藻类标本的采集和处理方法.pdf

附录 藻类标本的采集和处理方法 藻类标本的采集藻类标本的采集 淡水藻类种类繁多 各种藻类对环境条件的要求 也各不相同 有的是浮游种类 有的是底 栖附着种类 生态条件各有其特点 想要采集某一种较好又较纯的理想的标本 就必须了解各种 藻类的生态特点 有的藻类季节性很强 如金藻 硅藻等常在较低温的季节出现 又如蓝藻门的许 多种类则常在温度较高的季节出现 眼虫藻 衣藻 卡德藻等常在有机物较多 静止的水体中大 量出现 接合藻目的许多种类常在酸性 缺钙的水体中大量出现 如酸性红壤土地带的积水 沼 泽以及水库下游积水处常可找到接合藻类 毛枝藻等附着性藻类常可在水中石块或其他附着物上 采到 底栖硅藻或具胶质柄的种类常在沉水植物或其他丝状藻类上附着 欲得较纯的某些浮游藻 类标本 可在形成水华的水体中采集得到 如眼虫藻常形成油膜状水华 而衣藻 隐藻 沟环藻 等则形成绿色 黄绿色 墨绿色云彩状水华 浮游蓝藻类浮在水面时也常可采到较纯的优势种 此外还可利用藻类的趋光性 将采得的标本初步分离提纯 如衣藻等有鞭毛能运动且具趋光性 可与共他不运动的藻体分开 又如采得的颤藻常附有较多的泥砂 利用顫藻趋光能动 将它置于 培养皿中 加入适量清水 放于柔光的北面窗口 2 3 日后 无数顫藻散贴于培养皿的四周 此 时用小镊子挑取 可得较纯而无泥砂的顫藻 欲得纯粹的某些浮游藻类 可在采集得到的标本中 分离培养 欲得较多 较好 种类较纯的好标本 需经常在不同季节 不同的水域环境中 多加 采集积累 采集方法 浮游藻类通常可用浮游生物网 在水中作 字形拖曳取得 也可采取一定的水量 通常 1 升 加固定剂 用浓缩沉淀法取得 底栖藻类 较大型的丝状或团块状标本 可以在采 集现场从水中石块上或其他附着物上刮取 另一些小型的常附着在水草或枯枝烂叶水中其他物体 上 采集时可连同其附着物一起带回实险室处理 浮游生物网系用筛绢缝制而成 筛绢浮游生物网系用筛绢缝制而成 筛绢按其按其孔目大小 有很多规孔目大小 有很多规格 格 采集采集浮浮游游藻藻类用孔径最少的类用孔径最少的 x x 2626 号号筛筛 绢绢较好 较好 标 本 的 固 定标 本 的 固 定 固定藻类标本最常用的固定剂是甲醛液 福尔马林 Formalin 或鲁哥氏碘液 Lugol s solution 如果标本只作一般的形态分类观察用 在用浮游生物网所采得的标本中 加入福尔马林 使 其含有 4 浓度即可 同时可作长期保存 若是直接取水样沉淀浓缩 则用鲁哥氏碘液加福尔马 林最为适宜 1 升水样中加鲁哥氏碘液 15 毫升左右 沉淀浓缩后再加福尔马林使其含有 3 浓度 即可 此外 FAA 甲醛液 醋酸 酒精 或称标准固定剂 铬醋酸固定液等也是常用的藻类固定 剂 它对进一步进行藻体结构的观察有良好效果 若要进一步观察细微构造 每种藻类则有自己 的固定液 这例子不胜枚举 如眼虫藻属较好的杀死固定剂是萧丁氏液 鼓藻杀死固定剂为 2 3 甲醛固定后再加几滴醋酸 无隔藻可用甲醛 10 毫升醋酸 5 毫升 50 酒精 100 毫升固定 团藻 最好的杀死固定剂为碘化钾 2 克 碘 1 克 甲醛 24 毫升 冰醋酸 4 毫升 蒸馏水 400 毫升 鞘藻 刚毛藻可用铬醋酸固定 易于破碎的标本可用 FAA 固定 几种常用的固定液配方 鲁哥氏碘液 Lugol s solution 碘 4 克 碘化钾 6 克 蒸馏水 100 毫升 注 通常使用时常感太浓 可用蒸馏水稀释后使用 FAA Forrmalin aceto aicohol 标准固定剂 甲醛液 醋酸 酒精混合剂 甲醛液 5 毫升 醋酸 5 毫升 50 或 70 酒精 90 毫升 铬酸 醋酸固定液 这种固定剂配方很多 在植物固定上用途也广 通常在实验室中常预先配制贮藏备用 其基 液为 1 克铬酸 1 毫升冰醋酸 100 毫升蒸馏水 这种基液为 1 铬一醋酸液 基液一般不直接拿 来作固定用 常稀释后使用 在藻类上使用的为弱铬 醋酸液 Weak Chromosome acetic 10 铬酸水溶液 2 5 毫升 10 冰醋酸水溶液 5 0 毫升 蒸馏水 92 5 毫升 标本的保存与整体封藏制片法 淡水藻类用 4 甲醛液或 FAA 固定后 即可长期保存 鲁哥氏碘液固定的标本 由于碘易于 挥发 长期保存尚需加些甲醛液 若将标本制成封藏标本片 其方法很多 可参阅植物制片技术一书 基本步骤 一是杀生 固定 二是冲洗及脱水 三是染色 四是透明及封藏 以下介绍几种方法 供制作时参考 一 甘油封藏片制作法 可分不染色与染色两种 一 不染色方法 1 标本用 4 甲醛液杀生固定 时间约 12 24 小时 2 载玻片上 滴一小滴 10 的甘油液 吸取沉淀于甲醛液中的标本 滴在甘油液中 用针轻 轻搅动 使标本均匀散布 3 将载波片放在干燥器或大形容器中 注意防尘 使甘油中水分逐渐蒸发 时间随干燥情况 而定 待甘油浓缩至原来一半时 即可加一滴 20 甘油 再静置使水蒸发 然后再加 40 甘油 待甘油浓缩至原来容量一半时 即可加盖玻片 仍使继续蒸发 4 2 3 天后 甘油已达到近于无水状态 此时即可进行密封 5 密封 甘油制片法 密封剂需采用洪氏两液 洪氏两液配法 阿拉伯树胶 20 克 蒸馏水 20 毫升 水化氯醛 17 克 甘油 3 毫升 冰醋酸 2 毫升 用毛笔蘸上述洪氏两液涂在盖玻片四周及片面的边缘部 约 0 5 1 0 毫米 过 1 2 天 此 时涂片已干 用刀轻轻刮去盖玻片四周不平整的洪氏两液 并可再用瓷漆在四周进行加固密封 二 染色方法 材料以丝状绿藻为例 1 标本用弱铬 醋酸液固定 24 28 小时 2 将材料倾入广口瓶中 瓶口用纱布包扎 然后在自来水龙头下冲洗 以除去标本中固定液 时间至少 24 小时 3 移入 2 铁矾液中 2 小时 4 再用自来水冲洗 30 60 分钟 方法同第二步 冲洗水不可太急 5 用 0 5 海氏苏木色素染色 3 24 小时后 用水冲洗 30 分钟 苏木色素 溶于蒸馏水中 需 10 天之后 在这段时间中 须经常摇晃玻瓶 以加速溶解 此液配好后需等两个月时间 才可使用 等两个月时间是为了使苏木色素完全成熟 即让其自然氧化成氧化苏木色素后才能使用 等两个月时间是为了使苏木色素完全成熟 即让其自然氧化成氧化苏木色素后才能使用 用 2 铁矾溶液分色 直到满意为止 如染色较弱 4 5 分钟已足够 再在水中冲洗约 30 60 分钟 冲洗必须彻底 否则封藏后仍继续分色 最后完全失去颜色而失败 7 将标本放于 2 甘油中 以后根据不染色法中使甘油水分蒸发 逐级加浓 加盖玻片 以洪氏两液密封和瓷漆 加固 二 甘油胶封片法 这种方法用于藻类整体封藏极为良好 即使不经密封的片子 也可以 保存一 二十年 甘油胶的配方 白明胶 1 份 纯甘油 7 份 蒸馏水 6 份 麝香草酚 或酚 少量 配制时先把明胶放于盛有蒸馏水的烧杯中 加热 35 使其溶化 然后等明胶化成稠胶 再加 人甘油继续加热 15 分钟 并用玻棒搅拌 再在每 100 克上述混合液中加入麝香草酚或 1 克作防腐 用 以后再加热 继续搅拌 直至麝香草酚消失为止 这时可把甘油胶用细纱布过滤后 放入瓶 中备用 甘油胶可保存相当久的时间 用时只需用刀刮取少量胶 其大小如绿豆一粒 加于载玻 片的标本上 略加微温 使它溶化即可 然后覆以盖玻片即成 如能在盖玻片周围用漆密封 则 更可永久保存 三 合成胶水封藏法 为了简化制片手续 最简易的方法可用文具商店出售的合成胶水封片 为了防腐可在胶水中加入少量防腐剂 如加 4 甲醛液也可以 制片时吸取用 4 甲醛液固定的 标本一小滴于载玻片上 待标本水分蒸发近乎干燥时 滴上一小滴合成胶水 加上盖玻片即成 四 叔丁醇树胶封片法 在整体封藏法中 一般认为此法很合乎理想 片子质量很好 唯手 续较繁 步骤如有颠倒 常会失败 1 固定液的选择 应根据标本而定 通常用弱铬酸醋酸液 2 杀死固定后 用水彻底冲洗 3 若染色 可用水溶性染剂染色 其中以各种苏木色素或洋红混合剂中的梅氏铁矾洋红较为 适用 4 染色后可进行分色 分色须明显 但不能褪色过甚 分色后 须用水彻底洗去分色剂 5 脱水 经 15 30 50 及 70 各度酒精 每级至少须 20 分钟 6 移入 85 酒精中 18 24 小时 7 可用各种细胞质染剂作二重染色 如用苯胺蓝或快绿 一般约 15 分钟 8 倾去二重染色液 立即用 95 酒精洗去标本中多余的染剂 并换一次 95 酒精 然后立即 进行叔丁醇的逐级代替法 把叔丁醇每隔半分钟加入一些 不可太快 以免叔丁醇在酒精中高度 扩散作用 在每加入 3 4 次后 应倾去 些混合液 然后再逐渐加入叔丁醇 直到容器中叔丁醇 与 95 酒精成 9 1 为止 9 将容器中 9 1 的混合液倾去大半 立即加入用 10 倍叔丁醇稀释的加拿大树胶 树胶用量至 少要 5 8 倍于标本 然后置于无尘的地方 使叔丁醇慢慢蒸发 直至树胶稠密至可以封藏为止 10 等叔丁醇蒸发将要完时 用小镊子轻轻取出标本 放在清洁的载玻片中央 取盖玻片用加 拿大树胶封藏 五 浮游类涂抹制片法 1 标本用弱铬酸醋酸液 或 4 甲醛液 或鲁哥氏液均可 固定 固定时间一般需 24 小时 2 取清洁载玻片 上面涂一薄层梅蔼氏粘附剂 梅蔼氏粘附剂配法 取新鲜鸡蛋一只 只取 蛋白 再加入等量的甘油和 1 克水杨酸钠充分混合即成 此粘附剂以新配合的效果好 放置过久 粘力减低 通常可保存 2 6 月 然后用吸管吸取标本 滴在涂有粘附剂的载玻片上 3 用盖玻片盖一下 使标本自然散开 然后拿掉盖玻片 将做好的涂片 放置无尘处 等其 水分逐渐蒸发到接近干燥为止 4 将涂片浸于盛有清水的培养皿中 涂抹的一面向上 以除去本中的固定剂 须换水三 四次 每次 30 分钟 再将涂片移入蒸馏水中 30 分钟 5 移入 3 4 铁矾水溶液中约 12 小时 6 用流水缓慢冲洗 必须彻底 约 3 6 小时 静水换水也可以 但必须彻底洗净 7 用 1 海氏苏木色素染色 24 48 小时 染色时间视着色而定 8 移入清水冲洗 以除去多余染剂 应换水数次 直至水不变蓝色为止 9 移入 2 铁矾水溶液中 或苦味酸饱和液中 分色 约 10 分钟左右 如用苦味酸则需 4 6 小时 这一步时间多少 须经常在显微镜下检查 以求得适宜的分色 10 等分色清晰后 移入水中冲洗 换水 4 5 次 以求彻底除去铁矾液或苦味酸液 11 用蒸馏水冲洗 5 分钟 如拟用水溶性染剂如番红等作二重染色 则可在此步骤后 移入番 红染剂中染色 染后再依一般规则进行冲洗 12 用各度酒精脱水 进度为 10 25 35 50 70 85 95 每级时间 5 分钟 13 用纯酒精脱水 5 分钟 如欲用快绿 酸性品红 真曙红等作二重染色 即可在此步骤后 用这些染剂的纯酒精或丁香油溶液染色 染后 用丁香油透明及脱色 逐步由纯酒精丁香油移入 丁香油二甲苯 以至纯二甲苯后 用加拿大树胶封片 14 由纯酒精过渡到纯二甲苯 由纯酒精与二甲苯的比例 3 1 移入到 1 1 再到 1 3 再到纯二 甲苯中 每级 5 分钟 15 加盖玻片用加拿大树胶封藏 六 硅藻标本制片法 硅藻类由于花纹细微 构造复杂 未经特殊处理 要准确鉴定种类颇 有困难 用酸处理或干燥法 常会使标本破碎而无法鉴定 更不能再记录其细胞内含物 因此也 有用解剖法 将细胞用猪睫毛解剖开 在相差显微镜的油浸系物镜下进行现察 或在电子显微镜 下进行观察 现将酸处理方法 步骤简述如下 1 取标本若干毫升 加入等量的浓硫酸 以去除细胞内外的有机物 用甲醛固定或新鲜标本均 可 同时再加上固体高锰酸钾少许 其量使处理液呈粉红色为宜 充分搅拌之 然后放置一昼夜 2 次日加入适量的饱和草酸溶液 搅拌使其褪色 然后静置沉淀 使表层呈澄清液 去掉澄 清液 然后加入蒸馏水洗涤 为检查有机物是否完全清除 可取一滴样品在显微镜下检查 如还 有有机物残余 则需重新酸化 清洗 用蒸馏水反复冲洗若干次 直至样品水呈中性为止 冲洗时要充分静置 使微细的硅藻都沉 淀后 再将上层澄清液去掉 否则硅藻将被冲洗掉 可用 PH 试纸检查 如处理液已呈中性 便可进行下一步准备封片 若酸不完全去除 将影 响封片质量 如需液体保存 可加 4 的甲醛液 封片方法步骤如下 1 取标本一小滴 置于洁净的盖玻片上阴干 并注意防尘防污 2 把阴干的盖玻片 标本面向上 置午二甲苯中 然后进行真空抽气 3 取出盖玻片 放在吸水纸上吸去多余的二甲苯 4 在清洁的载玻片上 滴上一小滴樟脂或加拿大树胶 立即将盖玻片盖上 在载玻片左侧贴 上标签即成 注意事项 1 酸化要适当 不宜过度或不足 否则引起壳质破碎或残留有机物 都将影响鉴定 2 冲洗时要充分静置沉淀 要防止标本流失 3 标本必须全干后 才能浸入二甲苯 否则影响封片质量 4 标本从二甲苯中取出后 应迅速封片 否则会出现气泡 5 操作过程要细致耐心 井注意洁净 要防尘防污 6 无论盖玻片或载玻片预先均须用 10 盐酸浸洗去掉油污 并用蒸馏水冲洗揩干备用 藻类显微结构的观察方法 藻类显微结构的观察 常需作一些待殊处理才能观察清楚 例如观察硅藻硅质细脑壁上的显 微花纹 需用酸处理 若需了解果胶质细胞壁的存在 则用氢氟酸来处理 硅质就溶化而只剩下 果胶质壁 又例如黄藻门的细胞壁以果胶质为主 常由两片套合而成 如黄丝藻的细胞壁是由许 多 H 形节片紧密套合而成 但通常不易观察清楚 若用浓氢氧化钾或 30 40 的铬酸溶液处理 即可见到分散了的 H 形细胞壁 在观察细微结构时 通常选用适当的染色剂染色后 常可以得到良好的效果 例如取活水绵 放在显微镜下观察 可以看到细胞内有一条或多条螺旋盘绕的色素体及若干造粉核 至于细胞核 就不易看到 但当你用一小滴碘液染色后 就发生不同的现象 此时造粉核上的淀粉鞘就变成蓝 色 细胞核则变成淡棕色 细胞质虽也呈淡棕色 但比细胞核的颜色更淡 因此细胞核即由此显 示得较清楚了 在鉴定藻类标本时 最普通的染色法 是用少量的鲁哥氏碘液染色 加碘后细胞质内的蓝藻 淀粉 变为淡红褐色 淀粉和造粉核的淀粉鞘变为暗紫色以至黑色 细胞核成为淡黄褐色 色素 体褐色或更略带灰黑色 其他的脂肪 副淀扮 白糖素以及蛋白核本身则不变色 脂肪 白糖素 和副淀粉在鲁哥氏液处理后 虽不变色 但是还可以从它们各自的特点去辨认 脂肪是非常光亮 而透明的带黄色的正圆形小球体 白糖素虽也呈球形光亮的 但它带白色而不透明的 副淀粉也 是光亮带白色而不透明的物体 但它多半是稍大形而且是棒状 盘状 椭圆形的 另外有鞭毛的 种类 其鞭毛也显示得较明显而容易观察了 除了碘液外 其他染色剂种类繁多 不胜枚举 他们各自对细胞组织各部的化学反应和物理 性上显示各不相同 因而制片时有时用二重染色 三重染色等 其目的为了分辨明显 例如 绿 藻的染色可用代氏或哈氏苏木精与铁矾苏木精染细胞核与造粉核 快绿与番红分别染色素体 细 胞质 很为适用 又如欲区分油滴与空胞时 只有用中性红染色 因为中性红