第五章 微生物反应器操作(简).pdf

第五章微生物反应器操作第五章微生物反应器操作 5 1 微生物反应器操作基础 微生物培养过程根据是否要求供氧 分为厌氧和 好氧培养 前者主要采用不通氧的深层培养 后 者采用以下几种方法 液体表面培养 如使用浅盘 通风固态发酵 通氧深层培养 就操作方式而言 深层培养可分为 1 分批式操作 2 反复分批式操作 3 半分批式操作 4 反复半分批式操作 5 连续式操作 1 时间 菌体浓度 延迟期 指数生长期 减速期 静止期 衰亡期 延迟期 dx dt 0 0 指数生长期 maxmax 倍增时间倍增时间 td 减速期 d dt 0 0 静止期 dx dt 0 0 maxmax XXXX 衰亡期 dx dt 0 0 2 5 2 分批式操作分批式操作 5 2 1 生长曲线生长曲线 分批培养中微生物的生长曲线如图5 2所示 随着培养的进行 基质浓 度下降 菌体量增加 产物量也相应增加 分批式培养过程中 微生 物的生长可分为 1 迟缓期 lag phase 2 对数生长期 lagarithmic growth phase 3 减速期 fransient phase 4 静止期 stationary phase 5 衰退期 decline phase 迟缓期的长短依培养条件不同而异 且受种子种龄及培养条件的影响 一般认为 细菌的迟缓期是其分裂繁殖前的准备时期 此时期内 细胞 内某种活性物质未能达到细胞分裂所需的最低浓度 因此出现了对数期 前的 静止期 工业生产中选用对数生长期后期的种子接种 正是为 了 缩短迟缓期 3 5 2 1 生长曲线生长曲线 当准备工作结束 细胞便开始迅速繁殖 进入对数期 此时 菌体量随 时间呈指数函数形式增长 故又称指数生长期 此时 一定值 有 应指出 为定值是对给定条件而言的 当环境条件与培养条件组成发 生变化时 值也将发生变化 生产中 应根据目的产物的不同 通过 选择环境条件和培养基组成 以达到选择适宜的 值 使生产高效进行 4 初始菌体浓度 迟缓期所需时间 时间 式中 或 积分上式 有时 令当 或 0 0 0 0 25 exp ln 15 1 X t t ttXXtt X X XXtt X dt dX dt dX X lag laglag lag 减速期 由于营养消耗 有害物质积累造成生长速 率下降 无抑制剂时 SK S S m SXK S Contois SK S Moser KSTeissier S m n S n m Sm exp 1 5 有抑制剂时 产物抑制 基质抑制 isS m KSSK 1 6 5 2 1 生长曲线生长曲线 经过减速期到达静止期的原因 一般认为是 1 必须的营养物质不足 2 氧的供应不足 3 抑制剂的积累 4 生长因子不足 5 生物的生长空间不够等 7 为比例系数 式中 的消耗速率基质若假定直至静止期特定 A A A K XK dt Sd A 35 5 2 1 生长曲线生长曲线 进入衰退期后 由于细胞缺乏能量储存物质 以及细胞内各种水解 酶的作用 引起细胞自身的消化 autolysis 使细胞死亡 实际上 即使 在生长旺盛的对数生长期 也有一部分细胞死亡 因此 Monod方程 可改写为 一般在适宜的生长环境中 Kd值较小 随着反应的进行 Kd值增大 进入衰退期后达到最大值 8 75 exp 0 65 55 45 maxmax tKdXstXXstXt XKd dt dX K XKX SKs S dt dX K SKs S d dd 积分上式 则时 当 全部耗尽 因此在衰退期 由于底物已 常数 为微生物细胞死亡速率式中 即 5 2 2 状态方程状态方程 微生物培养过程是基质在微生物的作用下转变为产 物 或菌体 的 过程这一过程是由物质转换过程物质转换过程 微生物的 生物代谢活动 和环境过程环境过程两个部分所组成 实际上 可 以这样认为 前 一过程发生在细胞内部 后一过程则发 生在细胞外部 培养过程中 与生物代谢过程相关的主要参数有 基质的比消耗速率 氧的比呼吸速率Qo2 比生长速率 产物 的比生成速率 和CO2比生成速率Qco2等 与环境过程相关的 除 上述参数外 还有溶解氧浓度 好氧反应时 DO 反应液中的CO2的浓 度D CO2 代谢产物的浓度 P 菌体浓度X 底物浓度 S 及操作条 件 9 5 2 2 状态方程状态方程 10 时 当 的分压 排气中的分压 进气中 进气中氧的分压 排气中氧的分压 气体总压力 反应液总体积 惰性气体流速 式中 产物 菌体 基质 可表示为环境过程的状态方程式方程式分批式培养过程的状态 0000 0 00 22 2 2 0 0 125 115 105 95 85 2222 22 22 22 2 22 2 2 22 2 22 2 2 COCOOO outCOinCO inOoutO all inCOinOall inCO outCOoutOall outCO CO outCOoutOall outO inCOinOall inO O QQQQ PXXSSt COPCOP PP PVF PPp P PPp P V F XQCO PPp P PPp P V F XQO X dt Pd X dt dX X dt Sd 5 2 2 状态方程状态方程 一般微生物的最适温度 最适pH值范围较窄 生长中一般采用定值 控制 在这样的条件下 可以认为分批培养过程中的动态特性取决于基质 与微生物浓度 接种量 及微生物反应的诸如比速率的 初始值 因此 支配分批培养的主要因素是基质与微生物的浓度的初始值 分批式微生物反应过程分析中 需观察X S 和 P 等随时间的变化情 况 由于不可能研究所有反应液成分随时间的变化 因此应选择与产物P 关系最为密切的底物S作为观察的对象 必要时 可观察两种基质浓度的 变化 好氧反应中 溶解氧浓度 DO 随时间的变化也是很重要的参数 分批操作中rx rs rp 等变量值 可从分批操作中的相 应时间变化曲线中求得 11 例题例题5 1 以甘油为基质进行阴沟气杆菌分批培 养 t 0时 X0 0 1g L S 0 50g L 反应方程式可以用Monod方程表示 max 0 85h 1 Ks 1 23 10 2g L YX S 0 53g g 以细胞 葡萄糖计 若 不考虑诱导期和死亡期 求培养至6h 的菌体浓度 12 5 2 3 反复分批操作反复分批操作 反复分批操作系统是指分批操作完成后 不全部取出 反应物料 剩余部分重新加入一定量的基质 再按照分批 操作方式 反复进行 反复分批操作系统是指分批操作完成后 不全部取出 反应物料 剩余部分重新加入一定量的基质 再按照分批 操作方式 反复进行 13 5 2 3 反复分批操作反复分批操作 反复分批操作系统 图反复分批操作系统 图5 3 中培养液体积为 中培养液体积为V 培养 液取出率为 培养 液取出率为 滤液取出率为 滤液取出率为 由于 由于V一定 所以培 养液加入量为 一定 所以培 养液加入量为 V F 14 5 3 5 2 3 反复分批操作反复分批操作 15 式可知由 此时菌体量的衡算式为 为确保菌体初始浓度Xi一定 有必要将流加液中部分含菌体的培养液取出 f i ffi X X VXVXVX 145 1 135 135 5 2 3 反复分批操作反复分批操作 16 由 5 15 5 16 5 17 5 17 5 15 例题例题5 3 5 3 流加操作流加操作 流加操作的优点 能够任意控制反应液中基质浓度 补充营养 延长生产期 避免底物抑制 可控制菌体生长速率 避免有害代谢产物积累 17 5 3 流加操作流加操作 流加操作的要点是流加操作的要点是控制基质浓度控制基质浓度 因此 其核心问题 是流加什么 和怎么流加 在工程上特别注意后者 从流加 方式看 流加操作可分 为无反馈控制流加操作与反馈控制 流加操作 因此 其核心问题 是流加什么 和怎么流加 在工程上特别注意后者 从流加 方式看 流加操作可分 为无反馈控制流加操作与反馈控制 流加操作 前者 包括定流量流加 指数流加和最优流加量流加操 作等 后者 分间接控制 直接控制 定值控制和程序控制等 流加操作 18 控制方式可以分为直接控制和非直接控制两种方式 直接控制直接控制通过在线检测培养液中的底物浓度 反馈调节 加料速率 非直接控制非直接控制通过测量pH 溶解氧等参数 经 过控制模型对过程状态的估计实现控制作用 19 流 加 操 作 流 加 操 作 20 F S in X 0 全混式生物反应器全混式生物反应器 图图5 4 流加培养操作流加培养操作 V随时间变化随时间变化 X S 为定值为定值 基质的质量流量 流加液中的基质浓度 体积流量 反应器内反应液的体积 式中 可定义如下和 生变化 这时 的体积就会发到反应器以后 反应液式 一旦特定基质加入无论采用哪一种流加方 in in in SF S F V dt PVd XV dt SVd SF VX dt VXd VX 205 1 195 1 185 1 5 3 1 无反馈控制的流加操作无反馈控制的流加操作 采用这种操作方式时 基质的流加按预先设置好的条 件进行 最简单的微 生物的生长速率为 21 水分 随排出气体而失去的为单位体积内由于通气式中 式为培养液体积变化的方程 有作为流加基质的平衡式 K KF dt dV XVm dt XVd Y SF dt SVd XV dt XVd vap vap sx in 235 225 1 215 5 3 1 无反馈控制的流加操作无反馈控制的流加操作 连续培养 即稀释率 细节请见 式 可认为时 由 菌体浓度一定 即对于所供给基质的浓度 有由式 这样消耗量相等 可认为由于基质流加量与基质最大的菌体浓度 可得到 并且维持代谢为零时速并完全被菌体所消耗如果流加的基质能够迅 DVF dtdx X Y S V F dtsdX sx in 244 0 244 1 224 0 max XVm dt XVd Y SF dt SVd sx in 224 1 22 5 22 5 24 5 22 5 24 5 3 1 1 定流量流加操作定流量流加操作 段 基质浓度相当低 一般地 在线性生长阶 为线性生长速率常数 式中 一定 即长 点是微生物进行线性生这种流加方式的最大特 时的菌体浓度为可知 由菌体的衡算式 时 定值 时间 的流加操作 此时质的流加速度保持一定定流量流加操作是指基 KL K dt XVd rowthline VtF XSYVtSFY Xt VXSVtSFYVX VVXXSSt FdtdV L sxinsx insx 274 arg 264 254 0 0 00 0 0000 000 23 5 26 5 25 进行补料分批培养时 由于培养基的加 入 培养液的体积不断变化 菌体细胞的变化率 X V F dt dX F dt dV dt dV X dt dX V dt XVd XV dt XVd 24 对于限制性底物和产物 类似地由 5 19 和 5 20 也可得出 25 DPX dt dP Y X SSD dt dS SX in 随着培养基的流加 细胞 浓度逐渐增大 限制性基 质浓度逐渐减小 最后限 制性基质浓度趋向零而细 胞浓度则趋于定值 系统 进入拟稳态 D 但V 在增大 所以 和D逐渐 减小 26 拟稳态并不是严格的稳态 这时的限制 性底物浓度虽然很低 但并不等于0 其 浓度为 27 VF VFK S m S 恒速流加培养达到拟稳态后 细胞的比 生长速率随时间逐渐减小 它对时间的 变化率为 如果V0较小而且流加时间很长 即V0 0 即 即 44 为临界稀释率式中 cri ins in cri D SK S DD 485 max Ks条件下进行的 所以根据 5 48 式 可以认为 当D值接近 max时 X趋近于负无穷大 实际上X为零 此时 S 转变为 S F 称为冲出点冲出点 S F称为冲出基质浓度冲出基质浓度 也就是微 生物的生长速度低于培养液流加速度时 培养液中微生物 将全部被排出 当然 这已无连续操作的意义 但这一过 程可用来确定此条件时微生物的 max D DK SDD DD m S C C 当 细胞被洗光 当 45 495 max cri D 46 545 535 525 1 515 515 505 465 445 max max maxmax max max insssinsx insssinsp inss s insp s insx SKKKSYX SKKKSYP SKKD D DK SDYPD D DK SDYXD 体浓度为同理 最高产率时的菌 度此时 最高代谢产物浓 产率时的稀释率为式可知 获得最高产物由 率生长速率和产物生成速式给出稳定状态下菌体式和另外 由 0 dD PDd 来说明 的减小可通过维持代谢值区域内低值区常减小 其中 在 的低值区和高值在 实际上 实测的一定为基础展开讨论的上述是以 大于时 基质的利用率仍可盾 经验表明 与基质的利用率存在矛 时达到的 其可能是在接近最大稀释率事实上 最大生产能力 时 当 式 有式和 由的方法类同的最大产率 与求产物的确定是一个优化问题 最大产率面包酵母的连续培养中 sx sxsx cri insx in ssinsx YD DYY DD DXD SYXD SKs KKSYXD PD XD maxmaxmax maxmaxmax 2 maxmaxmax maxmax maxmax 95 7 0 565 555 545 525 47 例题 例题 5 7 2 进行细胞回流的单级连续培养 X r Fg X 1 r F X 48 g 浓缩系数浓缩系数 r 回流比回流比 对发酵罐 稳态 菌体 DwD wgrD grD XFrVXXrFg dt dX V 1 0 1 1 1 1 1 49 wD DwK S SK S w D m S S m 1 50 限制性基质 0 0 0 Dw DwK S w Y w SSY SSY D X m S SX SX SX 稳态 SX Y VX FSrrFSFS dt dS V 1 0 51 在分离器中不发生细胞的生长和基 质的消耗 对细胞进行物料衡算 1 1 0 Dw DwK SYX XwXrgrX XrgFFXXFr m S SX 52 XX Dw DwK S w Y X m S SX 0 53 3 多级连续培养 F S0 X0 V S1 X1 P1 V S2 X2 P2 F S1 X1 P1 F S2 X2 P2 54 菌体 X0 0 P0 0 V1 V2 Vn 稳态时 菌体 1 1 1 2 12 1 2 12 22221 1111 n n nnnnn X X DFXVXFXn X XX X XX DFXVXFX D V F FXVX 级 第 第二级 第一级 55 稳态时 限制性底物 YX S恒定 0 202 2122 22 21 101 11 10 nSXn SX SX SX SX SX SSYX SSYX SSDYX Y VX FSFS SSYX Y VX FSFS 同理 则 第二级 第一级 56 进而求出可解出 22 22 20 2 2 2 1 20 10 2 1 2 2 2 0 1 1 XS D DK SDKS D DK SD D DK S SSY SSY D X X D SK S m Sm m S m m S SX SX S m S 57 特点 1 如果D高于临 界值 两个反 应器中的细胞 均被洗光 2 当D DC时 X2 恒大于X1 S2 S1 底物利 用完全 X2 DX2 X1 DX1 58 稳态时 产物 11 1 nnSXXPnn nnnXPn n SSYYPP FPVXYFP dt dP V 59 5 4 1 恒浊器法连续操作恒浊器法连续操作 恒浊器法连续操作是在恒浊器法连续操作是在 比比 max低的多的 范围内进行 低的多的 范围内进行 接近接近 max的范围内 操作是不 稳定的 此时 为保证连续稳定操作 的范围内 操作是不 稳定的 此时 为保证连续稳定操作 X保 持一定 保 持一定 应对 应对F进行反馈控制 显然 进行反馈控制 显然 F为一 变量 为一 变量 反应初期 反应初期 X是通过光电装置测定浊 度的方式 实现控制 目前 通过测定 是通过光电装置测定浊 度的方式 实现控制 目前 通过测定PH CO2和基质等进行控制的方式 也可认为是广 义的恒浊培养 在恒浊器式培养中 所供给 的反应液中营养成分应该充足 和基质等进行控制的方式 也可认为是广 义的恒浊培养 在恒浊器式培养中 所供给 的反应液中营养成分应该充足 60 5 4 3 固定化微生物反应器的连续操作固定化微生物反应器的连续操作 固定化微生物反应具有如下特点 固定化微生物反应具有如下特点 由于微生物固定于载体上 因而不受操作上的 冲出 现象所制约 流加基质的流量范围可适当 增大 由于微生物固定于载体上 因而不受操作上的 冲出 现象所制约 流加基质的流量范围可适当 增大 能够在一定程度上避免悬浮微生物连续反应中最 危险的杂菌污染问题 能够在一定程度上避免悬浮微生物连续反应中最 危险的杂菌污染问题 单细胞悬浮微生物的反应速率几乎不受物质传递 的影响 但固定化微生物的反应速率却较强的受到 物质传递的影响 单细胞悬浮微生物的反应速率几乎不受物质传递 的影响 但固定化微生物的反应速率却较强的受到 物质传递的影响 61 5 4 3 固定化微生物反应器的连续操作固定化微生物反应器的连续操作 固定化微生物连续反应中 杂菌 或 固定化微生物连续反应中 杂菌 或固定于载体内部固定于载体内部 或 或呈膜状固定 在载体表面 呈膜状固定 在载体表面 或 或自由悬浮于反应液 中 自由悬浮于反应液 中 第一种情况是固定化操作混入 的 后两种可能是在填充载体或供 给液体时带入的 第一种情况是固定化操作混入 的 后两种可能是在填充载体或供 给液体时带入的 62 5 4 4 连续培养中的杂菌污染与菌种变异连续培养中的杂菌污染与菌种变异 连续培养的周期越长 菌种变异的可能性 越大 另外 由于营养成 分不断流入反应器中 因此也增加了杂菌污染的概率 减少杂菌污染 的途径之一是控制环境条件 例如 有目的的 改变 连续培养的周期越长 菌种变异的可能性 越大 另外 由于营养成 分不断流入反应器中 因此也增加了杂菌污染的概率 减少杂菌污染 的途径之一是控制环境条件 例如 有目的的 改变pH 温度 营养成分等 以使适者生存 不适者淘汰 使用高温菌可保证不受常温菌的 污染 筛选某些耐特殊条件的菌种也有助于防 止杂菌的污染 温度 营养成分等 以使适者生存 不适者淘汰 使用高温菌可保证不受常温菌的 污染 筛选某些耐特殊条件的菌种也有助于防 止杂菌的污染 63 5 4 4 连续培养中的杂菌污染与菌种变异连续培养中的杂菌污染与菌种变异 连续培养中杂菌污染可分为连续培养中杂菌污染可分为3种形 式 将这 种形 式 将这3种形式所对应的杂菌记为种形式所对应的杂菌记为W Y Z 假定在碳源为限制性基质的连 续培养系统中 目的微生物为 假定在碳源为限制性基质的连 续培养系统中 目的微生物为X 有关 杂菌的物料衡算式 有关 杂菌的物料衡算式 的浓度 杂菌式中 流出量 杂菌繁殖量积累量 流入量 生长 ZYWX XXDXD dt dX outin 884 64 设杂菌或变异细胞的浓度为Y 根据物料 平衡有 YD dt dY Y 65 5 4 5连续培养的应用 1 细胞的生产 2 细胞生理特性研究 3 发酵动力学研究 4 培养基的改进 5 菌种选育 6 微生物遗传特性研究 7 污水处理 细胞回流 66 分批培养一个生产周期所需时间 细胞生产率 PR F m LagB tt X X tt 0 ln 1 PR F m Lag FSX B F CB tt X X t SY t XX P 0 0 ln 1 1 细胞的生产 比分批培养效率高 细 胞生产率高 67 设连续培养的细胞最大生产速率为PCC 则 细胞的比生长速率越大 辅助操作时间 越长 连续培养的优势就越大 ln 0 PRLm F CB CC ttt X X P P 68 2 细胞生理特性的研究 69 3 发酵动力学研究 可得到 和 s 的关系 1 D与1 S作图 70 4 培养基的改进 增加培养基中限制性基质的浓度会出现 仍为该基质限制 表现为在反应器中其浓度 基本不变而细胞浓度明显增加 其他某种基质成为限制 表现为细胞浓度无 明显增加而原限制性基质的浓度明显增大 71 72 5 菌种选育 73 6 微生物遗传稳定性的研究 74 75 1 在甘露糖醇中连续培养 大肠杆菌 其动力学方程为 已知 S 0 6g l YX S 0 1 进料中无菌体和产物 求 1 当甘露糖醇溶液以1L min的流量进入 体积为5L的连续搅拌培养 CSTR 中进行 反应时 其反应器内细胞浓度及其生长速 率为多少 作业 76 2 2 1 S S 2 如果寻求使大肠杆菌在CSTR内的生长 速率达