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文档简介

考马斯亮蓝法测定蛋白质含量 1 掌握考马斯亮蓝法定量测定蛋白质的原理与方法 熟练分光光度计的使用和操作方法 一 实验目的 2 考马斯亮兰G 250染料 在酸性溶液中与蛋白质结合 使染料的最大吸收峰的位置 由465nm变为595nm 溶液的颜色也由棕红色变为蓝色 经研究认为 染料主要是与蛋白质中的碱性氨基酸 特别是精氨酸 和芳香族氨基酸残基相结合 在595nm下测定的吸光度值 与蛋白质浓度成正比 实验原理 3 器材 可见分光光度计 试管 试管架 刻度移液管 移液枪 试剂 水 考马斯亮蓝试剂称取考马斯亮蓝G250100 加95 乙醇100ml 溶解后加85 H 100ml 加水稀释至1000ml 存于棕色瓶 蛋白质标准溶液准确称取经微量凯氏定氮法校正的结晶牛血清清蛋白 配置1mg ml标准溶液 三 实验器材与试剂 4 2020 1 9 5 四 实验步骤 标准曲线的制作取试管6只 按下表进行编号并加入试剂 充分摇匀 试管编号 试剂 6 每支试管加入5ml考马斯亮蓝试剂 振荡混合后放置5分钟 于595nm测定吸光度 A595为纵坐标 标准蛋白含量横坐标绘制标准曲线 样品提取液中蛋白质含量的测定 7 取3支试管 各吸未知浓度蛋白液0 1ml 分别加考马斯亮蓝试剂5ml 振荡混合放置5分钟 以制作标准曲线的1号试管做空白对照 595nm测吸光度 据所测A595值 于标准曲线上查出相当标准蛋白的量 取三重复样品蛋白含量均值 结果计算样品蛋白质含量ug ml 8 五 注意事项 待测液中蛋白质浓度不可过高或过低 应控制在100 800 g ml为宜 比色测定时 考马斯亮蓝易吸附在比色皿表面 对后续测定
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