药物分析讲稿-第十一章 维生素类药物的分析.doc

第十一章维生素类药物的分析 桂林医学院药学-唐岩松第十一章 维生素类药物的分析 维生素是维持人体正常代谢功能所必需的生物活性物质。从结构上看，它们并非同属于一类化合物。其中，有些是醇、酚或酯，有些则是醛、胺或酸类，它们各自具有不同的理化性质和生理作用。关于维生素的分类，迄今为止，仍沿用其在油脂中和水中的溶解度不同而分为脂溶性和水溶性两大类。其中，属于脂溶性的有维生素A、D、E和K等；水溶性的有维生素B族、烟酸、泛酸、叶酸及抗坏血酸等。 本类药物的分析方法大多基于其生物特性及理化性质，可分别采用生物、微生物、化学和物理化学的方法进行分析，但目前常用的分析方法是化学和物理化学法。 本章不拟对所有的维生素类药物的分析方法逐一叙述，而只着重介绍维生素A、E、B1和C四种维生素药物的鉴别、检查和含量测定。第一节 维生素A的分析 维生素A(vitamin A)，通常是指维生素A1(视黄醇，retinol)。维生素Al是一种不饱和脂肪醇，在自然界中，其天然产物主要来源于鲛类无毒海鱼肝脏中提取的脂肪油(即鱼肝油)，其含量高达600000国际单位/克(U/g)，但目前主要采用人工合成方法制取。从鱼肝油中提取的维生素A多为各种酯类的混合物，其中主要为醋酸酯和棕榈酸酯(表ll-1)。表ll-l天然维生素A的主要组分 中国药典收载的维生素A，是人工合成的维生素A醋酸酯结晶加精制植物油制成的油溶液，其制剂有维生素A胶丸、维生素AD胶丸和维生素AD滴剂三个品种。一、结构与性质(一)结构维生素A的结构为具有一个共轭多烯侧链的环己烯，因而具有许多立体异构体。天然维生素A主要是全反式维生素A，尚有多种其它异构体，它们具有相似的化学性质，但各具不同的光谱特性和生物效价(见表)。维生素A及其异构体性质 此外，鱼肝油中尚含有：去氢维生素A(Dehydroretinol，维生素A2)，其生物效价仅为维生素A1的40；去水维生素A(Anhydroretinol，维生素A3)，其效价亦低于维生素A1；鲸醇(Kitol)系维生素A醇的二聚体，无生物活性。这些物质也有紫外吸收，并能与显色试剂产生相近颜色。所以，在测定维生素A含量时必须考虑这些干扰因素。去氢维生素A(A2，Dehydroretmol)（二）性质 维生素A易溶于乙醚、氯仿、异丙醇、环己烷、脂肪和植物油，微溶于乙醇，在水中不溶。中国药典收载的维生素A为合成维生素A醋酸酯结晶的精制植物油溶液。 维生素A能与三氯化锑作用呈色、在紫外光区呈强吸收，可用于鉴别和含量测定。二、鉴别试验(一)三氯化锑反应1、原理三氯化锑反应又称Carr-Price反应，反应原理是在三氯甲烷中，维生素A与三氯化锑反应显蓝色，渐变为紫红色。反应机理为维生素A和氯化锑()中存在的亲电试剂氯化高锑(V)作用形成不稳定的蓝色正碳离子。2、鉴别方法 取维生素A 1滴，加三氯甲烷lOml振摇使溶解，取出2滴，加三氯甲烷2ml与25三氯化锑的三氯甲烷溶液0.5ml，即显蓝色，渐变成紫红色。3、注意事项 反应需在无水、无醇条件下进行。因为水可使三氯化锑水解成氯化氧锑(SbOCl)，而乙醇可与正碳离子作用，使正电荷消失。(二)紫外-可见分光光度法(三)薄层色谱法三、含量测定维生素A及其制剂的含量测定方法，最初采用生物学方法测定其生物活性，因该法操作繁琐费时、准确度与重现性差，后来被三氯化锑比色法所替代；而三氯化锑法的反应专属性差，呈色极不稳定，测定结果受水分和温度的影响较大，目前各国药典均收载紫外-可见分光光度法作为维生素A的含量测定方法。下面主要介绍中国药典收载的紫外-可见分光光度法(三点校正法)，并简要介绍高效液相色谱法。(一)紫外-可见分光光度法维生素A在325328nm波长范围内有最大吸收，可用于含量测定。其最大吸收波长随溶剂的不同而变化，表11-2为维生素A醇及其醋酸酯在不同溶剂中的最大吸收波长、吸收系数和换算因数。 本法快速、准确，测定结果能较正确地反映出维生素A的生物效价。由于维生素A原料中常混有其他物质，如多种异构体、合成中间体、副产物、氧化降解产物；维生素A制剂中含稀释用油。这些杂质在325328nm波长范围内也有吸收，对维生素A的测定产生干扰。为消除非维生素A产生的无关吸收所带来的误差，应用“三点校正法”测定，即在三个波长处测定吸光度后，在规定的条件下用校正公式进行校正，然后计算。1、方法原理 三点校正法是在三个波长处测得吸光度，根据校正公式计算吸光度A校正值后，计算含量，因此称为“三点校正法”。方法原理主要基于两点：(1)物质对光的吸收具有加和性，即在供试品的吸收曲线中，各波长处的吸光度是维生素A与无关吸收(杂质吸收)的代数和。(2)杂质的无关吸收在310340nm波长范围内可视为一条直线，且随波长的增大吸光度下降。2、波长选择 三点波长的选择原则：一点选择在维生素A的最大吸收波长处(即1)；其余两点选择在1的两侧各选一点(2和3)。(1)第一法：即等波长差法。(2)第二法：即等吸收比法。3、生物效价及换算因数(1)生物效价的定义 维生素A的含量仍沿用生物效价(国际单位，U)表示。效价(U/g)是指每克供试品中所含维生素A的国际单位数(U/g)维生素A的国际单位规定如下： 1国际单位维生素A=0.300ug的全反式维生素A醇 =0.344ug的全反式维生素A醋酸酯 将计算出的供试品吸收系数与换算因数(见表1l-2)相乘，即得供试品的生物效价。(2)换算因数的含义 换算因数是单位数值所相当的生物效价，即：(3)维生素A醋酸酯换算因数的计算已知，0.344ug的维生素A醋酸酯相当于1个维生索A单位，则1g维生素A醋酸酯(纯品)所相当的维生素A单位数：又知，维生素A醋酸酯(纯品)的吸收系数E1%1cm (328,环已烷)，为1530，则：4、测定方法 中国药典视供试品的纯度，采用不同的测定方法及数据处理对维生素A原料及制剂的生物效价进行测定。维生素A测定法有两种方法，即“第一法”和“第二法”。合成的维生素A和天然鱼肝油中的维生素A均是维生素A酯，如果供试品中干扰测定的杂质较少，能符合第一法测定的规定时，可直接用溶剂溶解供试品后测定；否则应按第二法，经皂化提取除去干扰后测定。(1)第一法(直接测定法) 本法适用于纯度较高的维生素A醋酸酯。取供试品(维生素A醋酸酯)适量，精密称定，加环己烷溶解并定量稀释成每lml中含915U的溶液，照分光光度法，测定其吸收峰的波长，并在表11-3所列各波长处测定吸光度，计算各吸光度与波长328nm处吸光度的比值和波长328nm处的值(由公式，求得)。如果最大吸收波长在326329nm之间，且5个波长处的差值均不超过0.02，用下式计算含量：维生素A醋酸酯占标示量的百分含量：例1：称取维生素A供试品（标示量为100万单位/g）0.1128g，用环己烷配成100ml溶液，精密量取此溶液1ml，用环己烷稀释至100ml，在波长300，316，328，340和360nm波长处测定吸收度，分别为0.332，0.533，0.587，0.477和0.176。计算维生素A相当于标示量的百分含量？解：最大吸收波长在326329nm之间，且5个波长处的差值均不超过0.02，用下式计算含量：答：维生素A标示量为98.9。如果最大吸收波长在326329nm之间，分别计算5个波长处的差值，如有一个或一个以上超过0.02，应按下式计算校正吸光度： (1l-3) 然后，计算校正吸光度与(实测)吸光度之差对(实测)吸光度的相对偏差，即： (1l-4) 再按以下方法计算含量：如果式(1l-4)的值未超过3.0(即在-3.0+3.0范围内)，则不用校正吸光度，而仍用A328计算含量。例2：现有标式量为1万/丸的VitA胶丸(平均每丸内含物为0.2000克),今称取样品内含物0.1920克,溶于环己烷并稀释到1000ml,于下列波长测得吸收度为：波长(nm) 300 316 328 340 360吸收度 0.265 0.450 0.500 0.410 0.150求该丸剂中VitA的标示量百分含量。换算因素为1900。解：（1） 波长(nm) 300 316 328 340 360 吸收度比值 0.530 0.907 1.000 0.820 0.300 规定的比值 0.555 0.907 1.000 0.811 0.229 二种比值之差 -0.025 -0.007 0.000 +0.009 +0.071（2）最大吸收波长在326329nm之间，分别计算5个波长处的差值，有一个或一个以上超过0.02，按下式计算校正吸光度：A328(校正) 3.52(2A328 -A316 -A340 )0.493因为 ，未超过-3.0%,故仍以A328(测定) 计算含量。（3）用下式计算含量： 答：该丸剂中VitA的标示量百分含量为99.0。如果式(1l-4)的值在-15-3.0之间，则以校正吸光度计算含量。例3：维生素AD胶丸的测定：精密称取维生素AD胶丸装量差异项下的内容物重0.1287g（每丸内容物的平均装量0.07985g），置10ml烧杯中，加环己烷溶解并定量转移至50ml量瓶中，用环己烷稀释至刻度，摇匀；精密量取2ml，置另一50ml量瓶中，用环己烷稀释至刻度，摇匀。以环己烷为空白，测得最大吸收波长为328nm，并分别于300、316、328、340和360nm的波长处测得吸收度如下。求胶丸中维生素A占标示量的百分含量？已知标示量每丸含维生素A 10000单位。波长（nm）300316328340360测得吸收度（A）0.3740.5920.6630.5530.228 解：最大吸收波长在326329nm之间，分别计算5个波长处的差值，有一个或一个以上超过0.02，按下式计算校正吸光度： 因为 ，超过-3.0%,故以A328(校正) 计算含量。用下式计算含量： 答：维生素A醋酸酯胶丸占标示量的百分含量为93.9。 如果式(11-4)的值超过-15或+3(即小于-15或大于+3)，不能用本法测定，须按第二法测定。如果最大吸收波长不在326329nm之间，也只能采用第二法。上述应用如图(11-2)所示：(2)第二法(皂化法)精密称取供试品适量(约相当于维生素A总量500U以上，重量不大于2g)，加乙醇30ml与50(g/g)氢氧化钾溶液3ml，水浴煮沸回流，皂化液用不含过氧化物的乙醚提取并稀释至250ml，精密量取适量，经低温蒸馏、减压干燥后，迅速用异丙醇溶解并稀释成每lml中含维生素A 915U的溶液，在300nm、310nm、325nm、340nm波长处测定吸光度，并确定最大吸收波长(应为325nm)。用下式计算校正吸光度： (1l-5)如果最大吸收波长在323327nm之间，而且300nm与325nm波长处吸光度的比值不大于0.73，按下面的方法计算： 如果的值在3.0范围内，直接用A325代入公式求得： 每1g供试品中含有的维生素A醇国际单位数，即效价：。 维生素A醇占标示量的百分含量： 如果的值超出3.0范围，则用校正公式计算吸光度，用计算效价。如果最大吸收波长不在323327nm之间，或者300 nm与325 nm波长处吸光度的比值大于0.73时，说明供试品中杂质太多，应另取上述皂化后的乙醚提取液，采用色谱法纯化后进行测定。5、讨论(1)对维生素A测定有影响的杂质，主要包括下列几种。 维生素A2和维生素A3；维生素A的氧化产物(环氧化物)、维生素A醛和维生素A酸；维生素A在光照下产生的无生物活性的聚合物鲸醇；维生素A的异构体；合成时的中间体等。 这些杂质在310340nm波长范围内均有吸收，因此在测定维生素A的含量时，必须考虑它们的干扰，常用三点校正法。(2)应用三点校正法时，除其中一点在最大吸收波长处外，其余两点均在最大吸收峰的两侧(上升或下降的陡坡处)。如果仪器波长精度不够时，会产生较大误差，因此，测定前务必校正波长。测定应在半暗室中尽快进行。(二)高效液相色谱法第二节 维生素E的分析 维生素E(vitamin E)为-生育酚(-tocopherols)及其酯。天然品为右旋体，合成品为消旋体，右旋体与消旋体的效价比为1.4:10，药用品一般为合成品。中国药典收载的维生素E是消旋-生育酚醋酸酯，同时收载了维生素E粉剂、片剂、胶丸与注射液。USP(25)收载了右旋或消旋-生育酚及其醋酸酯和琥珀酸酯。一、结构与性质(一)结构 维生素E为苯并二氢吡喃醇(色满醇)衍生物，在苯环上有羟基，因此又被称为生育酚(tocopherols)，主要有、和四种异构体，其中异构体的活性最强。(二)性质4、易氧化性 游离生育酚暴露于空气和日光中，极易被氧化变色；维生素E在无氧条件下对热稳定，加热至200也未被破坏，但对氧十分敏感，遇光、空气可被氧化，氧化产物为醌型化合物。二、鉴别试验(二)三氯化铁反应 维生素E在碱性条件下发生水解，生成游离生育酚，经乙醚提取后，生育酚被Fe3+氧化生成对生育醌；同时Fe3+被还原成Fe2+，Fe2+与联吡啶生成血红色的配位离子。 鉴别方法：取本品约10mg，加乙醇制氢氧化钾试注2ml，煮沸5min，放冷，加水4ml与乙醚10ml，振摇，静置使分层；取乙醚液2ml，加2，2-联吡啶的乙醇溶液(0.5100)数滴与三氯化铁的乙醇溶液(0.2100)数滴，应显血红色。三、维生素E中游离生育酚的检查四、含量测定 维生素E的含量测定方法较多，主要是利用其水解产物游离生育酚的易氧化性质，在酸性或碱性条件下水解后，用硫酸铈标准液直接滴定；或将Fe3+还原为Fe2+后，再与不同试剂反应生成配位化合物后比色测定；也可用硝酸氧化，与邻苯二胺缩合后荧光测定。近年来多采用气相色谱法，方法的专属性强、简便快速，适用于维生素E及制剂的分析。第三节 维生素B1的分析一、结构与性质(一)结构 维生素Bl(vitamin B1)，又称盐酸硫胺(thiamine hydrochloride)，是由氨基嘧啶环和噻唑环通过亚甲基连结而成的季铵类化合物，化学名称为氯化4-甲基-3(2-甲基-4-氨基-5-嘧啶基)甲基-5-(2-羟基乙基)噻唑盐酸盐。噻唑环上季铵及嘧啶环上氨基，为碱性基团，可与酸成盐，如盐酸、硝酸和氢溴酸。(二)性质4、与生物碱沉淀剂的反应 结构中有两个杂环(嘧啶环和噻唑环)，可与生物碱沉淀剂(如碘化汞钾、三硝基酚、碘溶液和硅钨酸等)生成沉淀。5、硫色素反应 噻唑环在碱性介质中可开环，再与嘧啶环上的氨基环合，被铁氰化钾氧化生成具有荧光的硫色素，在正丁醇中显蓝色荧光。二、鉴别试验(一)硫色素反应1、原理 硫色素(thioehrome)反应是维生素B1在碱性条件下，被铁氰化钾氧化生成硫色素。硫色素溶于正丁醇(或异丁醇)中，显蓝色荧光。反应式如下：本反应为维生素B1的专属反应，各国药典多以此反应作鉴别。三、含量测定 维生素B1及其制剂的常用含量测定方法有：硅钨酸重量法、硫色素荧光法、紫外分光光度法及非水溶液滴定法等。现介绍硅钨酸重量法如下：1、原理：维生素B1在酸性溶液中，能与硅钨酸定量地生成组成恒定的硅钨酸盐沉淀，其组成为(C12H17ClN4OS)2SiO2(OH)212WO34H2O，摩尔质量为347922。根据沉淀及供试品的重量即可计算维生素B1含量。2、测定方法 中国药典(1990年版) 取本品约50mg，精密称定，加水50ml溶解后，加盐酸2ml，煮沸。立即滴加硅钨酸试液4ml，继续煮沸2分钟，用80C恒重的垂熔玻璃坩埚滤过，沉淀先用煮沸的盐酸溶液(120)20m1分次洗涤，再用水10ml洗涤1次，最后用丙酮洗涤2次，每次5ml，在80C干燥至恒重，精密称定，所得沉淀重量与0.1939相乘，即得供试量中含有C12H17ClN4OSHCl的重量。3、操作中应注意问题本法操作中应注意盐酸、硅钨酸的用量，以及沉淀干燥的温度。在盐酸酸性下沉淀，可得到易于滤过的沉淀颗粒，若盐酸用量不足，会使沉淀过细，滤过时会穿过滤器，一般以加盐酸2ml或稍多为宜；加热煮沸可促使沉淀颗粒增大，便于滤过；沉淀剂硅钨酸的用量与维生素B1的重量比应不低于8：1，太少时，测得结果偏低；干燥温度与沉淀中结晶水的含量有关，经研究证实：若在80C干燥3小时后，室温冷却30分钟称量时，即可恢复失去的结晶水，故中国药典(1990年版)规定在80干燥至恒重。此外，沉淀剂加入的快慢、煮沸时间的长短，以及沉淀的洗涤等因素也将直接影响测定结果，应予注意。沉淀剂的加入不宜过快；沉淀剂加入后，煮沸时间应以25分钟为宜；沉淀的洗涤宜快速，且用量不宜过大，否则由于沉淀溶解使结果偏低。硅钨酸重量法为测定维生素B1的经典方法，其结果准确、稳定，为中国药典(1990年版)所采用。但本法操作繁琐、费时，故中国药典(1995年版)改用非水滴定法，而对维生素B1片剂及注射剂采用直接紫外分光光度法。第四节 维生素C的分析维生素C(vitamin C)又称L-抗坏血酸(L-aseorbie acid)。维生素C在化学结构上和糖十分相似，有两个手性碳原子，有四种光学异构体，其中以L构型右旋体的生物活性最强。中、美、英、日等国药典收载的都是L-抗坏血酸。一、结构与性质(一)结构(二)性质4、酸性 维生素C分子中具有烯二醇结构，由于受共轭效应的影响，C3-OH酸性较强(pK1=4.17)，C2-OH酸性较弱(pK2=11.5)，故维生素C一般表现为一元酸，可与碳酸氢钠作用生成钠盐。6、还原性分子结构中的烯二醇基具有极强的还原性，易被氧化为二酮基而生成去氢抗坏血酸，后者亦可被氢化还原为抗坏血酸。同时，去氢抗坏血酸在碱性或强酸性溶液中，可进一步水解生成2，3-二酮古洛糖酸而失活，此反应为不可逆反应。二、鉴别试验(一)硝酸银反应 维生素C分