pEASYT1载体.docx

pEASY-T1 Cloning Kit目录号：CT101试剂盒组成1. pEASY- T1 Cloning Vector (10 ng/l)2. Control Template (5ng/l), Control Primers (10 M),3. M13F (10 M)，M13R (10 M)4. Trans1-T1 Phage Resistant Chemically Competent Cell.保存Trans1-T1 Phage Resistant Chemically Competent cell 可于70保存至少六个月, 其他组分-20保存至少六个月。产品说明pEASY- T1 Cloning Kits适用于TA克隆.-快速克隆基因，仅需要5分钟反应时间。- 提供氨苄青霉素和卡那霉素两种筛选标记。- 对照插入片段克隆效率可达95% 以上。- 包含LacZ 基因，在含有IPTG，X-gal 的平板培养基上，可进行蓝白斑筛选。工作原理pEASY- T1 Cloning Kits 以线性的形式提供:-3端悬垂胸腺嘧啶(T)可用于TA克隆 -拓扑异构酶与载体相互偶联（活化载体）Taq DNA聚合酶具有类似脱氧核糖核酸末端转移酶(TdT)的功能，可在新合成双链产物的3端加上一个碱基。尽管4种碱基均可被聚合到3端，但Taq酶对dATP的聚合能力远高于其他3种dNTP.所以，在标准PCR条件下，PCR产物3端这一非模板依赖的聚合碱基几乎总是A。pEASY- T1 Cloning Kits在3 端提供一个悬垂的T碱基，这样的结构使PCR片段可以高效的和载体进行连接。牛痘拓扑异构酶I型可以与DNA双链的特定位置结合并切割特异位点5-(C/T)CCTT-3, 与3T的磷酸基团性成共价键，并切断其中一条DNA链，使DNA解链。磷酸二酯键断裂释放的能量储存于3磷酸与拓扑异构酶氨基酸残基（Tyr-274）形成的共价键中。PCR产物5端羟基可以攻击形成的共价键使其断裂，释放拓扑异构酶，介导片段与载体的连接。操作方法扩增目的条带配置连接体系（加入载体和片段） 室温孵育5分钟 转化感受态细胞 选择白色或是淡蓝色的克隆进行鉴定注意！1. 引物5端不能磷酸化。2. 扩增使用Taq系列DNA聚合酶。3. .扩增反应后设置5-10分钟后延伸步骤，以保证产物的完整及聚合酶加A效率。4. 扩增产物必须经过琼脂糖胶电泳检测。反应体系配置试剂 使用量新鲜PCR产物 0.54 LpEasy-T1 Cloning vector 1 L补足水至5L1. 轻轻混合，室温 (20-37) 反应5分钟。反应结束后，将离心管置于冰上。2. 转化感受态细胞。注意！1. 如不进行后期转化试验，连接体系可以储存于-20。2. 推荐使用1L载体3. 最佳载体与片段摩尔比为1：7（在载体为1L的情况下，可以粗略的按照“1 Kb长度的片段需加入20 ng的比例计算。如1 Kb加入片段20 ng、1.5 Kb加30 ng等）4. 推荐使用3-5L的反应体系。5. 最佳反应时间 片段大小为0.1-1 Kb（含1 Kb）：5-10 min 片段大小为 1-2 Kb（含2 Kb）： 10-15 min 片段大小为 2-3 Kb（含3 Kb）： 15-20 min片段为胶回收产物，反应时间取最大值。延长连接时间可以使克隆数目有所增长，但反应时间不能多于30 min。6. 最佳反应温度：25，若片段是高GC结构，可以37反应。（推荐用PCR 仪控温）转化Trans1-T1 Competent Cells1. 加连接产物于50 l Trans1-T1感受态细胞中（在感受态细胞刚刚解冻时加入连接产物），轻弹混匀，冰浴20-30分钟。2. 42热激30秒，立即置于冰上2分钟。3. 加250 l 平衡至室温的SOC/LB，200 转，37孵育1小时。4. 取8 l，500 mM IPTG，40 l，20 mg/ml X-gal混合，待IPTG，X-gal 被吸收后，取200 l 菌液铺板，培养过夜（为得到较多克隆，4000 rpm 离心1 min，弃掉部分上清，保留100-150 l，轻弹悬浮菌体，取全部菌液涂板，培养过夜）。阳性重组子的鉴定和测序PCR方法分析阳性重组子1. 挑选白色克隆至10 l 无菌水中，涡旋混合。2. 25 l 反应体系中取1 l 混合液用作PCR 反应的模板，用M13 正向引物和反向引物鉴定重组子。3. PCR 反应条件：94预变性10 分钟（裂解细胞，失活核酸酶），94变性30 秒，55退火30 秒，72延伸（ 根据片段的大小确定延伸时间）30个循环，72后延伸10 分钟。确认包含重组子的克隆，扩大培养，用M13 F，M13 R 引物测序。4. 若载体自连，通用引物扩增，自连带大小为199 bp。限制性酶切分析阳性重组子1. 挑选白色克隆接种于LB/Amp+ 或 LB/Kan+ 的液体培养基中，过夜培养。2. 提取质粒DNA3. ，选择适宜的限制性内切酶，酶切鉴定重组子。测序用M13 F，M13 R，T7 promoter 引物测序，进行序列分析。注意！1. 根据PCR产物的强弱，增减PCR产物的量(0.5-4 l)，但是载体使用量不变。2. 反应时间绝对不能超过30分钟。3. 总反应体积不能超过5 l。4. 随着克隆片段的增加(3 kb)，克隆效率降低。5. 若有引物二聚体，建议使用PCR纯化试剂盒；紫外照射不仅容易使DNA发生突变，而且影响克隆效率。克隆常见问题分析克隆效率低影响克隆效率有许多因素，如扩增目的基因所用引物，基因的结构，插入片段和载体的比例等。如发现克隆效率低，尝试用下列方法提高克隆效率。a. 纯化PCR 产物。b. 如插入片段的浓度太低，增加插入片段的量。c. 用新鲜的PCR 产物，不要冷冻PCR 产物。由于3-A热力学不稳定，产物应放置在4，并在1-2 天内完成克隆反应。d. 使用能产生3 末端“A”的DNA 聚合酶。PCR 鉴定重组子失败1. 当用PCR 方法鉴定重组子，没有得到目的扩增产物，又没有载体自连，说明PCR 反应失败。重新优化PCR反应条件或提取质粒，以质粒作模板扩增或酶切鉴定包含重组子的克隆。2. 重组克隆呈现淡蓝色或“fish eye”插入片段没有影响lacZ 基因读码框，或插入片段太小，这种情况下菌落呈现淡蓝色，可以进行下游实验。对照片段（700 bp）PCR 体系ComponentsVolumeFinal ConcentrationControl Template1 las requiredControl Primers (10 M)1 l0.2 M10Buffer (Buffer 含Mg2+)5 l12.5 mM dNTPs4 l