以原花青素B2标定葡萄籽提取物中原花青素含量.doc

以原花青素B2标定葡萄籽提取物中原花青素含量吴 巍，程秀凤，王春辉，崔文熹，傅荧荧 （天津市尖峰天然产物研究开发有限公司，天津 300457）摘要：目的：建立以原花青素B2为标准品测定葡萄籽提取物中原花青素含量的方法。方法：以含量99%的原花青素B2（HPLC标定）做标准品，参照Bate-Smith法，在546 nm处测定吸光度，来标定葡萄籽提取物中原花青素含量。结果：原花青素B2通过Bate-Smith法反应后的吸收度与浓度成良好线性关系，其线性范围为22.89g.mL-1 114.5g.mL-1，r=0.99902（n=5）。回收率：97.99%，RSD：1.02%(n=6)。结论：该法以通过HPLC标定的原花青素单一成分B2做为标准品，解决了过去以原花青素混合物做标准品其原花青素含量标准不统一，无法让人信服的问题，其测定结果能准确反映葡萄籽提取物中的原花青素的真实含量，可用作质控方法。关键词：原花青素B2; 原花青素;葡萄籽提取物Determine proanthocyanidins in grape seed extract with proanthocyanidin B2 standardWU Wei ，CHENG Xiu-feng，WANG Chun-hui，CUI Wen-xi，FU Ying-ying （Tianjin Jianfeng Natural product R&D Co.，Ltd.，Tianjin 300457，China）Abstract: Objective: To establish a method for detecting proanthocyanidins in grape seed extract with proanthocyanidin B2 standard. Methods: Refer to the Bate-Smith method, using proanthocyanidin B2（99%;HPLC）to calibrate proanthocyanidins in grape seed extract at 546nm. Results: Linear range of proanthocyanidins is 22.89g.mL-1 114.5g.mL-1 (r=0.99902, n=5) ,Recovery: 97.99%, RSD: 1.02%( n=6 ). Conclusion: Using single ingredient proanthocyanidin B2 standard calibrated by HPLC to calibrate proanthocyanidins, resolving the problem that the standard content is not identical and can not convince when using proanthocyanidin compound standard. The method have better linearity and repeatability , can detect grape seed extracts proanthocyanidins exactly.Key Words: proanthocyanidin B2; proanthocyanidin; grape seed extract原花青素是一类物质，它们是由儿茶素、表儿茶素及其没食子酸酯通过C4-C6或C4-C8键共价相连组成的多聚体，葡萄籽提取物中的最主要成分就是原花青素，各种收稿日期：作者简介：吴巍（1970-），男（汉），本科，高级工程师，长期从事葡萄籽、苹果等提取物质量检测工作。Tel: (022)66237090-8031, E-mail:聚合程度的原花青素在其中混合存在着，测定其中总原花青素的含量是衡量其质量好坏的主要指标之一。然而目前原花青素的测定存在着一些问题。首先，虽然测定原花青素方法的细节各不相同，但基本上都是基于BatesSmith法，而BatesSmith法测定的结果是一个值，即原花青素值，它是不带百分号的，而国内一些厂商误把它当作百分含量1；而另外一些方法2 3有了进步，引入了原花青素对照样，然而它们的原花青素对照仍是混合物，如何确定其对照样的含量仍然是无法让人信服。为此，我们采用原花青素B2纯品（原花青素二聚体之一，HPLC检测99%）作为对照，测定葡萄籽提取物中的原花青素含量。1 仪器和试药岛津公司产UV-2401紫外可见分光光度计；AS3120超声波清洗器（天津奥特赛恩斯公司）；水浴锅（天津实验电炉有限公司）；XYE2-10-H超纯水机（）；市场上按原花青素95%规格销售的葡萄籽提取物；原花青素B2（Proanthocyanidin B2）标准品（99%）（天津尖峰公司自制，以日本Asahi Breweries公司产原花青素B2（95%）通过HPLC标定4）；盐酸、正丁醇、硫酸铁铵、甲醇均为分析纯，水为超纯水。2 方法与结果2.1 标准品溶液制备精密称取原花青素B2标准品10 mg于10 mL棕色容量瓶中，加入甲醇适量超声溶解，放至室温，加甲醇定容至刻度摇匀，即得。2.2 样品溶液制备 精确称取10mg样品至100mL棕色容量瓶中，加入甲醇适量超声溶解，放至室温，加甲醇定容至刻度摇匀。2.3 测试方法 精密吸取待测溶液1 mL至10mL棕色容量瓶中，然后加入6.0mL的5% 盐酸正丁醇溶液（5mL浓盐酸，用正丁醇定容至100mL），0.2mL的2%硫酸铁铵溶液（溶解于2molL盐酸中），混匀，盖上瓶盖，用生料带把瓶口缠严，放于（1002）水浴中，水浴40分钟后，取出置冷水浴（210）中迅速冷却20分钟，于546nm处测定吸光度。2.4 线性关系考察分别吸取标准品溶液0.25，0.5，0.75，1.0，1.25mL置于10mL棕色容量瓶中，分别加甲醇定容至刻度摇匀，制成25，50，75，100，125 g.mL-1标准品溶液，取上述各溶液1 mL，照测试方法（2.3）测定吸光度，以原花青素B2浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，进行线性回归，得回归方程为 Y=4 976.03X +36.22,R=0.999 02;线性范围为22.89 g.mL-1114.5 g.mL-1。2.5 精密度试验 分别精密吸取同一样品溶液各1 mL，照测试方法（2.3）共测定8次，分别读取吸光度，测得其RSD为0.70%。2.6 重现性试验取同一批葡萄籽提取物样品，按上述样品溶液制备方法制备5份供试液，分别按测试方法（2.3）测定，原花青素平均含量为82.33%，RSD为0.60%，表明本方法重现性较好。2.7 回收率考察精密称取已测知原花青素含量为82.33%的葡萄籽提取物6份，按上述样品溶液制备方法制备6份供试液，分别精密移取供试液和浓度为0.245 6 mg.mL-1原花青素标准品溶液各0.5 mL于同一10mL棕色容量瓶中，自“然后加入6.0mL的5% 盐酸正丁醇溶液”起分别按测试方法（2.3）测定，测得原花青素平均回收率为97.99%，RSD为1.02%。结果见表1。表 1 原花青素回收率测定结果 Table 1 Results of proanthocyanidins recovery test称样量（mg）样品含量（g）加 入 量（g）测 得 量（g）回 收 率（%）平均回收率（%）RSD(%)12.5651.7050.64101.0797.4997.991.0212.6852.2050.64100.5695.5012.5351.5850.64100.5596.7012.0149.4450.6499.0197.8912.3050.6350.64100.7698.9912.3350.7650.64101.0899.372.8 样品测定分别取6个批号的葡萄籽提取物样品，按上述样品溶液制备方法制备供试液，分别按测试方法（2.3）测定，用标准曲线方程计算含量，测定原花青素含量，结果见表2。表 2 葡萄籽提取物样品原花青素含量测定Table 2 Determination of proanthocyanidins in grape seed extracts批号以B2标定的原花青素（%）0707-1484.960704-1177.480701-2282.330704-1290.740805-0789.380809-2586.313 讨 论1、本试验建立一种以原花青素B2作为对照品，通过Bate-Smith标定葡萄籽提取物中的原花青素，方法线性良好、重现性好、能准确反映葡萄籽提取物的质量。但由于检测过程复杂，因此只有经过良好培训的化验员才能准确检测。2、目前市场上能够买到的原花青素标准品大部分均是原花青素的混合物，而其标明的原花青素含量很难让人信服，而原花青素B2是原花青素的单一成分，本身属于原花青素二聚体的一种4，通过HPLC标定其含量，得到的既是原花青素B2的含量，同时也是其原花青素的含量，这是没有争议的。 参考文献：1 肖付才，李华，王华. 葡萄籽原花青素的提取和检测方法J .食品