（全国）2018版高考生物大一轮复习 第十二单元 现代生物科技专题 第42讲 基因工程及其安全性学案.doc

第42讲基因工程及其安全性1.基因工程的诞生()2.基因工程的原理及技术(含pcr技术)()3.基因工程的应用()4蛋白质工程()5.实验：dna的粗提取与鉴定基因工程的操作工具1基因工程的概念理解(1)供体：提供目的基因。(2)操作环境：无菌。(3)操作水平：dna分子水平。(4)原理：基因重组。(5)受体：表达目的基因。(6)本质：性状在受体生物体内表达。(7)优点：克服远缘杂交不亲和障碍，定向改造生物的遗传性状。2dna重组技术的基本工具(1)限制性核酸内切酶(简称：限制酶)来源：主要是从原核生物中分离纯化出来的。作用：识别双链dna分子的某种特定核苷酸序列，并使每条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开。结果：产生黏性末端或平末端。(2)dna连接酶项目ecoli dna连接酶t4dna连接酶来源大肠杆菌t4噬菌体功能连接黏性末端连接黏性末端和平末端结果恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键(3)载体常用载体：质粒其他载体：噬菌体的衍生物、动植物病毒等。具备的条件a能在宿主细胞内稳定保存并大量复制。b有一个至多个限制酶切割位点，以便与外源基因连接。c具有特殊的标记基因，以便进行筛选。作用a作为运载工具，将目的基因转移到宿主细胞内。b利用它在宿主细胞内对目的基因进行大量复制。1限制性核酸内切酶(限制酶)(1)识别序列的特点：呈现碱基互补对称。无论是奇数个碱基还是偶数个碱基，都可以找到一条中心轴线，如，以中心线为轴，两侧碱基互补对称；以为轴，两侧碱基互补对称。(2)切割后末端的种类(3)限制酶的选择技巧根据目的基因两端的限制酶切割位点确定限制酶的种类a应选择切割位点位于目的基因两端的限制酶，如图甲可选择pst。b不能选择切割位点位于目的基因内部的限制酶，如图甲不能选择sma。c为避免目的基因和质粒的自身环化和随意连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图甲也可选择用pst和ecor两种限制酶(但要确保质粒上也有这两种酶的切割位点)。根据质粒的特点确定限制酶的种类a所选限制酶要与切割目的基因的限制酶一致，以确保产生相同的黏性末端。b质粒作为载体必须具备标记基因等，所以所选择的限制酶尽量不要破坏这些结构，如图乙中限制酶sma会破坏标记基因；如果所选酶的切割位点不只一个，则切割重组后可能丢失某些片段，若丢失的片段含复制起点区，则切割重组后的片段进入受体细胞后不能自主复制。2限制酶和dna连接酶的关系(1)限制酶和dna连接酶的作用部位都是磷酸二酯键。(2)限制酶不切割自身dna的原因是原核生物中不存在该酶的识别序列或识别序列已经被修饰。(3)dna连接酶起作用时，不需要模板。3载体上标记基因的标记原理载体上的标记基因一般是一些抗生素的抗性基因。目的基因要转入的受体细胞没有抵抗相关抗生素的能力。当含有抗生素抗性基因的载体进入受体细胞后，抗性基因在受体细胞内表达，使受体细胞能够抵抗相应抗生素，所以在受体细胞的培养体系中加入该种抗生素就可以只保留转入载体的受体细胞，原理如图所示：关于基因工程工具的几个易错点(1)限制酶是一类酶，而不是一种酶。(2)限制酶的成分为蛋白质，其作用的发挥需要适宜的理化条件，高温、强酸或强碱均易使之变性失活。(3)在切割目的基因和载体时要求用同一种限制酶，目的是产生相同的黏性末端或平末端。(4)将一个基因从dna分子上切割下来，需要切两处，同时产生4个黏性末端或平末端。(5)不同dna分子用同一种限制酶切割产生的黏性末端都相同，同一个dna分子用不同的限制酶切割，产生的黏性末端一般不相同。(6)基因工程中的载体与细胞膜上物质运输的载体不同。基因工程的载体是dna分子，能将目的基因导入受体细胞内；膜载体是蛋白质，与细胞膜的通透性有关。(7)基因工程中有3种工具，但工具酶只有2种。1(2016高考全国卷乙，40)某一质粒载体如图所示，外源dna插入到ampr或tetr中会导致相应的基因失活(ampr表示氨苄青霉素抗性基因，tetr表示四环素抗性基因)。有人将此质粒载体用bamh 酶切后，与用bamh 酶切获得的目的基因混合，加入dna连接酶进行连接反应，用得到的混合物直接转化大肠杆菌。结果大肠杆菌有的未被转化，有的被转化。被转化的大肠杆菌有三种，分别是含有环状目的基因、含有质粒载体、含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌。回答下列问题：(1)质粒载体作为基因工程的工具，应具备的基本条件有_(答出两点即可)，而作为基因表达载体，除满足上述基本条件外，还需具有启动子和终止子。(2)如果用含有氨苄青霉素的培养基进行筛选，在上述四种大肠杆菌细胞中，未被转化的和仅含环状目的基因的细胞是不能区分的，其原因是_；并且_和_的细胞也是不能区分的，其原因是_。在上述筛选的基础上，若要筛选含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌单菌落，还需使用含有_的固体培养基。(3)基因工程中，某些噬菌体经改造后可以作为载体，其dna复制所需的原料来自_。解析：(1)作为运载体的质粒上应有一个至多个限制酶切割位点，在细胞中能够自我复制，且含有特殊的标记基因。(2)未被转化的大肠杆菌和仅含环状目的基因的大肠杆菌中均未导入质粒载体，而质粒上含有氨苄青霉素抗性基因，因此这样的大肠杆菌在含有氨苄青霉素的培养基中不能生长。含有质粒载体和含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌中都含有氨苄青霉素抗性基因，二者在含有氨苄青霉素的培养基中都能生长，因此无法区分二者。根据题图，用bamh 切割质粒后将四环素抗性基因破坏，因此可将经氨苄青霉素培养基筛选出的菌落置于含有四环素的培养基上再次筛选，能在含四环素培养基上生存的是含有质粒载体的大肠杆菌，不能生存的是含有插入目的基因的重组质粒的大肠杆菌。(3)噬菌体为病毒，经改造后作为载体时，其dna复制所需原料来自受体细胞。答案：(1)能自我复制、具有标记基因(2)二者均不含有氨苄青霉素抗性基因，在该培养基上均不生长含有质粒载体含有插入了目的基因的重组质粒(或答含有重组质粒)二者均含有氨苄青霉素抗性基因，在该培养基上均能生长四环素(3)受体细胞2(2016高考全国卷丙，40)图(a)中的三个dna片段上依次表示出了ecor 、bamh 和sau3a 三种限制性内切酶的识别序列与切割位点，图(b)为某种表达载体的示意图(载体上的ecor 、sau3a 的切点是唯一的)。根据基因工程的有关知识，回答下列问题：(1)经bamh 酶切后得到的目的基因可以与上述表达载体被_酶切后的产物连接，理由是_。(2)若某人利用图(b)所示的表达载体获得了甲、乙、丙三种含有目的基因的重组子，如图(c)所示。这三种重组子中，不能在宿主细胞中表达目的基因产物的有_，不能表达的原因是_。(3)dna连接酶是将两个dna片段连接起来的酶，常见的有_和_，其中既能连接黏性末端又能连接平末端的是_。解析：(1)由图(a)可知，尽管bamh 和sau3a 两种限制酶的识别位点不相同，但两种酶切割后产生的dna片段具有相同的黏性末端，故被bamh 酶切后得到的目的基因可以与图(b)中表达载体被sau3a 酶切后的产物连接。(2)运载体上的启动子和终止子具有调控目的基因表达的作用，由于甲和丙的目的基因分别插入在启动子的上游和终止子的下游，故这两个运载体上的目的基因都不能被转录和翻译。(3)常见的dna连接酶是ecoli dna连接酶和t4dna连接酶，但作用有所差别，t4dna连接酶既能连接黏性末端，又能连接平末端，而ecoli dna连接酶只能连接黏性末端。答案(1)sau3a 两种酶切割后产生的片段具有相同的黏性末端(2)甲和丙甲中目的基因插入在启动子的上游，丙中目的基因插入在终止子的下游，二者的目的基因均不能被转录(3)ecoli dna连接酶t4dna连接酶t4dna连接酶基因工程的基本操作程序1目的基因的获取(1)目的基因：主要指编码蛋白质的基因，也可以是一些具调控作用的因子。(2)方法2基因表达载体的构建基因工程的核心(1)目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时使目的基因能够表达和发挥作用。(2)基因表达载体的组成(3)构建过程3将目的基因导入受体细胞(1)植物：农杆菌转化法、基因枪法、花粉管通道法。(2)动物：显微注射技术。(3)微生物：感受态细胞法。4目的基因的检测与鉴定(1)利用dna分子杂交技术检测目的基因的有无。(2)利用分子杂交技术检测目的基因的转录。(3)利用抗原抗体杂交检测目的基因的翻译。(4)利用个体生物学水平的检测鉴定重组性状的表达。1基因组文库与部分基因文库基因文库类型基因组文库部分基因文库(cdna文库)构建基因文库的过程某种生物全部dna限制酶许多dna片段与载体连接导入受体菌群体某种生物发育的某个时期的mrna反转录cdna与载体连接导入受体菌群体2.pcr技术(1)原理：dna复制。(2)需要条件：模板dna、引物、四种脱氧核苷酸、热稳定dna聚合酶(taq酶)。(3)过程：dna受热变性解旋为单链、冷却后引物与单链相应互补序列结合，然后在热稳定的dna聚合酶作用下延伸合成互补链。3将目的基因导入受体细胞生物种类植物动物微生物常用方法农杆菌转化法显微注射技术感受态细胞法主要受体细胞体细胞受精卵原核细胞转化过程将目的基因插入到ti质粒的tdna上转入农杆菌导入植物细胞整合到受体细胞的染色体dna上表达将含有目的基因的表达载体提纯取卵(受精卵)显微注射受精卵发育获得具有新性状的动物ca2处理细胞感受态细胞重组表达载体dna分子与感受态细胞混合感受态细胞吸收dna分子4.目的基因检测与鉴定的“四个层面”基因工程操作过程中的几个易错点(1)目的基因的插入位点不是随意的：基因表达需要启动子与终止子的调控，所以目的基因应插入到启动子与终止子之间的部位。(2)基因工程操作过程中只有第三步(将目的基因导入受体细胞)没有碱基互补配对现象：第一步存在逆转录法获得dna，第二步存在黏性末端连接现象，第四步存在检测分子水平杂交。(3)农杆菌转化法原理：农杆菌易感染植物细胞，并将其ti质粒上的tdna转移并整合到受体细胞染色体dna上。(4)转化：目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程，称为转化。转化的实质是目的基因整合到受体细胞染色体基因组中。(5)标记基因的种类和作用：标记基因的作用筛选、检测目的基因是否导入受体细胞，常见的有抗生素抗性基因、发光基因(表达产物为带颜色的物质)等。(6)受体细胞的选择：受体细胞常用植物受精卵或体细胞(经组织培养)、动物受精卵(一般不用体细胞)、微生物(大肠杆菌、酵母菌)等。要合成糖蛋白、有生物活性的胰岛素则必须用真核生物酵母菌(需内质网、高尔基体的加工、分泌)；一般不用支原体，原因是它营寄生生活；一定不能用哺乳动物成熟的红细胞，原因是它无细胞核，也没有核糖体等细胞器，不能合成蛋白质。(7)还应注意的问题有：基因表达载体中，启动子(dna片段)起始密码子(rna)；终止子(dna片段)终止密码子(rna)。基因表达载体的构建是最核心、最关键的一步，在体外进行。1(高考全国卷改编)根据基因工程的有关知识，回答下列问题：(1)限制性内切酶切割dna分子后产生的片段，其末端类型有_和_。(2)质粒运载体用ecor切割后产生的片段如下：为使运载体与目的基因相连，含有目的基因的dna除可用ecor切割外，还可用另一种限制性内切酶切割，该酶必须具有的特点是_。(3)按其来源不同，基因工程中所使用的dna连接酶有两类，即_dna连接酶和_dna连接酶。(4)反转录作用的模板是_，产物是_。若要在体外获得大量反转录产物，常采用_技术。(5)基因工程中除质粒外，_和_也可作为运载体。(6)若用重组质粒转化大肠杆菌，一般情况下，不能直接用未处理的大肠杆菌作为受体细胞，原因是_。解析：限制性内切酶切割dna分子形成的末端通常有两种，即黏性末端和平末端。为使运载体和目的基因连接，二者必须具有相同的黏性末端，因而当使用除ecor之外的其他酶进行切割时，应该产生相同的黏性末端。dna连接酶的来源有两个：一是大肠杆菌，二是t4噬菌体。反转录是由rna形成dna的过程，获得大量反转录产物时常用pcr扩增技术。基因工程常用的运载体是质粒，除此以外，噬菌体和动植物病毒也可作为运载体。如果用大肠杆菌作受体细胞，必须用钙离子处理，使其处于感受态(此状态吸收外源dna的能力增强)。答案：(1)黏性末端平末端(2)切割产生的dna片段末端与ecor切割产生的相同(3)大肠杆菌t4(4)mrna(或rna)cdna(或dna)pcr(5)噬菌体动植物病毒(6)未处理的大肠杆菌吸收质粒(外源dna)的能力极弱2(2016高考天津卷，7)人血清白蛋白(hsa) 具有重要的医用价值，只能从人血浆中制备。下图是以基因工程技术获取重组hsa(rhsa)的两条途径。(1)为获取hsa基因，首先需采集人的血液，提取_合成总cdna，然后以cdna为模板，采用pcr技术扩增hsa基因。下图中箭头表示一条引物结合模板的位置及扩增方向，请用箭头在方框内标出另一条引物的位置及扩增方向。(2)启动子通常具有物种及组织特异性，构建在水稻胚乳细胞内特异表达rhsa的载体，需要选择的启动子是_(填写字母，单选)。a人血细胞启动子b水稻胚乳细胞启动子 c大肠杆菌启动子d农杆菌启动子(3)利用农杆菌转化水稻受体细胞的过程中，需添加酚类物质，其目的是_。(4)人体合成的初始hsa多肽，需要经过膜系统加工形成正确空间结构才有活性。与途径相比，选择途径获取rhsa的优势是_。(5)为证明rhsa具有医用价值，须确认rhsa与_的生物学功能一致。解析：(1)cdna是以mrna为模板逆转录得到的，要合成总cdna，需要采集人的血液，提取总rna(或mrna)。pcr扩增目的基因时dna的合成方向总是从子链的5端向3端延伸，两条模板链指导合成的子链延伸方向相反。(2)启动子具有物种和组织的特异性，要构建在水稻胚乳细胞内特异表达rhsa的载体，应选择水稻胚乳细胞的启动子。(3)自然条件下农杆菌可感染双子叶植物和裸子植物，而对大多数单子叶植物没有感染能力，当植物受损伤时，伤口处的细胞会分泌大量的酚类化合物，吸引农杆菌移向这些细胞。水稻为单子叶植物，利用农杆菌转化水稻受体细胞的过程中添加酚类物质，可吸引农杆菌移向水稻受体细胞，这时农杆菌中的ti质粒上的tdna可转移至受体细胞，并且整合到受体细胞染色体的dna上。(4)大肠杆菌为原核生物，只有核糖体一种细胞器，不能对翻译形成的肽链进行加工修饰，水稻为真核生物，细胞内具有生物膜系统，能对来自核糖体的初始rhsa多肽进行高效加工。(5)hsa具有重要的医用价值，要证明rhsa具有医用价值，须确认rhsa与hsa的生物学功能一致。答案：(1)总rna(或mrna)(2)b(3)吸引农杆菌移向水稻受体细胞，有利于目的基因成功转化(4)水稻是真核生物，具有膜系统，能对初始rhsa多肽进行高效加工(5)hsa基因工程的应用与蛋白质工程1基因工程的应用(1)动物基因工程：用于提高动物生长速度从而提高产品产量；用于改善畜产品品质；用转基因动物生产药物；用转基因动物作器官移植的供体等。(2)植物基因工程：培育抗虫转基因植物、抗病转基因植物和抗逆转基因植物；利用转基因改良植物的品质。(3)比较基因治疗与基因诊断项目原理操作过程进展基因治疗基因表达利用正常基因导入有基因缺陷的细胞中，以表达出正常性状来治疗(疾病)临床实验基因诊断碱基互补配对制作特定dna探针与病人样品dna混合，分析杂交带情况临床应用2.蛋白质工程(1)流程图写出流程图中字母代表的含义：a转录，b.翻译，c.分子设计，d.多肽链，e.预期功能。(2)结果：改造了现有蛋白质或制造出新的蛋白质。(3)应用：主要集中应用于对现有蛋白质进行改造，改良生物性状。1基因工程的应用 (1)乳腺生物反应器优点：产量高、质量好、成本低、易提取等。操作过程：获取目的基因构建基因表达载体显微注射导入哺乳动物受精卵中形成早期胚胎将胚胎移植到受体动物子宫内发育成转基因动物在雌性个体中目的基因表达，从分泌的乳汁中提取所需蛋白质。(2)基因工程药品生产方式：利用基因工程培育“工程菌”来生产药品。a“工程菌”：用基因工程的方法，得到使外源基因高效率表达的菌类细胞株系，如含有人胰岛素基因的大肠杆菌菌株、含有抗虫基因的土壤农杆菌菌株等。b通过基因工程生产的药品，从化学成分上分析都应该是蛋白质类。成果：生产出细胞因子、抗体、疫苗、激素等。2蛋白质工程与基因工程的比较(1)区别项目蛋白质工程基因工程过程预期蛋白质功能设计预期的蛋白质结构推测应有的氨基酸序列找到相对应的脱氧核苷酸序列获取目的基因基因表达载体的构建将目的基因导入受体细胞目的基因的检测与鉴定实质定向改造或生产人类所需的蛋白质定向改造生物的遗传特性，以获得人类所需的生物类型和生物产品结果可生产自然界没有的蛋白质只能生产自然界已有的蛋白质(2)联系蛋白质工程是在基因工程的基础上，延伸出来的第二代基因工程。基因工程中所利用的某些酶需要通过蛋白质工程进行修饰、改造。有关基因工程应用的四个易错点(1)动物基因工程主要是为了改善畜产品的品质，而不是为了产生体型巨大的个体。(2)bt毒蛋白基因控制合成的bt毒蛋白并无毒性，进入昆虫消化道被分解成多肽后产生毒性。(3)青霉素是青霉菌产生的，不是通过基因工程产生的。(4)并非所有个体都可作为乳腺生物反应器。操作成功的应该是雌性个体，个体本身的繁殖速度、泌乳量、蛋白含量等都是应该考虑的因素。 命题1基因工程的应用1为了增加油菜种子的含油量，研究人员尝试将酶d基因与位于叶绿体膜上的转运肽基因相连，导入油菜细胞并获得了转基因油菜品种。(1)研究人员依据基因的已知序列设计引物，采用_法从陆地棉基因文库中获取酶d基因，从拟南芥基因文库中获取转运肽基因。所含三种限制酶(cla、sac、xba)的切点如图所示，则用_酶处理两个基因后，可得到_端(填图中字母)相连的融合基因。(2)将上述融合基因插入如图所示ti质粒的tdna中，构建_并导入农杆菌中。将获得的农杆菌接种在含_的固体平板上培养得到含融合基因的单菌落，再利用液体培养基振荡培养，可以得到用于转化的侵染液。(3)剪取油菜的叶片放入侵染液中一段时间，此过程的目的是_，进一步筛选后获得转基因油菜细胞，该细胞通过_技术，可培育成转基因油菜植株。(4)用_法可检测转基因油菜植株中的融合基因是否成功表达。答案：(1)pcrcla酶和dna连接a和d(2)基因表达载体(或重组质粒)四环素(3)利用农杆菌将融合基因导入油菜细胞植物组织培养 (4)抗原抗体杂交 命题2蛋白质工程2(2015高考全国卷，40)已知生物体内有一种蛋白质(p)，该蛋白质是一种转运蛋白，由305个氨基酸组成。如果将p分子中158位的丝氨酸变成亮氨酸，240位的谷氨酰胺变成苯丙氨酸，改变后的蛋白质(p1)不但保留p的功能，而且具有了酶的催化活性。回答下列问题：(1)从上述资料可知，若要改变蛋白质的功能，可以考虑对蛋白质的_进行改造。(2)以p基因序列为基础，获得p1基因的途径有修饰_基因或合成_基因。所获得的基因表达时是遵循中心法则的，中心法则的全部内容包括_的复制，以及遗传信息在不同分子之间的流动，即：_。 (3)蛋白质工程也被称为第二代基因工程，其基本途径是从预期蛋白质功能出发，通过_和_，进而确定相对应的脱氧核苷酸序列，据此获得基因，再经表达、纯化获得蛋白质，之后还需要对蛋白质的生物_进行鉴定。解析：(1)从题中所述资料可知，将p分子中158位的丝氨酸变成亮氨酸，240位的谷氨酰胺变成苯丙氨酸后，该蛋白质的功能发生了改变，此过程是通过对构成蛋白质的氨基酸的排列顺序进行改造，进而改变了蛋白质的结构，从而改变了蛋白质的功能。(2)在蛋白质工程中，目的基因可以以p基因序列为基础，对生物体内原有的p基因进行修饰，也可以通过人工合成法合成新的p1基因。中心法则的内容如图所示：由图可知，中心法则的全部内容包括：dna以自身为模板进行的复制，dna通过转录将遗传信息传递给rna，最后rna通过翻译将遗传信息表达成蛋白质；在某些病毒中rna可自我复制(如烟草花叶病毒等)，在某些病毒中能以rna为模板逆转录合成dna(如hiv)，这是对中心法则的补充。(3)蛋白质工程的基本途径是预期蛋白质功能设计预期的蛋白质结构推测应有的氨基酸序列合成dna表达出蛋白质，经过该过程得到的蛋白质，需要对其生物功能进行鉴定，以保证其发挥正常作用。答案：(1)氨基酸序列(或结构)(其他合理答案也可)(2)pp1dna和rna(或遗传物质)dnarna、rnadna、rna蛋白质(或转录、逆转录、翻译)(3)设计蛋白质的结构推测氨基酸序列功能课时作业1如图是基因工程的基本操作流程，请据图回答下列问题：(1)图中a是_；在基因工程的基本操作过程中，是_。(2)在中，只有一个步骤无碱基互补配对，该步骤是_。(3)受体细胞若是植物细胞，可选用_，还可选用_，然后用_方法培养新个体。(4)若受体细胞是工程菌，则合成“表达产物”必须经过的两个过程是_。解析：(1)获取目的基因后，与载体结合，进行基因表达载体的构建。(2)获取目的基因可用逆转录法，存在碱基互补配对，基因表达载体的构建存在黏性末端连接现象，dna的扩增存在dna复制现象。(3)受体细胞若是植物细胞可选用受精卵，还可选用体细胞，然后用植物组织培养的方法培养新个体。(4)蛋白质的表达必须经过转录和翻译。答案：(1)载体基因表达载体的构建(2)(3)受精卵体细胞植物组织培养(4)转录和翻译2(2016高考江苏卷，33)下表是几种限制酶识别序列及其切割位点，图1、图2中标注了相关限制酶的酶切位点，其中切割位点相同的酶不重复标注。请回答下列问题：限制酶bamh ibcl isau3a ihind 识别序列及切割位点ggatc c c ctaggtgatc a a ctagtgatc ctagaagct t t tcgaa(1)用图中质粒和目的基因构建重组质粒，应选用_两种限制酶切割，酶切后的载体和目的基因片段，通过_酶作用后获得重组质粒。为了扩增重组质粒，需将其转入处于_态的大肠杆菌。(2)为了筛选出转入了重组质粒的大肠杆菌，应在筛选平板培养基中添加_，平板上长出的菌落，常用pcr鉴定，所用的引物组成为图2中_。(3)若bamh酶切的dna末端与bcl酶切的dna末端连接，连接部位的6个碱基对序列为_，对于该部位，这两种酶_(填“都能”“都不能”或“只有一种能”)切开。(4)若用sau3a切图1质粒最多可能获得_种大小不同的dna片段。解析：(1)由题图可知，质粒的两个标记基因中都含有bamh的切点，因此不能用bamh进行切割，结合题干及表中信息可知也不能用sau3a进行切割，所以只能用质粒和目的基因中都含有切点的bcl和hind这两种限制酶来切割目的基因和质粒。酶切后的载体和目的基因片段，通过dna连接酶作用后获得重组质粒。要将重组质粒转入大肠杆菌，要先用cacl2处理大肠杆菌，使其处于感受态。(2)重组质粒中只含有四环素抗性基因这一个标记基因，所以为了筛选出转入了重组质粒的大肠杆菌，应在筛选平板培养基中添加四环素，含有重组质粒的大肠杆菌能在平板上长出菌落。要用pcr扩增目的基因，所用的引物组成为图2中引物甲和引物丙，因为从图2中可以看出，引物甲与引物丙与模板链结合后能完成目的基因的复制。(3)bamh酶切的dna末端是，bcl酶切的dna末端是，那么这两个末端连接后的连接部位的6个碱基对序列为，由于连接以后的6个碱基对序列中没有bamh和bcl能识别的酶切位点，故对于该部位，bamh和bcl都不能切开。(4)因为质粒的bamh和bcl识别序列中都有sau3a的识别序列和切割位点，所以用sau3a切图1质粒最多可能获得7种大小不同的dna片段。sau3a切点及得到的7种大小不同的dna片段情况如下：切点在1或2或3的位置可以得到1种大小的dna分子；切点在1和2的位置可以得到2种dna分子；切点在1和3的位置可以得到2种dna分子；切点在2和3的位置可以得到2种dna分子，故最多可能获得7种大小不同的dna片段。答案：(1)bcl和hind dna连接感受(2)四环素引物甲和引物丙(3)都不能(4)73(2015高考四川卷，9)将苏云金杆菌bt蛋白的基因导入棉花细胞中，可获得抗棉铃虫的转基因棉，其过程如下图所示(注：农杆菌中ti质粒上只有tdna片段能转移到植物细胞中)。(1)过程需用同种_酶对含bt基因的dna和ti质粒进行酶切。为将过程获得的含重组质粒的农杆菌筛选出来，应使用_培养基。(2)过程中将棉花细胞与农杆菌混合