullis的构思 DNA聚合酶 DNA聚合酶 特定DNA片段 TaqDNA聚合酶 thermusaquaticus 酶活性 温度 405060708090100 10080604020 72 94 55 PCR循环 二 PCR的基本原理 类似于DNA的体内复制 首先待扩增DNA 模板加热变性解链 随之将反应混合物冷却至某一温度 这一温度可使引物与它的靶序列发生退火 再将温度升高使退火引物在DNA聚合酶作用下得以延伸 这种热变性 复性 延伸的过程就是一个PCR循环 PCR就是在合适条件下的这种循环的不断重复 PCRCycle Step1 DenaturationTemplateDNAbyHeat 95oC TargetSequence TargetSequence PCR原理示意图 模板DNA的变性 模板DNA经加热至93 左右一定时间后 使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离 使之成为单链 以便它与引物结合 为下轮反应作准备 PCRCycle Step2 Temperatureislowered Tm andprimersannealtotargetsequences TargetSequence TargetSequence Primer1 Primer2 5 3 5 5 3 5 3 3 模板DNA与引物的退火 复性 模板DNA经加热变性成单链后 温度降至55 左右 引物与模板DNA单链的互补序列配对结合 PCRCycle Step3 At72oCTaqDNApolymerasecatalysesprimerextensionascomplementarynucleotidesareincorporated TargetSequence TargetSequence Primer1 Primer2 5 3 5 5 3 5 3 3 TaqDNAPolymerase 引物的延伸 DNA模板 引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下 以dNTP为反应原料 靶序列为模板 按碱基配对与半保留复制原理 合成一条新的与模板DNA链 Endofthe1stPCRCycle Resultsintwocopiesoftargetsequence TargetSequence TargetSequence 每完成一个循环需2 4分钟 2 3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍 TargetAmplification No ofNo AmpliconCyclesCopiesofTarget122438416532664201 048 576301 073 741 824 1cycle 2Amplicon 2cycle 4Amplicon 3cycle 8Amplicon 4cycle 16Amplicon 5cycle 32Amplicon 6cycle 64Amplicon 7cycle 128Amplicon 三 PCR反应 PCR反应条件PCR过程PCR的特点 PCR仪 PCR反应 PCR反应条件PCR过程PCR的特点 PCR反应 PCR反应条件PCR过程PCR的特点 重复1 3步25 30轮 目的DNA片段扩增100万倍以上 DNA双螺旋 DNA单链与引物复性 DNA变性形成2条单链 子链延伸DNA加倍 模板DNA PCR的基本原理 PCR反应条件PCR过程PCR的特点 引物1 引物2 PCR的基本原理 PCR反应条件PCR过程PCR的特点 引物1 引物2 Taq酶 Taq酶 PCR的基本原理 PCR反应条件PCR过程PCR的特点 第1轮结束 第2轮开始 PCR的基本原理 PCR反应条件PCR过程PCR的特点 Taq Taq Taq Taq PCR的基本原理 PCR反应条件PCR过程PCR的特点 第2轮结束 PCR的基本原理 PCR反应条件PCR过程PCR的特点 模板DNA 第1轮扩增 第2轮扩增 第3轮扩增 第4轮扩增 第5轮扩增 第6轮扩增 理想拷贝数 2nn循环次数实际拷贝数 1 x nX平均效率 约为0 85n循环次数 PCR反应 PCR反应条件PCR过程PCR的特点 1 PCR反应成分 1 模板单 双链DNA均可 不能混有蛋白酶 核酸酶 DNA聚合酶抑制剂 DNA结合蛋白类 一般100ngDNA模板 100 L 模板浓度过高会导致反应的非特异性增加 四 PCR反应体系 2 引物浓度0 1 0 5 mol L浓度过高易导致模板与引物错配 反应特异性下降 3 TaqDNA聚合酶 thermusaquaticus 0 5 2 5U 50 l酶量增加使反应特异性下降 酶量过少影响反应产量 4 dNTPdNTP浓度取决于扩增片段的长度四种dNTP浓度应相等浓度过高易产生错误碱基的掺入 浓度过低则降低反应产量dNTP可与Mg2 结合 使游离的Mg2 浓度下降 影响DNA聚合酶的活性 5 Mg2 Mg2 是DNA聚合酶的激活剂 0 5mmol L 2 5mmol L反应体系 Mg2 浓度过低会使Taq酶活性丧失 PCR产量下降 Mg2 过高影响反应特异性 Mg2 可与负离子结合 所以反应体系中dNTP EDTA等的浓度影响反应中游离的Mg2 浓度 2 循环参数变性使双链DNA解链为单链95oC20 30秒 2 退火温度由引物长度和GC含量决定 增加温度能减少引物与模板的非特异性结合 降低温度可增加反应的灵敏性 3 延伸70 75oC 延伸时间由扩增片段长度决定 4 循环次数主要取决于模版DNA的浓度一般为25 35次次数过多 扩增效率降低错误掺入率增加 五 PCR引物的设计一般原则 引物长度一般以18 30bp为宜 过短则降低特异性 过长则会引起引物间的退火而影响有效扩增 同时也增加引物合成的成本 避免引物内部出现二级结构 避免序列内有较长的回文结构 使引物自身不能形成发夹结构 G C和A T碱基均匀分布 G C含量在40 60 之间 引物碱基序列尽可能选择碱基随机分布 避免出现嘌呤或嘧啶连续排列 要避免两个引物间特别是3 末端碱基序列互补以及同一引物自身3 末端碱基序列互补的 使它们不能形成引物二聚体或发卡结构 引物3 末端碱基一般应与模板DNA严格配对 并且3 末端为G C或T时引发效率较高 引物5 末端碱基可不与模板DNA匹配 可添加与模板无关的序列 如限制性核酸内切酶的识别序列 ATG起始密码子或启动子序列等 便于克隆和表达 但其保护碱基有一定的要求 引物的碱基顺序不能与非扩增区有同源性 六 PCR中应注意的事项 一 防止污染试剂小量分装吸头及EP管一次性使用器皿及工作区域要分开 无菌操作 二 设立对照 阳性对照 阳性模板阴性对照 阴性模板试剂对照 除模板外的所有组分 第二节PCR技术应用 一 PCR技术的主要类型 反向PCR 锚定PCR 不对称PCR 原位PCR RT PCR 重组PCR 差异显示PCR 免疫PCR 实时定量PCR 多重PCR 1 反向PCR reversePCR 是用反向的互补引物来扩增两引物以外的DNA片段对某个已知DNA片段两侧的未知序列进行扩增 可对未知序列扩增后进行分析 如探索邻接已知DNA片段的序列 用于仅知部分序列的全长cDNA的克隆 扩增基因文库的插入DNA 建立基因组步移文库 已知序列 未知序列 未知序列 已知序列 未知序列 未知序列 限制酶 限制酶 连接酶 2 不对称PCR目的 扩增产生特异长度的单链DNA 方法 采用两种不同浓度的引物 分别称为限制性引物和非限制性引物 其最佳比例一般是0 01 0 5 M 关键是限制性引物的绝对量 用途 制备核酸序列测定的模板制备杂交探针基因组DNA结构功能的研究 高浓度引物 低浓度引物 3 RT PCR 是以反转录的cDNA作模板所进行的PCR反应 用于测定基因表达的强度和鉴定已转录序列是否发生突变 呈现mRNA多态性 克隆mRNA的5 和3 末端序列 以及从非常少量的mRNA样品构建大容量的cDNA文库 逆转录酶 聚合酶 mRNA cDNA 杂化双链 PCR扩增 基因 mRNA 蛋白质多肽链 4 多重PCR 在一个反应体系中使用一对以上引物的PCR称为多重PCR 其结果是产生多个PCR产物 用于检测特定基因序列的存在或缺失 电泳 引物 5 实时定量PCR技术原理 实时定量PCR 也称TaqManPCR 以下简称FQ PCR 是美国PE PerkinElmer 公司1995年研制出来的一种新的核酸定量技术 该技术是在常规PCR基础上加入荧光标记探针来实现其定量功能的 与变通PCR相比 FQ PCR具有许多优点 实时定量PCR real timePCR 通过特定设计的PCR仪器来实时检测PCR扩增过程每一轮循环产物的累积数量 可以很好的推算模板的起始浓度 这种工作方式称为实时定量PCR 实时荧光定量PCR 实时定量PCR在检测过程中通过检测标记的荧光信号的累积来实时监测整个PCR进程 最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析 故称为实时荧光定量PCR 原理和方法FQ PCR的工作原理是利用Taq酶的5 3 外切酶活性 在PCR反应系统中加入一个荧光标记探针 该探针可与引物包含序列内的DNA模板发生特异性杂交 探针的5 端标以荧光发射基因FAM 荧光发射峰值在518nm处 靠近3 端标以荧光淬灭基团TAMRA 荧光发射峰值在582nm处 探针的3 端被磷酸化以防止探针在PCR扩增过程中被延伸 当探针保持完整时 淬灭基团抑制发射基团的荧光发射 发射基团一旦与淬灭基团发生分离 抑制作用被解除 518nm处的光密度增加而被荧光探测系统检测到 复性期探针与模板DNA发生杂交 延伸期Taq酶随引物延伸沿DNA模板移动 当移动到探针切断 淬灭作用被解除 荧光信号释放出来 模板每复制一次 就有一个探针被切断 伴随一个荧光信号的释放 由于被释放的荧光基团数目和PCR产物数量是一对一的关系 因此用该技术可对模板进行准确定量 实时PCR技术原理 实验仪器一般使用PE公司研制的ABI7100型PCR扩增仪 也可用其它PCR仪 如果用ABI7700型反应型反应系统进行实验 反应结束后 通过电脑分析 可直接给出定量结果 如果用其他PCR仪 则需要同时使用荧光探测仪测量反应管中的荧光信号 计算出RQ RQ RQ RQ 代表样品管荧光发射基团发光强度与淬灭基团发光强度的比率 RQ 代表空白管中二者的比率 RQ RQ RQ RQ 代表PCR过程中荧光信号变化量 经过数据处理 即可得出定量结果 由于荧光探针的引入 显著提高了实验的特异性 探针设计一般应符合以下条件 探针长度应在20 40个碱基左右 保证结合特异性 GC碱基含量在40 60 避免单核苷酸序列的重复 避免与引物发生杂交或重叠 探针与模板结合稳定程度要大于引物与模板结合的稳定程度 因此探针的Tm值要比引物的Tm值至少高出5 另外 探针的浓度 探针与模板序列的同源性 探针与引物的距离都对实验结果有影响 特点FQ PCR不仅具有普通PCR的高灵敏性 而且由于荧光探针的应用 可以通过光电传导系统直接探测PCR扩增过程中荧光信号的变化以获得定量结果 所以还具有DNA杂交的高特异性和光谱技术的高精确性 克服了常规PCR的许多缺点 FQ PCR只须在加样时打开一次盖子 其后的过程完全是闭管操作 不需要PCR后处理 避免了常规PCR操作中的诸多弊端 1病原体测定由于PCR技术的问世 使得病原体检测能够快速而方便的进行 但由于其高灵敏性 实验操作很容易受到污染而出现假阳性 只要有微量病原体存在 PCR扩增即可为阳性结果 但并不能作为诊断依据 只有当一定数量的病原体存在时才有临床意义 因此结模板定量显得特别重要 常规PCR由于不能定量而限制了其应用 然而 PE公司研制的FQ PCR技术给解决这一问题提供了可能 目前该技术已经应用于丙肝病毒 人类乳头瘤病毒 结核杆菌和食品中大肠杆菌等许多病原体的检测研究 Morris等用FQ PCR对黑猩猩丙型肝炎动物模型和临床丙型肝炎患者血清中丙肝病毒 HCV 进行了研究 FQ PCR技术在保持巢式PCR高度敏感性的同时又能提高效率 因此可作为一种检测HCV的有效方法 同时 由于FQ PCR可以测出血清中病原体浓度 故可给药物治疗及疗效观察提供参考依据 以前常规检测大肠杆菌的方法 都因为繁琐 需要大量的PCR后处理过程及不能对标本定量而受到限制 美国Witham等1996年将FQ PCR技术应用于牛肉中大肠杆菌志贺氏毒素基因的检测研究 针对不同血清变异型的大肠杆菌 他们设计应用不同的探针 从而提高了实验特异性 他们同时还对探针相对于引物的位置 反应液中探针浓度 镁离子浓度等影响实验的因素进行了优化实验 以提高实验的准确性和精确性 由于TaqMan系统可以一次测量96管样品 还可对模板进行准确定量 又不需要进行电泳及EB染色后处理过程 实际应用方便 从而提高了实验的参考价值和应用价值 因此该实验方法是食品检测方面的一个突破 2 肿瘤研究意大利Gelmini等用FQ PCR技术检测乳腺癌标本c erbB 2基因拷贝数目变异情况 他们以 肌动蛋白基因为参照探索最佳实验条件 当扩增循环数在28 31之间时 RQ与模板DNA有着较好的剂量依赖关系 他们在此条件下扩增了c erbB 2基因和 球蛋白基因 发现 RQ都与各自的模板DNA浓度存在着线性关系 虽然二者斜率不同 但是各个实验浓度下二者的 RQ之比却是恒定的 说明尽管二者发光效率不同 却不影响定量效果 他们将实验数据与Southern印迹结果和已报告的竞争性PCR结果比较都显示高度相关性 n 25 r 0 94 P 0 01 3 基因表达研究由于TaqMan系统及荧光探针的应用 对mRNA的检测显得较以前常用的方法如Northern印迹 RT PCR定量法要方便 快速 准确得多 为了探测骨髓基质血小板生成因子 TPO 在巨核细胞生成过程中的作用以及血小板生成因子在特发性血小板减少性紫瘢 ITP 再生障碍性贫血 AA 和特发性血小板多症 ET 等疾病过程中的病理生理意义 日本Hirayama等用TaqManEZRT PCR试剂盒在ABI7700反应系统测定了正常人和ITP AA ET病人的骨髓基质细胞TPOmRNA水平 又用ELISA方法测定了骨髓和末梢血的TPO浓度 结果显示ITP和AA病人TPOmRNA水平明显升高 而ET病人的TPOmRNA水平则正常 经类固醇治疗后ITP病人TPOmRNA水平下降 骨髓TPO的浓度与其mRNA水平有相关性 在正常人和ITP病人 TPOmRNA表达水平与巨核细胞计数也有相关性 这个实验对阐明TPO的作用提供了依据 4 免疫组份分析对免疫T细胞群体V 组份进行分析是研究健康和疾病免疫应答反应的重要手段 可通过流式细胞法或RFQ PCR法来进行 1997年Lang等用FQ PCR技术进行实验 他们在反应系统中引入荧光探针 将下游引物与探针固定 然后 针对不同的V 成份 选用特异的上游引物进行扩增 再对反应中产生的荧光信号进行处理 即可获得各个成份的数据 5 基因突变及多态性的研究美国Ibrahim等1997年用FQ PCR技术对正常痘病毒多态性进行了研究 他们采用一对可与正常痘病毒血凝素基因的某一DNA片段结合的引物 并设计两个有单核苷酸差异的寡核苷酸探针 用荧光标记后进行实验 顺利地把有此单核苷酸差异的两个痘病毒株进行鉴定 该技术也可用于猴痘和病毒DNA疫苗的单核苷酸变异多态的研究 6 其他方面日本Isono利用FQ PCR进行叶绿体成熟度与其基因组拷贝数关系的研究 他们以核基因Cab作为内参照 进行叶绿体基因rbc1拷贝数测定 结果发现子叶出现以后 叶绿体基因拷贝数显著增加 进而把叶绿体的基因拷贝数增加与光诱导的叶绿体成熟过程联系起来 1998年美国Higgins等还建立起一套用荧光探针检测鼠疫纤溶酶原激活基因 pla 的实验方法 综上所述 FQ PCR作为一种核酸定量技术 应用较多且较成熟的主要是在病原体检测方面 其优越性在此方面也得以充分体现 因此将该项技术进一步开发应用于临床 具有很大潜力 但是在遗传病和肿瘤研究方面 尤其是基因表达的研究 该技术目前应用的还较少 在此方面加强研究应用 将会有广阔的前景 二 PCR技术应用 研究基因克隆 DNA测序 分析突变诊断细菌 病毒 寄生虫检测 诊断人类基因组工程遗传图谱的构建 DNA测序 表达图谱法医犯罪现场标本分析肿瘤各种肿瘤检测其他 本章重点掌握的内容 掌握RT PCR 反向PCR 多重PCR 实时荧光定量PCR的概念 PCR的基本原理PCR引物设计的一般原则 1 要求将下面基因片段克隆至表达载体pET 28相应位点上 并获得此基因的表达 ATGGGTCGGGATCCTGATACAGATAATAATTTCTCAAAGGACCATGGTTGGTATTTAGCTTATTCTATACCTGACACAGGGGAATCACAAATAAGAAAATTTTCAGCATTAGCTAGATATGAATGGCAAAGAGGAAACTATAAACAAGCTACATTCTATCTTGGAGAGGCTATGCACTATTTTGGAGATATAGATACTCCATATCATCAAGCTTATGTTACTGCCGTTGATAGCGCAGGACATGTTAAGTTTGAGACTTTTGCAGAGGAAAGAAAAGAACAGTATAAAAT