核酸及理化性质PPT课件.ppt

核酸是存在于细胞中的一类大分子酸性物质 包括核糖核酸 RNA 和脱氧核糖核酸 DNA 两大类 RNA和DNA都是以单核苷酸为基本单位所组成的多核苷酸长链 RNA主要参与遗传信息的表达 而DNA则是遗传信息的载体 第一节核酸的种类 分布与功能 1 一 核酸的种类与分布 一 核酸的种类 RNA DNA 核糖核酸 ribonucleicacid RNA 转移RNA transferRNA tRNA 信使RNA messengerRNA mRNA 核糖体RNA ribosomalRNA rRNA 小分子细胞核RNA snRNA 染色质RNA chRNA 反义RNA antisenseRNA 双链RNA dsRNA 细胞质小RNA scRNA 具有催化活性的RNA ribozyme 各种病毒RNA 功能 三者共同参与遗传信息的表达 2 脱氧核糖核酸 deoxyribonucleicacid DNA 是遗传信息的载体 负责遗传信息的贮存和发布 3 二 核酸的分布 4 二 核酸的生物学功能 1928年 英国科学家Griffith发现肺炎链球菌使小鼠死亡的原因是引起肺炎 细菌的毒性是由细胞表面中的多糖所决定的 5 1944年 O T Avery 美 肺炎链球菌的转化实验 首次证明DNA是细菌遗传性状的转化因子 十年后证明DNA是遗传物质 6 1952年 美国冷泉港Hershey Chase噬菌体浸染细菌的实验 7 DNA的基本功能是作为遗传信息的载体 为生物遗传信息复制以及基因信息的转录提供模板 DNA分子中具有特定生物学功能的片段称为基因 gene 一个生物体的全部DNA序列称为基因组 genome 基因组的大小与生物的复杂性有关 如病毒SV40的基因组大小为5 1 103bp 大肠杆菌为5 7 106bp 人为3 109bp 一 DNA生物学功能 8 二 RNA生物学功能 RNA的功能 1 参与蛋白质的合成rRNA 75 80 tRNA 10 15 mRNA 2 5 2 遗传物质 病毒 3 具有生物催化剂功能 9 第二节 核酸的化学组成 一 核酸的元素组成基本元素 CHONP核酸的元素组成有两个特点 1 一般不含S 2 P含量较多 并且恒定 9 10 因此 实验室中用定磷法进行核酸的定量分析 DNA9 9 RNA9 5 10 二核酸的分子组成 核酸 DNA和RNA 是一种线性多聚核苷酸 它的基本结构单元是核苷酸 核苷酸本身由核苷和磷酸组成 而核苷则由戊糖和碱基形成所以 核酸 11 NucleotidesLinkedbyPhosphodiesterBond OH Phosphodiesterbond 5 3 1 2 3 5 Akindofphospho polysaccharides JuangRH 2004 BCbasics 12 TheNotationforNucleicAcids P R B P OH 5 3 5 pApTpCpGpApTpCpG OH3 5 pATCGATCG OH3 ATCGATCG 13 TheTwoChainsofDNAAreAntiparallel 5 pCpGpApTpCpGpApT OH3 5 pApTpCpGpApTpCpG OH3 5 3 3 5 14 1 参与DNA RNA的合成 蛋白质的合成 糖与磷脂的合成 2 在能量转化中起重要作用 ATP是生物体内能量的通用货币 3 是构成多种辅酶的成分 NAD NADP FAD FMN和CoA 4 参与细胞中的代谢与调节 cAMP cGMP 3 核苷酸的生物学作用 15 一 核酸的一般物理性质 DNA为白色纤维状固体 RNA为白色粉末状固体 都微溶于水 其钠盐在水中的溶解度较大 但不溶于乙醇 乙醚和氯仿等一般有机溶剂 用乙醇 氯仿从溶液中沉淀核酸 DNA和RNA在细胞中常以核蛋白形式存在 两种核蛋白在盐溶液中的溶解度不同 DNA核蛋白RNA核蛋白0 14mol LNaCl 1 2mol LNaCl 第三节核酸的重要理化性质 16 DNA溶液的粘度很大 而RNA溶液的粘度小得多 核酸发生变性或降解后其粘度降低 核酸受到强大离心力的作用时 可从溶液中沉降下来 其沉降速度与核酸的大小和密度有关 17 二 核酸的两性性质及等电点 与蛋白质相似 核酸分子中既含有酸性基团 磷酸基 也含有弱碱性基团 碱基 因而核酸也具有两性性质 18 由于核酸分子中的磷酸是一个中等强度的酸 而碱基呈现弱碱性 所以核酸的等电点比较低 当核酸分子内的酸性解离和碱性解离相等 本身所带的正电荷与负电荷相等时 此时核酸溶液的pH值即为核酸的等电点pI DNA的等电点为4 4 5 RNA的等电点为2 2 5 核酸在其等电点时溶解度最小 RNA的等电点比DNA低的原因 是RNA分子中核糖基2 OH通过氢键促进了磷酸基上质子的解离 DNA没有这种作用 19 三 核酸的水解 1 核酸的酸解和碱解核酸分子中的磷酸二酯键可在酸或碱性条件下水解切断 降解 酸对核酸的作用因酸的浓度 温度和作用时间不同而不同 嘌呤碱基比嘧啶碱基易被水解下来 20 DNA和RNA对碱的耐受程度有很大差别 在0 3 1mol LNaOH溶液中 在室温至370C条件下RNA几乎可以完全水解 生成2 或3 磷酸核苷 DNA在同样条件下则不受影响 若加温至1000C 4个小时也可得到小分子的寡聚脱氧核苷酸 这种水解性能上的差别 与RNA核糖基上2 OH的羟基参与作用有很大的关系 在RNA水解时 2 OH首先进攻磷酸基 在断开磷酯键的同时形成环状磷酸二酯 再在碱的作用形成水解产物 21 2 核酸的酶解 生物体内存在多种核酸水解酶 这些酶可以催化水解多聚核苷酸链中的磷酸二酯键 以DNA为底物的DNA水解酶 DNases 以RNA为底物的RNA水解酶 RNases 22 根据作用方式又分作两类 核酸外切酶和核酸内切酶 核酸外切酶的作用方式是从多聚核苷酸链的一端 3 端或5 端 开始 逐个水解切除核苷酸 核酸内切酶的作用方式刚好和外切酶相反 它从多聚核苷酸链中间开始 在某个位点切断磷酸二酯键 小球菌核酸酶即可外切又可内切 在分子生物学研究中最有应用价值的是限制性核酸内切酶 这种酶可以特异性的水解核酸中某些特定碱基顺序部位 23 四 核酸的紫外吸收 在核酸分子中 由于嘌呤碱和嘧啶碱具有共轭双键体系 因而具有独特的紫外线吸收光谱 一般在260nm左右有最大吸收峰 可以作为核酸及其组分定性和定量测定的依据 24 五 核酸的变性 复性与杂交 核酸的变性是指核酸双螺旋区的氢键断裂 变成单链结构的过程 变性核酸将失去其部分或全部的生物活性 核酸的变性并不涉及磷酸二酯键的断裂 所以它的一级结构 碱基顺序 保持不变 能够引起核酸变性的因素很多 温度升高 酸碱度改变 甲醛和尿素等的存在均可引起核酸的变性 25 1 DNA的变性 在理化因素作用下 DNA双螺旋的两条互补链松散而分开成为单链 从而导致DNA的理化性质及生物学性质发生改变 这种现象称为DNA的变性 引起DNA变性的因素主要有 高温 强酸强碱 有机溶剂等 26 实质破坏DNA的空间结构 DNA的变性 27 DNA变性后的性质改变 增色效应 指DNA变性后对260nm紫外光的光吸收度增加的现象 旋光性下降 粘度降低 浮力密度增大 分子量不变 生物学功能丧失或改变 28 2 RNA变性RNA本身只有局部的双螺旋区 所以变性行为所引起的性质变化没有DNA那样明显 利用紫外吸收的变化 可以检测核酸变性的情况 因为天然状态的DNA在完全变性后 紫外吸收 260nm 值增加25 40 而RNA变性后 约增加1 1 29 2020 1 7 30 3 DNA的热变性和解链温度 Tm 用加热的方法使DNA变性叫做热变性 DNA的变性过程是突变性的 它在很窄的温度区间内完成 因此 通常将DNA的变性达到50 时 即增色效应达到一半时的温度称为DNA的解链温度 meltingtemperature Tm Tm也称熔解温度或DNA的熔点 一般DNA的Tm值在70 85 C之间 31 DNA的变性温度 加热DNA溶液 使其对260nm紫外光的吸收度突然增加 达到其最大值一半时的温度 就是DNA的变性温度 融解温度 Tm 32 Tm的高低与DNA分子中G C的含量有关 G C的含量越高 则Tm越高 DNA两股之间的吸引力不同 CG之间有3个氢键 而AT之间2个 33 G和C的含量高 Tm值高 因而测定Tm值 可反映DNA分子中G C含量 可通过经验公式计算 G C Tm 69 3 X2 44 34 DNA变性 35 4 核酸的复性 变性DNA在适当的条件下 两条彼此分开的单链可以重新缔合成为双螺旋结构 这一过程称为复性 DNA复性后 一系列物理 化学性质将得到恢复 DNA复性的程度 速率与复性过程的条件有关 36 将热变性的DNA骤然冷却至低温时 DNA不可能复性 但是将变性的DNA缓慢冷却时 可以复性 这一过程也叫退火 annealing 分子量越大复性越难 浓度越大 复性越容易 此外 DNA的复性也与它本身的组成和结构有关 复性反应的速度用Cot1 2表示 Co为变性DNA复性时的浓度 t为时间 以秒表示 37 DNA的复性 定义恢复到天然双螺旋结构的现象复性的条件 足够高的盐浓度 适当的温度 恰当的复性时间 38 DNA复性 39 5 核酸的杂交 hybridization 杂交的基础是DNA的复性 热变性的DNA单链 在复性时并不一定与同源DNA互补链形成双螺旋结构 它也可以与在某些区域有互补序列的异源DNA单链形成双螺旋结构 这样形成的新分子称为杂交DNA分子 DNA单链与互补的RNA链之间也可以发生杂交 核酸的杂交在分子生物学和遗传学的研究中具有重要意义 40 两条来源不同的单链核酸 DNA或RNA 只要它们有大致相同的互补碱基顺序 经退火处理即可复性 形成新的杂种双螺旋 这一现象称为核酸的分子杂交 核酸杂交可以是DNA DNA 也可以是DNA RNA杂交 不同来源的 具有大致相同互补碱基顺序的核酸片段称为同源顺序 41 核酸的分子杂交 42 核酸的杂交 43 HybridizationofNucleicAcids RNA DNA1 DNA2 Probe Southernhybridization Northernhybridization Probe SmallDNAsegment 44 利用核酸的分子杂交 可以确定或寻找不同物种中具有同源顺序的DNA或RNA片段 常用的核酸分子杂交技术有 原位杂交斑点杂交Southern杂交Northern杂交Western杂交 45 核酸杂交的应用 Southernblotting Southern印迹 Northernblotting Northern印迹 Westernblotting Western印迹 46 在核酸杂交分析过程中 常将已知顺序的核酸片段用放射性同位素或生物素进行标记 这种带有一定标记的已知顺序的核酸片段称为探针 6 探针技术 47 将已知序列的核酸片段用放射性同位素 生物素或荧光染料进行标记 然后用于分子杂交 杂交后通过放射自显影 荧光检测或显色技术 使杂交区带显现出来 探针技术属于Southern杂交的技术范畴 48 HybridizationofNucleicAcids RNA DNA1 DNA2 Probe Southernhybridization Northernhybridization JuangRH 2004 BCbasics 49 PreparationofTraditionalNucleicAcidProbe Codondegeneracy Synthesizingoligonucleotide PROBE GGGGACGAGTCCTCCGTTCT ThenucleicacidsequenceisDeducedfromaminoacidsequence Chemicalsynthesis 50 Targetgene DNAdenaturation Singlecolony Lysed Hybridization Probeislabeledwithradioactive32P 51 ColonyIsScreenedbyHybridizationwithProbe Coverwithfilterpaper Autoradiography Addprobe Transferring Collectfilterpaper DissolvecellDNAdenatured Colonyhybridization 52 7 核酸芯片 Biochip 核酸芯片的基本原理 就是利用类似Southernblotting的核酸杂合反应 Basedonhybridization 比起一般的核酸杂交 有几点不同 1 以极细微的色点替代电泳色带 2 一次可以处理上千万个核酸色点 因此对同一样本可有上千万个测试 3 样本所需的量极小 4 侦测方式简便快速 也配合计算机比对分析 53 SampleDNA EachspotcontainsknownDNA Biochip Schena 2000 MicroarrayBiochipTechnology p A31 ComplementaryDNAhybridize Signalappears BiochipBasedonHybridization 54 每一个点上的DNA是什么 才是最重要的决定因素 若这些DNA能够明确指示某种关键性疾病的有无 则这块芯片便是无价之