混合型液相色谱固定相的发展及应用.docx

混合模式液相色谱固定相的发展及应用摘 要： 混合型液相色谱是一种能够发生多种互相作用模式的色谱分析方法，在生命研究科学中发挥着重要的作用。作为色谱技术的核心，混合型液相色谱固定相的制备与发展直接影响着色谱分离的选择性和分离效率。目前学术报道的混合型液相色谱固定相种类繁多。本文综述了近几年来不同种类的混合型液相色谱固定相，包括离子/反向混合模式色谱(IEC/RPLC)、亲水作用/反向混合模式色谱(HILIC/ RPLC)、亲水作用/离子交换混合模式色谱（HILIC/IEC）等不同类型的应用。关键词：混合型色谱 固定相1混合模式液相色谱应用进展在生命科学研究中，很多科学家都经常使用二维液相色谱（2D-LC）或多维液相色谱（mD-LC）来分离复杂的生物样品。因此，科学家通常都需要使用两根甚至多根色谱柱来实现分离，这也使得科学家下定决心去开发具有高分离度和高选择性的快速的液相色谱分析方法。最近，为了应对这一挑战，混合模式色谱得到了关注1。近期，混合模式液相色谱得到了发展。混合模式色谱(Mixed-mode chromato- graphy )是固定相与溶质分子之间能够发生多种相互作用模式的一种色谱分析方法2。混合模式色谱的出现使色谱理论的研究变得更为复杂，但随着可调选择分离性的发展，混合模式色谱也成为一种不可避免的趋势3。一些带有不同性质官能团的复杂样品可以通过混合模式液相色谱固定相得到有效的分离4。 20世纪50年代，高效液相色谱还没有发展起来，混合固定相被用来分离特定的物质，有研究表明当使用等度洗脱时，流速与混合比例之间存在着近乎线性的关系5。1986年，Regnier的团队6首次合成了用于蛋白质分离的硅胶基质阴离子交换固定相，这使得固定相在阴离子交换色谱及疏水作用色谱中得以应用。这种技术在三年后被Horvath再次确认7。1988年，Burton和Harding报道了一种新型的混合模式色谱疏水电荷诱导色谱，这种色谱对盐浓度没有依赖性但是对pH值的依赖性比较大8。在同一年，Strancar等人提出了联合分析液相色谱，这种色谱是把含有不同功能的两个或多个对流相互作用媒质连续的装入同一根色谱柱中9。1999年，Yates以及他的同事10把具有强阳离子交换作用的固定相与反相液相色谱固定相同时装入一根柱管中并与质谱进行串联连接来进行多肽类物质蛋白质组学分析。2009年，Geng的研究小组使用同时具有弱阳离子交换性能和疏水作用的色谱柱对完整蛋白质进行了快速的在线分离11。这种色谱柱与商品化的单一弱阳离子交换色谱柱及疏水作用色谱柱相比，示出了更好的分离性能。同时，课题组的一个作者还把单一色谱柱的二维液相色谱（2D-LC-1C）命名为混合模式色谱，这个名称也显示出了此类色谱与相应的单一模式固定性等同或更为优越的分离性能。混合模式色谱由于其多种优点，混合模式色谱日益得到了人们的关注。近年来，以不同关键点切入介绍混合模式色谱的综述性文献发表了多篇，其中包括1998年的混合模式色谱在核酸方面的研究，2009年配体在混合模式蛋白色谱中的选择性及其它特性研究；2013年Thomas L. Chester在分析化学发表了一篇介绍高效液相色谱今年发展的综述，就在最后一部分介绍了混合模式色谱及其固定相的发展。2015年，Liu等12在分析化学发表了具有亲水/反相的混合模式色谱的文章。与传统的单一模式色谱相比，混合模式色谱具备许多优点：（1） 较高的选择性13。（2） 显著的高负载容量14。（3） 与单一模式色谱柱相比，相应的混合模式色谱柱显示出了更好的分离性，因此可以代替两个或多个单一模式色谱柱1。（4） 不同模式的色谱可以通过调节流动相的pH值或浓度来进行转换，避免了单一模式色谱换柱子的麻烦。 虽然现在已经有许多种混合模式色谱固定相被制备出来，但是如何组合才能才能达到最佳分离至今还没有准确方法。目前，混合模式色谱固定相的制备还处于研究阶段。2 混合模式色谱固定相的制备混合模式色谱固定相的制备方法可以分为物理方法和化学方法。2.1物理方法物理方法中，固定相是由两种或多种填料组成。其物理合成方法有以下几种。一种是把两个商品柱连接在一起，称为“串联柱”。一种是把两个不同的固定相填料充填与同一根色谱柱的两端，称为“两相柱”。还有一种是把两种或多种不同类型的填料混合充填入一根色谱柱中，称为“混合柱”。2.2 化学方法 化学方法中，固定性是由单一固定性填料组成，这种填料一般含有两种或多种功能团，这些官能团通过化学合成方法键合到一起。混合模式化学合成方法不同于传统色谱的地方一般是通过硅烷化反应将几种不同类型的官能团通过聚合反应键合在活化硅胶裸露的羟基上。不同模式的色谱之间可以通过调节流动相的pH值或浓度来进行转换。3 各种组合的混合模式液相色谱固定相 自从产生带两种或多种官能团的多种机理的固定相，一些复杂的带有多种基团的样品可以更有效的分离。近年来，各种混合模式色谱固定相包括亲水作用/反向混合模式色谱（HILIC/RPLC），反向/离子交换混合模式色谱（RPLC/IEC）,亲水作用/离子交换混合模式色谱（HILIC/IEC）等，被报道并被用于分离一些小分子或大分子。3.1亲水作用/反相混合模式色谱（HILIC/RPLC）反相液相色谱固定相使用的是非极性的固定相，具有较强的疏水性，而其流动相一般用中等极性的溶液，如甲醇/水，乙腈/水混合物，其中，短链烷基固定相对极性分子如肽有优先保留作用，长链烷基固定相对蛋白质有优先保留作用。而亲水作用液相色谱，又可叫反反相，固定相一般使用的是极性固定相，而流动相多用水-水溶性有机溶剂（主要为乙腈，含量大于60%），为强极性和离子型化合物包括氨基酸、碳水化合物、极性药物、多肽、天然产物等的分离分析提供了一个很好的选择15,16。在Alpert的研究中15，一些化合物在HILIC和RPLC上的保留顺序几乎完全相反，所以说HILIC和RPLC的选择性是非常不同的。但由于亲水作用色谱与反相色谱的流动相相似，亲水作用色谱已被应用到蛋白质分离17。在反向液相色谱固定相表面添加亲水性基团则可以使其具有亲水性。Liu和Pohl18成功合成了一种混合模式的HILIC/RPLC固定相，其带有疏水性的乙二醇末端烷基，用于分析带有烷基酚乙氧基化物和脂肪醇乙氧基化物的非离子的乙氧基表面活性剂。固定相上同时具有极性基团和非极性基团，可与样品中极性和非极性基团进行相互作用。Liang和Fu19就通过硫醇-烯烃点击化学（“thiol-ene”click）的方法合成了一种混合模式的HILIC/RPLC固定相，将二萜苷类化合物和甜菊苷化合物修饰在多孔硅胶的表面，并成功分离了皂素。其固定相中的糖苷化合物既展现了疏水性，又展现了一定的亲水性，所以制备出的固定相可作为混合模式的HILIC/RPLC固定相。Kaname20等人通过枯草芽胞杆菌中的一种生物表面活性肽上的羧基与已键合在硅胶表面的氨基发生反应，将其键合在硅胶表面，合成一种同时具有亲水、反相作用的固定相。并用其在不同乙腈含量下分析多种模型分子：胞嘧啶、胸苷、腺苷、咖啡因、核黄素。得到典型的保留时间与乙腈含量的U形曲线，证明此固定相同时具有亲水作用与反相作用。3.2 离子交换/反相混合模式色谱 （IEC/RPLC） 离子色谱是将一种(或数种)与样品离子电荷相反的离子（称对离子或反离子）加入到色谱系统的流动相（或固定相）中，使其与样品离子结合生成弱极性的离子对（呈中性缔合物）的色谱。且它的分离条件有利于保持物质生物活性，因此可广泛用于生物样品的分离。离子交换色谱柱的填料是阴、阳离子交换剂，目前使用最多的阴离子键合固定相的基团是季胺、二乙胺基和聚乙亚胺，使用最多的阳离子键合固定相的基团是磺丙基和羧基。离子交换色谱与反相色谱的结合能够显示出正交分离模式下的许多优势。反相色谱不适于分离强极性的化合物21。为了使反相色谱在对极性化合物的分离中得到应用，人们通常使用离子化控制的试剂。离子交换/反相混合模式结合了反相色谱和离子交换色谱两者的优点，不仅对无机化合物和氨基酸有很好的分离效果，还可以应用到核酸、多肽和蛋白质、运转核糖核酸衍生物的分离中1。反相/弱阴离子交换混合色谱相对于单一模式的离子交换色谱及反相色谱来说，不但增强了色谱的分离能力，同时也具有了更易操控的分离选择性21。Sun和Qiu等22合成出成功修饰烯丙基咪唑的硅胶基质固定相，词固定相能有效的掩盖并减弱剩余硅烷基的影响，并且在反相模式流动相下成功分离了苯、苯胺类、苯酚类化合物，在pH为7.0的NaCl溶液为流动相的模式下成功分离了无机阴离子类化合物。Sun和Feng等23将联吡啶修饰在硅胶上，合成出同时具有反相与弱阴离子交换作用的混合模式色谱固定相，在反向模式下成功分离了多环芳香烃化合物与苯酚类化合物，也在离子交换模式下同时分离了无机、有机阴离子化合物。此固定相具有较高的柱效和较好的峰形，而且与其他同类型固定相相比具有较短的保留时间。Smadja24等通过将季胺基嵌入到C18链中得到一种反相/阴离子交换混合模式的固定相。离子交换/反相混合模式色谱也可以应用在一些小分子溶质的分离中，如极性较大的抗癌物质阿糖胞苷、极性阳离子化合物、脑啡肽以及有机无机硒。离子交换/反相混合模式色谱应用在毛细管色谱中，可以提高电渗流的稳定性和强度，并具有高选择性和高分离度的强阳离子分离模式和强疏水性的反相色谱模式，这时的离子交换/反相混合模式固定相不但可以用于多肽的分离，还可以用于酸和碱的分离。3.3 亲水作用/离子交换混合模式色谱（HILIC/IEC） 据之前一些报道，亲水作用与离子交换作用的叠加可以有效提升对一些小分子的选择分离性25-27。从生物药物合成角度，亲水/离子交换被证明是一种对小分子药物的有效的分离手段27。Hodge25,28-30等报道，对于分离多肽类化合物，亲水/离子交换混合模式是一种对反相很好的补充。Mant31也报道，相比反相对多肽的分离，亲水/离子交换显示出了更多的优势，具有更强的分离选择性。这些研究发现带电荷的多肽是最容易分离的。当乙腈含量较低时，主要是通过离子交换机制分离多肽；随着乙腈含量的上升，在离子交换的基础上又增加了亲水作用，当乙腈含量增加到一定程度，亲水作用便成为了主导作用。Lindner等32,33也表明亲水/离子交换在蛋白质的分离上也是一种潜在的手段。Shen和Li等34将一种天然的亲水缩氨酸-谷胱甘肽通过硫醇-烯烃点击化学的方法键合在硅胶上，得到一种同时具有亲水作用与阳离子交换作用的混合模式固定相。分别在亲水模式下和亲水/阳离子交换模式下成功分离了壳寡糖和不同分子量的聚果糖。还同时分离了人血清蛋白中胰蛋白酶的分离。参考文献：1 硅胶基质混合固定相填料的合成及其色谱性能研究 刘丽娜2 Zhao G F，Dong X Y. 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