基因工程抗体类药物的发展.doc

基因工程抗体类药物的发展XXX（师范学院 生科学院 08级2班）摘要：基因工程抗体药物的发展经历了鼠源单克隆抗体(McAb) 、人2鼠嵌合抗体、人源化抗体和全人抗体等阶段。目前临床治疗中人抗鼠抗体反应的出现使鼠源性单克隆抗体的应用受到了极大的限制。为降低其免疫原性, 人们利用基因工程技术对鼠源抗体进行改造, 以减少其鼠源成分。简要概述了目前研究比较多的几种基因工程抗体及其临床应用。关键词：基因工程抗体，嵌合抗体，抗体人源化。Abstract: genetic engineering antibody drugs development has experienced rat source monoclonal antibodies (McAb), 2 chimeric antibody, RenYuan of rat antibody and all-round antibody stage. Currently clinical treatment middleman resistance rat antibody response appearance of rat source sex of monoclonal antibodies applications received great restrictions. To reduce its immunogenicity, people use genetic engineering technology to rat antibody modification, in order to reduce its rat source composition. Briefly summarizes the current research more several genetic engineering antibody and its clinical application.Keywords: genetic engineering antibody, chimeric antibody, antibody RenYuan glycosylated.单克隆抗体技术自1975年问世至今，已被广泛地应用于疾病的诊断及治疗中，但是，目前应用的单克隆抗体绝大数是鼠源性的，临床重复给药时机体会产生免疫反应。应用于临床的理想抗体应该是人源性的，而人-人杂交瘤技术目前进展缓慢，即使研制成功，仍存在杂交瘤细胞体外传代不稳定，产量不高及抗体亲合力低等缺陷。迄今为止，解决这一问题最理想的途径就是研制基因工程抗体。基因工程抗体的研究兴起于20世纪80年代早期，这一技术是将对免疫球蛋白（immunogloblin，简称Ig）基因结构与功能的认识与DNA重组技术有机结合，在基因水平上对Ig分子进行重组后导入受体细胞表达出来的，继多克隆血清和单克隆抗体之后，基因工程抗体也被称为第三代抗体。1基因工程抗体概述：基因工程抗体, 即应用基因工程技术将抗体的基因重组并克隆到表达载体中, 在适当的宿主中表达并折叠成有功能的一种抗体分子。基因工程抗体具有分子小、免疫原性低、可塑性强及成本低等优点。此技术的基本原理是1, 首先从杂交瘤或免疫脾细胞、外周血淋巴细胞等中提取mRNA, 逆转录成cDNA, 再经PCR 分别扩增出抗体的重链及轻链基因, 按一定的方式将两者连接克隆到表达载体中, 并在适当的细胞( 如大肠杆菌、CHO 细胞、酵母细胞、植物细胞及昆虫细胞等) 中表达并折叠成有功能的抗体分子, 筛选出高表达的细胞株, 再用亲和层析等手段纯化抗体片段。基因工程抗体技术的着眼点在于尽量减少鼠源成分, 保留原有抗体的亲和力和特异性。借助于基因工程技术, 既可以对完整抗体, 又可以对抗体片段进行改造。抗体是“Y”字型的四肽链结构2, 由2 条相同的重链(H 链)和2 条相同的轻链( L 链) 借助二硫键连接而成。分析不同的免疫球蛋白的重链和轻链氨基酸序列时发现, 在多肽链N 端, 占轻链的约1 /2( 含107130 个氨基酸残基) 或重链的约1 /4( 含107130 个氨基酸残基) 的区域, 氨基酸排列顺序随抗体特异性的不同而有所变化, 称为可变区(V 区) , V 区中的高变区(HVR) 是抗体与抗原( 表位) 特异性结合的位置, 因HVR 序列与抗原表位互补, 故亦称互补决定区(CDR) 。V 区中氨基酸组成和排列顺序变化小的部分为骨架区( FR) 。V 区的3 个CDR 分别被4 个FR( 14) 所隔开。多肽链的C 端, 占轻链的1 /2 和重链的3 /4 的区域,其氨基酸数量、种类、排列顺序及含糖量均较稳定, 故称为恒定区(C 区) 。基因工程抗体主要是相对这些区域进行改造所得到。2基因工程抗体的表达系统构建：为了克服鼠源性单抗药物在应用中的限制,人们尝试对其进行抗体人源化改造。这一研究主要经历了三个阶段, 即嵌合抗体、改型( comp lementarydetermination region, CDR 移植)或表面重塑抗体和抗体库技术,多数资料对其进行了描述,这里不再重复。结合最新的研究进展34 ,按照其构建的原理及方式，可以把重组抗体分成三类即嵌合抗体、人源化抗体和人源抗体,将其比较整理,见表1。从理论上来讲,以上方法构建的重组抗体基因,应当能够产生相应预期功能的抗体分子。但是,由于不同表达系统之间差异悬殊,实验室结果也不尽相同,所以,重组抗体的表达也不是一概而论的,最终要依据每一个抗体的性质和表达效果而定。这里将常见可用于重组抗体的表达系统归纳于表2。表1重组抗体的分类类型构建原理人源化程度亲和力备注嵌合抗体鼠源的可变区序列插入到含有人抗体恒定区的表达载体中70%很好仍然可以诱发HAMA反应人源化抗体1 改型抗体鼠CDR区移植到人单抗骨架90%95% 以上2 表面重塑对鼠CDR或FR表面残基修饰人源(全人)抗体1 抗体库核糖体、噬菌体展示技术100%10-710-8mol/L要求库容量106 109 ;大容量是关键2 转基因鼠技术表2重组抗体的表达系统表达体系特点及应用备注大肠杆菌大肠杆菌常用于高效表达Fv、Fab、ScFv等功能片段缺少转录及翻译后加工机制,表达的蛋白质不能适当折叠、糖基化修饰或正确形成二硫键酵母具有强启动子,可对表达蛋白质进行翻译后加工与修饰昆虫杆状病毒昆虫杆状病毒可正确完成蛋白质翻译后加工和糖基化大批量生产有一定困难哺乳动物细胞正确地翻译后修饰、遗传稳定,成为嵌合抗体最适合的宿主常用细胞有非洲绿猴肾(COS)细胞、骨髓瘤细胞Sp2 /0、中国仓鼠卵巢(CHO)植物表达系统可表达多种形式的抗体在蛋白质糖基化上与动物细胞略有差异转基因动物表达量高,与天然产物完全一致,分离纯化容易3人源化抗体的产生：人源化抗体已被广泛用于临床治疗、诊断和科研中, 这种需求不仅仅是数量上的增加, 还对诸如抗体的亲和力等质量问题也提出了更高的要求。目前, 利用噬菌体抗体库技术和转基因鼠获得人源化抗体已成为一大热点。3.1 利用噬菌体抗体库技术获得的人源化抗体：噬菌体抗体库( phage antibody library) 技术是20 世纪90 年代初期抗体工程领域的重大研究进展, 它结合了噬菌体展示与抗体组合文库技术, 把外源的DNA 插入噬菌体编码的外壳蛋白p或p的基因中, 使外源DNA 片段对应的表达产物融合在噬菌体外壳蛋白中形成融合蛋白。此方法包括噬菌体库的产生、结合抗原的展示抗体的筛选、展示有高亲和力抗体的噬菌体扩增、有高亲和力的抗体的分离和定性的具体步骤。其最大的特点和优点是实现了直接将基因型和表型联系在一起, 可以在短时间内提供完全人源化的、高亲和力的抗体。Deng等利用噬菌体抗体库制备重组抗艰难梭菌(Clostridium difficile) 毒素B scFv, 筛选得到的克隆具有较高的检测敏感性和相当的抗原亲和力。由于表达的是人源抗体, 故在临床上可反复大剂量应用而不会出现异体蛋白反应。另外, 该抗体常主要以活性片段的形式表达,即Fv、Fab、F( ab ) 2 等, 较完整抗体的分子小得多, 具有显著的组织穿透性和较高的抗原结合活性5。我国研究者成功地从SARS病毒噬菌体抗体库中筛选出具有中和活性地抗S 蛋白Fab 片段抗体, 体外实验证明其可部分中和SARS 病毒活性, 能明显延缓细胞病变的过程6。3.2 转基因鼠生产人源化抗体：全人抗体还可以通过小鼠的基因工程免疫方法获得。产生一免疫反应的基因工程敲除鼠, 然后用杂交瘤技术使小鼠的脾细胞或淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合。通过灭活内源性的小鼠抗体基因, 然后引进人源抗体基因片段, 当对人源抗体免疫的时候就可以在小鼠体内产生全人抗体分子。另一种方法是将人抗体基因微位点转入小鼠体内细胞, 转染色体小鼠的免疫抗原基因环境和人类非常相似。还有一种不同的方法是向免疫供体或混合性严重免疫缺陷的小鼠注入人源淋巴细胞, 通过抗原免疫使小鼠脾细胞融合骨髓瘤细胞。一般来说, 转基因小鼠是目前生产全人单抗的最理想方法, 但技术难度较大, 并未获得真正的突破。目前, 对人源化抗体的研究主要还是集中在嵌合抗体和CDR移植抗体上。4基因工程抗体的应用前景：全人源抗体的研究在近30 年中得到了极大的发展, 目前全球已有500 余种诊断和治疗用的单克隆抗体投放市场, 100 多种用于临床研究。全人源抗体在医学领域的许多方面都极具应用潜力, 如病毒感染、肿瘤、自身免疫性疾病、同种异体移植物注射、哮喘、中风等疾病治疗, 尤其在诊断和治疗肿瘤疾病及抗感染方面优势明显。但是全人源抗体的研究仍有许多问题等待解决, 如抗体亲和力的成熟、全人源杂交瘤细胞分泌抗体的稳定性、抗体的大规模生产等。随着制备技术的完善和成熟, 全人源抗体必将成为当今以及未来生命科学及生物技术的研究热点和产业化增长点。参考文献：1 李昌龙. 基因工程抗体J. 国外医学临床生物化学与检验学分册,1995,16( 1) : 252 龚非力, 主编. 医学免疫学( 第二版) M. 北京: 科学出版社, 2004。3 沈倍奋,陈志南,刘民培. 重组抗体. 北