（微生物学专业论文）优良啤酒酿造酵母菌株选育途径的探讨.pdf

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6 原生质体为供体和n w 7 - 4 5 原生质体为受体进行融 合构建新菌株，经筛选得到3 株较优良的菌株r 9 - 1 、r 3 - 4 和r 9 2 3 。用紫外线 灭活的菌株j w 卜1 原生质体和热灭活的菌株n w 7 4 5 原生质体为亲本进行融合构 建新菌株，经筛选得到2 株发酵特性较优良的菌株d r 9 - 2 和d r 9 2 4 。其中菌株 d r 9 - 2 以1 1 。b x 麦芽汁为培养基，用5 0 0 l 罐在1 2 下发酵1 l d ，发酵度为6 9 5 ，发酵液中的双乙酰、乙醛、总高级醇和总酯的含量分别为0 0 1 2 4 m g l 、 7 7 0 m g l 、5 9 0 1 m g l 和2 5 2 9 m g l ，发酵得到的啤酒略带酯香味，口感较独特。 测定了菌株r 9 - 1 、r 3 - 4 、r 9 - 2 3 、d r 9 2 和d r 9 2 4 的细胞大小、d n a 含量和 生物量，结果表明它们是融合株。 关键词：啤酒酵母；育种；发酵特性 厦门大学硕士毕业论文：优良啤酒酿造酵母菌株选育途径的探讨 a b s t r a c t t h eb r e w e r sy e a s ts t r a i ni st h eb a s ea n dk e yo ft h eb e e rb r e w a g ep r o d u c t i o n ，s o t h e r ei si m p o r t a n ts e n s et os c r e e ne x c e l l e n tb e e ry e a s ts t r a i n s t h em a j o rm e t h o d sf o r t h ei m p r o v e m e n to fb e e ry e a s ta rem u t a t i o nb r e e d i n g ，h y b r i d i z a t i o n ，p r o t o p l a s tf u s i o n a n dg e n e t i ce n g i n e e r i n g i nt h es t u d y , p h y s i c a la n dc h e m i c a lm u t a g e n e s i s ，p r o t o p l a s t f u s i o nt e c h n i q u ew e r eu s e dt os c r e e nf i n eb r e w e r sy e a s ts t r a i n s a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a ex b 0 5w a sm u t a t e db ys e m i c o n d u c t o rl a s e ra n d n i t r o u sa c i d ，r e s p e c t i v e l y t h em o n o - c o l o n i e sg r o w i n go nw o r tp l a t ea g a rc o n t a i n i n g d i a c e t y l1 3 5 # g m lw e r ei s o l a t e d s i xf i n es t r a i n sj w l 1 ，j w l 2 ，j w l 3 ，n w 7 4 1 ， n w 7 - 4 2a n dn w 7 4 5w e r eo b t a i n e da f t e rs e l e c t i o n t h er e s u l t so ft e s t sc a r r i e do u ti n t h e5 0 0 la n d12 0 tf e r m e n t a t i o nt a n k si n d i c a t e dt h a tt h em u t a n tj 、vl - 3w a so fs t r o n g a b i l i t yo fd i a c e t y lr e m o v a l t h ec o n t e n t so fd i a c e t y la n dt o t a lh i g h e ra l c o h o l si nt h e f e r m e n t e dl i q u i dw e r er e l a t i v e l yl o wa n dt h e s ec h a r a c t e r i s t i c sw e r es t a b l e t h e s e n s o r ye v a l u a t i o no ft h eb e e rp r o d u c e db yt h em u t a n tj w 1 3w a sv e r yn i c e t h es t r a i nj w l 一3 1 8w a sm u t a t e db yn i t r o u sa c i d t h em o n o c o l o n i e sg r o w i n g o nw o r tp l a t ea g a rc o n t a i n i n gd i a c e t y l15 0 x g m lo r1 6 5 # g m lw e r ei s o l a t e d f o u r f i n es t r a i n sj w n l 3 ，j w n l 4 ，j w n l 6a n dj w n l 7w e r eo b t a i n e da f t e rs e l e c t i o n u n d e rt h ec o n d i t i o n so f5 0 0 lf e r m e n t o rw i t h4 0 0 l1 1o b xw o r ta t 1 2 。cf o r10d a y s ， t h ef e r m e n t e dd e g r e eo fm u t a n tj w n l 6w a s6 9 8 ，t h ec o n t e n to fd i a c e t y l ， a c e t a l d e h y d e ，t o t a lh i g h e ra l c o h o l sa n dt o t a le s t e r si nt h ef e r m e n t e dl i q u i dw e r e o 0 2 5 4 m g l ，3 0 3 m g l ，7 6 8 2 m g l a n d1 2 9 8 m e c l ，r e s p e c t i v e l y t h es e n s o r y e v a l u a t i o no ft h eb e e rp r o d u c e db yt h em u t a n tj w n l - 6w a sh a r m o n y a n t i - - s u l f u l m e t u r o n m e t h ym u t a n t sw h i c hw e r ei n d u c e db ys e m i c o n d u c t o rl a s e r o rs p o n t a n e o u sm u t a t i o nw e r ei s o l a t e d t h er e l a t i v e l yf i n es t r a i nj m w 12 0 6w a s o b t a i n e da f t e rs c r e e n i n g t h ep r o t o p l a s tf u s a n t sw e r ec o n s t r u c t e dw i t ht h ep r o t o p l a s to fn w 7 - 4 5a n d h e a t i n a c t i v a t e dj m w12 0 6 t l l r e ef i n es t r a i n sr 9 1 、r 3 4a n dr 9 2 3w e r eo b t a i n e d a f t e rs e l e c t i o n t h ep r o t o p l a s tf u s a n t sw e r ec o n s t r u c t e dw i t ht h ep r o t o p l a s to f 2 厦门人学硕j ：毕业论文：优良啤酒酿造酵母菌株选育途径的探讨 u v 二i n a c t i v a t e dj w1 1a n dh e a t i n a c t i v a t e dn w 7 4 5 t w of i n es t r a i n sd r 9 2a n d d r 9 2 4w e r eo b t a i n e da f t e rs e l e c t i o n u n d e rt h ec o n d i t i o n so f5 0 0 lf e r m e n t o rw i t h 4 0 0 l11o b xw o r ta t12 cf o r11 d a y s ，t h ef e r m e n t e dd e g r e eo fs t r a i nd r 9 2w a s 6 9 5 ，t h ec o n t e n to fd i a c e t y l ，a c e t a l d e h y d e ，t o t a lh i g h e ra l c o h o l sa n dt o t a le s t e r si nt h e f e r m e n t e d l i q u i d w e r e0 0 1 2 4 m g l ，7 7 0 m g l ，5 9 0 1 m g la n d2 5 2 9m g l ， r e s p e c t i v e l y t h es e n s o r ye v a l u a t i o no ft h eb e e rp r o d u c e db yt h es t r a i n sd r 9 - 2w a s r e l a t i v e l yh a r m o n y t h ec e l lv o l u m e ，b i o m a s sa n dc o n t e n to f s t r a i n sr 9 1 、r 3 4 、r 9 2 3 、d r 9 2a n d r 9 2 4w e r em e a s u r e di nc o m p a r i s o nw i t ht h e i rp a r e n t a ls t r a i n sa n dt h er e s u l t s s u g g e s t e dt h a ts t r a i n sr 9 1 、r 3 4 、r 9 2 3 、d r 9 2a n dr 9 2 4 w e r ef u s a n t s k e y w o r d s ：b r e w e r sy e a s t ；b r e e d i n g ；f o r m e n t a t i o n a lp r o p e r t y 3 厦门大学硕_ l j 毕业论文：优良啤酒酿造酵母菌株选育途径的探讨 第一章前言 1 啤酒的营养作用及风味类型 啤酒是以大麦麦芽、大米、啤酒花等为主要原料，经啤酒酵母和酿造水酿制 而成的一种含c 0 2 的低浓度酒精饮料，是酒类中酒精含量最低的饮料酒。啤酒 性平和、味甘，具有清爽的苦味，有帮助消化、促进循环，滋补身体的功效。啤 酒中富含各种维生素、蛋白质、氨基酸、碳水化合物及矿物质等营养成分。每升 啤酒中一般含有2 0 5 0 9 糖类，3 5 9 蛋白质的水解产物一一肽和氨基酸( 包括 人的8 种必需氨基酸) 。啤酒中碳水化合物和蛋白质的比例约在1 5 - 1 ，最符合 人类的营养平衡，易于为人体吸收利用。每升啤酒中还有5 0 9 左右的c o ：，可以 协助人体胃肠运动。每升啤酒约有3 5 9 乙醇，没有任何脂肪。另外，每升啤酒中 含有钠2 0 0 m g ，含有钾8 0 l o o m g ，钠：钾为1 ：4 一- - 5 的比例有助于人们保持细 胞内外的渗透压平衡，也有利于解渴和利尿【1 1 。每升啤酒中含有锌0 2 ，一- 0 4 m g ， 通常以有机态的形式存在，有利于人体的吸收【2 】。因此，1 9 7 2 年世界第九次营养 食品会议推荐啤酒为人类营养食品【3 1 ，人们也常把啤酒称为“液体面包”。在德 国有的把啤酒列入病人膳食中；而在英国有些妇产科医生则把啤酒作为产妇必喝 的饮料【钔。 世界上的啤酒风味类型大致可分为德国式啤酒( l a g e rb e e r ) 多以芳香“浓 醇”为典型风味特性，形成了芳香、浓醇、细腻的风格特色，并有爽口、较苦的 特性；英国式啤酒( a l eb e e r ) ，风味强力有劲；美国式啤酒( l i g h tb e e r ) ，以 淡、轻、爽为特点，以l i g h tm i l l e r 为代表；柔和型啤酒，口感物质协调、风 味物质不突出、口味柔和如水、苦味小、酸感低、香味淡，称为柔和型啤酒1 5 】。 2 啤酒的历史及发展方向 啤酒起源于大约在九千年前的中东古巴比伦与古埃及地区，中国在四五千年 前就有了古代啤酒，据尚书记载，中国周朝就有了啤酒 3 1 。我国近代啤酒是 从欧洲传入的，1 9 0 0 年俄国技师在哈尔滨建立了第一家啤酒作坊一一乌卢布列 夫斯基啤酒厂。1 9 0 3 年德国酿酒商为了满足越来越多外国侨民在华对于啤酒的 4 厦门人学硕 ：毕业论文：优良啤汹酿造酵母菌株选育途径的探讨 需要，在青岛建立了第一家现代意义上的啤酒厂，最初名为y i n gd e 啤酒厂， 也就是青岛啤酒厂的前身【6 】。近年来，随着我国人民生活水平的提高，啤酒行业 在我国得到了快速发展，产量逐年大幅度提高，2 0 0 3 年我国啤酒产量已达到 2 5 4 0 5 万吨( 约6 6 亿加仑) ，已连续两年超过美国，成为世界啤酒生产和消费 最大的国割7 。 随着啤酒发酵工艺的大型化、连续化以及人们生活水平的提高，人们对啤酒 提出了更高的要求，包括啤酒的酒精度、口感、风味等方面。如今，国内外啤酒 品种向多元化方向发展，口味向淡爽、柔和、饮料化方向发展【8 】。啤酒饮料化是 当前啤酒风格发展的大趋势，低浓度、浅色泽、低苦味啤酒，特别是淡爽且具有 柔和风味的啤酒为广大消费者所喜爱。这种风格的啤酒是建立在优质的麦芽原 料、合理的糖化和发酵工艺基础上，并且要求各种代谢副产物既少而又平衡。 3 啤酒的发酵流程 啤酒酿造的基本原料是发芽的大麦、水、酒花和啤酒酵母。其生产过程包括 啤酒麦芽的制备，麦芽汁的制备，包括糖化、过滤、煮沸、澄清、冷却，接种啤 酒酵母进行啤酒发酵，发酵后进行过滤和澄清、灭菌、啤酒包装等工序【6 一1 们。 啤酒的生产过程涉及到两个主要的生物学变化过程一一麦芽制造和啤酒发酵【2 1 1 1 。啤酒发酵的工艺流程见图1 t 1 1 。 4 啤酒酵母的发酵度 发酵度是啤酒成品的一个重要理化指标，在麦芽汁原浓一定的情况下，成品 发酵度的高低决定了啤酒成品的最终的残糖含量和酒精含量。同时，啤酒的发酵 度高低，对啤酒的口感和保存期也有一定影响。发酵度低的啤酒喝起来不爽口、 有甜味；发酵度太高，会造成啤酒口感淡薄、回味不够。因此，控制啤酒成品的 发酵度对稳定啤酒质量极为重要【1 2 】。啤酒的发酵度与麦芽汁糖类的组成和啤酒 酿造菌株的特性密切关系，麦芽汁中麦芽四糖以上的寡糖不能被酵母所发酵，啤 酒酵母各菌株之间分泌麦芽三糖渗透酶的能力也有所区别，同时也受酵母本身凝 聚性强弱的影响，凝聚性强的酵母发酵麦芽三糖的能力相对较低。因此，在相同 麦芽汁成分和发酵条件下，使用不同酵母会出现较大的发酵度差异【1 0 1 。说明啤 厦门大学硕j j 毕业论文：优良啤酒酿造酵母菌株选育途径的探讨 酒酵母的发酵度是非常重要的特性。一般啤酒酵母的发酵度应在6 0 - 7 0 之 间，优良菌株的真正发酵度应达6 5 一7 0 【13 1 。 i - _ 一_ 啤酒大麦大麦大米 啤涵酵母l 请选 浸麦 小麦淀粉 i 发芽烘干 糊l 涌花l充氧卡氏罐 化 一 i 焙燥除根 1 1i 1 汉生罐 1 i l 啤酒麦芽l粉碎、糖化? 过滤、蒸煮、冷却f 定型麦芽汁j 掰母罐 f i 麦芽制备 麦汁制备 i 鍪冀 f ：出j 挫 l 后酵 成品漕装ip 滔 【i i 荽z 耳，j 暴 ；1 日 - l - _ ，- - ；沉淀 。j i 过滤1 ：怂黼翱糯 成品哩塑卜_ 隔困、也裁， ： l o 萧巷 ：婶潸发酵 ： l 1 1 8 图1 啤酒发酵工艺流程图 f i g 1t e c h n i c a lf l o wc h a r to fb e e rp r o d u c t i o n 5 啤酒风昧的主要影响因素 嶂 淄 酵 母 种 子 扩 培 酵母在发酵过程中，除生成酒精、二氧化碳外，还代谢生成一些副产物，例 如高级醇、有机酸、联二酮、酯类、醛类等。这些副产物与酒精、二氧化碳共同 组成啤酒的酒体，并形成啤酒特有的风味【1 4 】。影响啤酒风味的物质主要有双乙 酰、乙醛、高级醇和一些酯类，其中双乙酰是最关键的因素。 5 1 双乙酰 5 1 1 双乙酰的形成机理和代谢途径 啤酒生产过程中的双乙酰主要来自于是酵母的生物合成途径，主要表现在以 下两个方面：( 1 ) 乙酰辅酶a 与羟乙基硫氨素的焦磷酸盐( 又称活性乙醛) 直接 缩合，释放出辅酶a 而形成双乙酰；( 2 ) 在酵母体内进行缬氨酸的合成代谢过程 中，当中间产物q 一乙酰乳酸得以积累并分泌到酵母细胞外时，在一定温度下， q 一乙酰乳酸由非酶氧化脱羧反应而产生双乙酰【15 1 。双乙酰在啤酒酵母中的产 6 厦门火学硕上毕业论文：优良啤酒酿造酵母菌株选育途径的探讨 生和还原如图2 所示【1 6 】。 葡萄糖i e m 苕p 丙羟基异戊曝 酮基异戊酸詈缬氨酸 2 3 一丁二醇 图2 缬氨酸合成与双乙酰形成的生化途径 f i g 2t h eb i o s y n t h e s i so fv a l i n ea n d t h ef o r m a t i o no fd i a c e t y l 双乙酰主要是q 一乙酰乳酸合成缬氨酸时的副产物，在这一反应过程中，啤 酒酵母由于缺乏q 一乙酰乳酸脱羧酶，q 一乙酰乳酸只能通过非酶氧化脱羧生成 双乙酰，但q 一乙酰乳酸的自然氧化脱羧速度比双乙酰还原速度要慢1 0 倍，故 q 一乙酰乳酸的去除成了双乙酰去除速率的限制因素。此外，发酵液中的双乙酰 必须依靠渗透酶进入酵母细胞，在细胞内通过双乙酰还原酶完成还原过程。因此， 啤酒发酵过程中需要相当长的时间才能将双乙酰含量降到口味阈值以下。当啤酒 中双乙酰的含量超过0 1 0 m g l ，就会产生一种令人不愉快的馊饭味，严重影响 啤酒风味和质量。在啤酒生产的传统工艺中，发酵温度低、周期长，并不需要太 多考虑双乙酰的问题，但随着新工艺、新技术的飞速发展，啤酒自发还原能力降 低，双乙酰问题就显得更为突出。因此，发酵过程中减少双乙酰的产生，可缩短 发酵周期，提高生产力。 5 1 2 降低啤酒双乙酰含量的措施 降低啤酒双乙酰含量主要有两条途径：( 1 ) 减少q 一乙酰乳酸的生成，因为 q 一乙酰乳酸是双乙酰合成的前体物质，它在啤酒中大量积累，是导致双乙酰含 量过高和发酵周期延长的直接原因，减少q 一乙酰乳酸的生成，可有效减少啤酒 发酵过程中双乙酰的产生；( 2 ) 加速q 一乙酰乳酸的分解，由于q 一乙酰乳酸的 氧化脱羧反应是慢反应，而双乙酰还原为2 ，3 一丁二醇的反应为快反应，所以 在发酵液中往往积累大量的q 一乙酰乳酸，这样就容易造成后发酵液和成品酒中 7 厦门大学硕十毕业论文：优良啤酒酿造酵母菌株选育途径的探讨 双乙酰含量的回升，所以加速q 一乙酰乳酸的分解，也可有效减少啤酒中的双乙 酰含量。目前，国内外降低双乙酰的措施主要有：选育优良的酵母菌种、优化发 酵条件、外加q 一乙酰乳酸脱羧酬1 7 】。 5 1 2 1 选育优良的酵母菌种 ( 1 ) 缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸营养缺陷型酵母的筛选 缬氨酸能通过反馈抑制q 一乙酰乳酸的生成来影响双乙酰的生成量。所以通 过对缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸的合成途径进行遗传上的改造，选育降低或经诱 变削弱乙酰羟基酸合成酶的催化功能的菌株来实现。也就是通过对啤酒酵母的诱 变筛选，选育出缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸营养缺陷型菌株，因其缺少乙酰羟基 酸合成酶而较少积累q 一乙酰乳酸，导致较少生成双乙酰。 ( 2 ) 双乙酰还原能力强的酵母菌株的筛选 通过啤酒酵母在不同的双乙酰含量梯度的培养基内培养，筛选到在高浓度双 乙酰的含量存在下，能正常的进行代谢活动的抗双乙酰的变异菌株。这些抗双乙 酰菌株的双乙酰还原能力强。此种酵母的生理性状表现为呼吸力强，发酵旺盛， 而后酵期有足够的细胞数量悬浮在啤酒中。张智维等人【1 8 】采用激光对酵母菌种 进行诱变，在含双乙酰的固体培养基上挑出单菌落，经过低温发酵筛选出发酵液 中双乙酰含量比亲本菌株低的变异菌株。 ( 3 ) 应用基因工程手段构建低双乙酰啤酒酵母菌株 增加酵母细胞的乙酰羟酸同分异构还原酶基因( i l v 5 ) 的拷贝数，提高乙酰 羟酸同分异构还原酶的活力。不同的酵母菌具有不同的乙酰羟酸合成酶( a h a s ) 活力，其形成双乙酰前体物质q 一乙酰乳酸的能力差异也很大，选育双乙酰生成 力低的酵母是控制啤酒中双乙酰含量的一条重要途径。f a l o osc 等【19 】研究表明 酵母菌的a h a s 是s u k m e t u mm e t h y l ( s m ) 的进攻位点，s m 的抗性突变基因( s m r i ) 是编码a l i a s 基因( i l v 2 ) 的等位基因，突变基因也许可以生产活力低的 a h a s 。g j t e m a m s e nc 等【2 0 】的研究也证明该方法可行。m i t h i e u xs 2 1 】等报道了乙 酰羟酸同分异构还原酶基因( i l v 5 ) 在啤酒酵母中的表达。通过增加酵母细胞中 的i l v 5 基因拷贝数，使同分异构还原酶( ri ) 的活力大幅度提高，转化子发酵 液中的双乙酰含量比原始亲株低5 0 达到缩短啤酒成熟期的目的。李艳 2 2 】等也 研究了乙酰羟酸同分异构还原酶基因在啤酒工业酵母中的整合表达，通过基因重 8 厦门大学硕上毕业论文：优良啤酒酿造酵母菌株选育途径的探讨 组手段将i l v 5 基因整合到啤酒工业酵母的染色体上，增加i l v 5 基因的拷贝数， 有效地降低了啤酒发酵过程中双乙酰的产生。 构建含a 一乙酰乳酸脱羧酶( a l d c ) 基因的啤酒酵母工程菌。q 一乙酰乳酸 脱羧酶可以快速、有效地将啤酒中的a 一乙酰乳酸直接还原成乙偶姻，从而降低 啤酒中双乙酰的含量，可大大缩短啤酒的成熟期。因此，将a 一乙酰乳酸脱羧酶 基因引入啤酒酵母中并使其表达，是控制啤酒酿造过程中双乙酰含量的另一条有 效途径。y a m a n os f 2 3 】等将醋酸杆菌木质亚种的q 一乙酰乳酸脱羧酶基因整合到 啤酒酵母染色体中，并进行了实验室规模的发酵实验，结果显示转化子生产的啤 酒双乙酰含量明显低于对照菌株，而其它发酵性能( 絮凝性、风味物质等) 没有 明显差异。近年来，我国的科学工作者也进行了a 一乙酰乳酸脱羧酶基因在啤酒 酵母中表达的研究，获得了含q 一乙酰乳酸脱羧酶基因的重组酵母，能有效地降 低啤酒中的双乙酰含量。 5 1 2 2 利用酶工程的高效催化功能降低双乙酰的生成量 在啤酒发酵过程中添加1 1 一乙酰乳酸脱羧酶可以将a 一乙酰乳酸直接脱羧 并转化成乙偶姻，没有形成双乙酰的过程。通过国内外啤酒发酵实验a 一乙酰乳 酸脱羧酶用于啤酒发酵，对降低总双酰量( 主要为乙酰乳酸和双乙酰) 有明显效 果。锥形罐发酵实验结果表明，发酵周期可缩短近一半，提高设备利用率4 0 ， 经济效益可大幅度地提高【2 4 】。 5 1 2 3 优化发酵条件 添加适量无机离子，可明显影响啤酒酿造过程中双乙酰的代谢。孙付宝等【2 5 】 分析了在酵母营养环境中添加n a + 、k + 、m 9 2 + 、c e + 对双乙酰代谢的影响，通过 适当提高麦汁中的n a + 、k + 、c a a + ，有助于控制双乙酰含量，缩短啤酒发酵周期， 提高和稳定啤酒质量。控制麦汁中的溶解氧，也可降低双乙酰含量。若麦芽汁中 有充足的溶解氧，不但有利于酵母的增殖，而且能保证发酵前的麦汁具有较高的 氧化还原电位，有利于q 一乙酰乳酸氧化脱羧，从而降低双乙酰含量。提高麦芽 汁中q 一氨基氮含量，可相应提高麦芽汁中的缬氨酸含量，从而减少q 一乙酰乳 酸的合成和积累，相应地降低了双乙酰的生成量。另外，控制适当的接种量、发 酵温度、防止杂菌污染，复壮衰退酵母等措施均可控制发酵过程中双乙酰的形成 和还原。 9 厦门大学硕上毕业论文：优良啤酒酿造酵母菌株选育途径的探讨 5 2 乙醛 乙醛是酵母进行乙醇发酵的中间产物，是啤酒发酵过程中产生的主要醛类， 也是啤酒中含量最高的醛类。啤酒中乙醛含量较高，会造成不愉快的粗糙苦味； 若更高，则产生腐烂青草味，其味闽值为l o m g l ，成熟啤酒中的含量一般 p e g 浓度 时间 温度，菌株j m w l 2 0 - 6 和n w 7 - 4 5 的原生质体融合的适宜条件为：p e g ( m w 6 0 0 0 ) 浓度3 5 、c a c l 2 浓度l o n 1 i n o l l 、作用时间2 0m i n 、作用温度3 5 。c 。 在该融合条件下试验所得的融合率为4 4 0 1 0 q 。 6 5 融合菌株的筛选 6 5 1 融合子的分离 原生质体融合后，涂布在选择培养基上，由于菌株j m w l 2 0 6 的原生质体已 灭活，而菌株n w 7 - 4 5 不能在含甲磺隆终浓度3 0ug m l 的融合子选择培养基上 5 9 厦门大学硕士毕业论文：优良啤汹酿造酵母菌株选育途径的探讨 生长，因此长出的菌落可初步认为是融合子，共挑到7 7 个融合子。 6 5 2 融合株的筛选 6 5 2 1 初筛 将在选择培养基上挑出的融合子在麦芽汁琼脂平板上连续传5 代，然后进行 三角瓶低温发酵初筛，表2 3 列出部分菌株的三角瓶发酵结果。 表2 3 融合株的初筛结果 t a b 2 3t h er e s u l t so fi n i t i a ls e l e c t i o no ff u s i o ns t r a i n s 注；1 2 5 。b x 麦芽汁为培养基。 6 5 2 2 复筛 挑选上述初筛结果较好的1 7 个菌株再次进行三角瓶发酵，测定发酵度、发 酵液中双乙酰和挥发性物质等的含量。表2 4 列出部分菌株的复筛结果。 厦门大学硕士毕业论文：优良啤酒酿造酵母菌株选育途径的探讨 项目 菌株发酵度双乙酰 乙醛总高级醇总酯醇酯比 ( ) ( m g l )( m g l )( m g l ) ( m g l ) 注：1 2 5 。b x 麦芽汁。 从表2 4 可见，融合株r 9 - 1 的发酵度与亲株n w 7 4 5 的相同，发酵液中的双 乙酰含量比亲株n w 7 - 4 5 的降低了1 1 7 ，发酵液中乙醛的含量比亲株j m w l 2 0 6 的降低了5 3 ，总高级醇的含量比两亲株稍高，但低于其阈值；融合株r 9 2 3 的发酵度比两亲株高，发酵液中的双乙酰含量比亲株n w 7 - 4 5 的降低了7 7 ， 发酵液中乙醛的含量比亲株j m w l 2 0 - 6 的降低了2 5 0 、比亲株n w 7 4 5 的降低 了1 0 5 ，总高级醇的含量比两亲株高，但低于其阈值；融合株r 3 - 4 的发酵度 比两亲株略高，发酵液中的双乙酰的含量比亲株j m w l 2 0 6 的降低了6 4 、比 亲株n w 7 - 4 5 的降低了2 4 2 ，发酵液中的乙醛含量比亲株j m w l 2 0 6 的降低了 2 6 5 、比亲株n w 7 - 4 5 的降低了1 2 3 ，发酵液中总高级醇含量也比亲株n w 7 4 5 的低，而且在融合株中融合株r 3 - 4 的发酵度最高，发酵液中的双乙酰、乙醛和 总高级醇的含量最低，醇酯比为4 2 8 ，即该菌株的发酵特性最佳。 6 6 异核体的检测 按照异核体检测的方法，对发酵特性较优良的融合株r 9 1 ，r 3 4 ，r 9 2 3 6 l 厦门大学硕十毕业论文：优良啤酒酿造酵母菌株选育途径的探讨 进行显微镜观察，均未发现异核体的存在。 6 7 融合株及其亲株的生物学特性测定 6 7 1 细胞体积大小的测定 取融合株r 9 - 1 ，r 3 - 4 ，r 9 - 2 3 及其亲株n w 7 4 5 和j m w l 2 0 6 的对数生长期细 胞，用显微测微尺随机测定1 0 个细胞的长轴、短轴的长度，计算其平均值并按 公式计算细胞体积。结果见表2 5 。 表2 5 融合株及其亲株细胞体积大小比较 t a b 2 5c o m p a r i s o no fm e a nv a l u eo fc e l l u l a rv o l u m e so ff u s a n t s a n dt h e i r p a r e n t s 从表2 5 可知，融合株r 9 - 1 、r 3 - 4 和r 9 2 3 的细胞体积明显大于两亲株n w 7 4 5 和j m w l 2 0 - 6 的细胞体积，略小于两亲本细胞体积之和。 6 7 2 细胞生物量和d n a 含量的测定 用改良的s c h n e i d e r 法提取亲株和融合株的d n a 并计算每个细胞的d n a 含 量。从表2 6 可知，融合株r 9 一l 和r 3 4 的d n a 含量基本上等于其亲株n w 7 4 5 和j m w l 2 0 - 6 的d n a 含量之和，融合株r 9 2 3 的d n a 含量明显大于亲株n w 7 4 5 或j m w l 2 0 - 6 的d n a 含量但略小于两亲株的d n a 含量之和。 将融合株与亲株细胞从斜面接入麦芽汁中，摇瓶培养1 7 h 后收集细胞，于 1 0 5 。c 烘至恒重，称干重即为菌株的生物量。表2 6 的结果显示融合株的生物量高 于两亲株，但是相差不大。 6 2 厦门大学硕十毕业论义：优良啤酒酿造酵母菌株选育途径的探讨 表2 6 融合株及其亲株的生物量比较 t a b 2 5c o m p a r i s o no fb i o m a s sa n dd n ac o n t e n t sb e t w e e nf u s a n t sa n dt h e i r p a r e n t s 7 啤酒酵母菌株n w 7 - 4 5 与j w l - 1 的原生质体融合 啤酒酵母菌株j w l - 1 发酵液中的双乙酰、总高级醇的含量较低，但发酵度较 低，发酵液中的乙醛含量较高；而啤酒酵母菌株n w 7 - 4 5 发酵度较高，发酵液中 的乙醛含量较低，但发酵液中的双乙酰、总高级醇的含量较高。为了得到生产特 性优良的菌株，以菌株j w l - 1 和n w 7 4 5 为亲本进行原生质体融合。 7 1原生质体的制备和再生 7 1 1 菌株j w l - 1 原生质体的制备和再生条件 对对数生长期的j w l - i 的原生质体的形成和再生就蜗牛酶浓度、作用时间进 行试验，结果见表2 7 。 菌株j w l - 1 在作用时间3 0 m i n 和作用温度3 0 。c 的条件下，原生质体的形成率 与酶浓度成正比，但再生率下降，综合考虑原生质体的形成率和再生率，制备菌 株j w l l 原生质体时，选择蜗牛酶浓度l 、作用时间3 0 m i n 、温度3 0 。 6 3 厦门大学硕卜毕业论文：优良啤酒酿造酵母菌株选育途径的探讨 表2 7 菌株j w 卜1 原生质体的形成与再生试验结果 t a b 2 7e f f e c t o fs n a i1e n z y m ec o n c e n t r a t i o n ， e n z y m o l y s i st i m ea n d t e m p e r a t u r eo nf o r m a t i o na n dr e g e n e r a t i o nr a t eo fs t r a i nj w l 一1 p r o t o p l a s t 7 1 2 菌株n w 7 - 4 5 原生质体的制备和再生条件 菌株n w 7 4 5 原生质体制备和再生的适宜条件为蜗牛酶浓度1 、作用时间 3 0 m i n 、温度3 0 ( 见结果与分析6 2 ) 。 7 2 菌株j w l - 1 原生质体的紫外线灭活 将经蜗牛酶处理的菌株j w l 一1 的原生质体悬浮液，置于紫外灯下照射不同时 间，2 8 培养5 d 观察菌的生长。结果( 表2 8 ) 表明，紫外灯照射8 m i n ，其灭活 率为1 0 0 ，试验选择紫外灯下照射8 m i n 以确保j w l - 1 原生质体及其完整细胞 完全灭活。 表2 8 菌株j w i - i 原生质体的紫外线灭活结果 t a b 2 8r e s u l t o fu vi n a c t i v a t i o no fs t r a i nj w l 一1p r o t o p l a s t 7 3 菌株n w 7 - 4 5 原生质体的热灭活 将经蜗牛酶处理的菌株n w 7 - 4 5 的悬浮液，置于5 5 。c 下温育不同时间，2 8 培养5 d 观察菌的生长。结果( 表2 9 ) 表明，当n w 7 - 4 5 的悬浮液在5 5 。c 水浴中 处理1 2 m i n 时，其灭活率为1 0 0 ，试验选择5 5 下处理1 2 m i n 灭活以确保n w 7 - 4 5 原生质体及其完整细胞全部灭活。 厦门人学硕i ：毕业论文：优良啤酒酿造酵母菌株选育途径的探讨 表2 9 菌株h 阿7 - 4 5 原生质体的热灭活结果 t a b 2 9r e s u l to fh e a ti n a c t i v a t i o no fs t r a i nn w 7 4 5p r o t o p l a s t 7 4 原生质体融合 将紫外线灭活的菌株j w l - 1 原生质体和热灭活的菌株n w 7 - 4 5 原生质体的悬 浮液以原生质体浓度1 ：1 的比例混合，离心，弃上清液，向沉淀中加入促融合 剂p e g 和c a c l 2 ，摇匀后置于水浴中作用2 0m i n 。融合条件按“6 4 中的融合最 适条件”，即p e g ( m w 6 0 0 0 ) 浓度3 5 、c a c l 2 浓度l o m m o l l 、作用时间2 0m i n 、 作用温度3 5 。c 。在该条件下原生质体的融合率为3 3 3 1 0 4 。 7 5 融合子的检出 将原生质体融合物用p b s 溶液稀释后涂布于麦芽汁固体培养基上，2 8 。c 培养， 在平板上长出的菌落可认为是两亲株原生质体融合后基因互补的菌株。试验从平 板上挑出生长良好的单菌落3 8 个，菌株编号为d r 9 1 、d r 9 2 、d r 9 3 8 。 7 6 融合子的筛选 将上述3 8 个菌株进行三角瓶发酵，测定发酵度、发酵液中双乙酰和挥发性 物质等的含量。表3 0 列出部分菌株的筛选结果。 在表3 0 列出的融合株中，融合株d r 9 - 2 的发酵度较高( 6 8 7 ：优良菌株 的发酵度在6 5 - 7 0 的范围) ，发酵液中的双乙酰含量最低，比亲株n w 7 4 5 的 低4 0 4 ，比亲株j w l - 1 的低2 5 0 ，发酵液中的总高级醇含量比亲株n w 7 - 4 5 的低1 6 2 ，比亲株j w l - 1 的低6 3 ，虽然发酵液中乙醛的含量比两亲株的高， 但低于其口味阈值1 0m g l 。融合株d r 9 2 4 的发酵度与亲株n w 7 4 5 相同( 6 9 8 ) ，发酵液中双乙酰介于两亲株之间，发酵液中的乙醛含量最低，比亲株n w 7 4 5 的低1 2 9 ，比亲株j w l 一1 的低2 2 9 。虽然融合株d r 9 2 发酵液的醇酯比稍 低，而融合株d r 9 2 4 发酵液的醇酯比稍高，但这两株融合株的主要发酵特性较 优良。 6 5 厦门人学硕卜毕业论文：优良啤酒酿造酵母菌株选育途径的探讨 注： 1 2 5 。麦芽汁 7 7 异核体的检测 按照异核体检测的方法，对融合株d r 9 2 和d r 9 2 4 进行显微镜观察，均未 发现异核体的存在。 7 8 融合株d r 9 - 2 的5 0 0 l 罐发酵特性 综合比较融合株d r 9 - 2 和d r 9 - 2 4 的主要发酵特性，试验选取融合株d r 9 2 做进一步研究以考察该菌株的工业应用价值。以1 2 。b x 麦芽汁作为融合株d r 9 2 发酵培养基，并以菌株x b 0 5 为对照，用5 0 0l 发酵罐在1 2 。c 下进行发酵，发酵期 间取样测定发酵液的发酵度和双乙酰、乙醛和总高级醇等挥发性物质的含量。 7 8 。1 真正发酵度的变化 结果( 图1 3 ) 表明，融合株d r 9 - 2 和菌株x b 0 5 的发酵度都随着时间的延长 而提高，发酵8 d ，融合株和菌株x b 0 5 的发酵度分别为6 8 o 和6 9 2 ，发酵 厦门大学硕士毕业论文：优良啤汹酿造酵母菌株选育途径的探讨 至1 1 d ，分别为6 9 5 和6 9 3 ，均达到了优良菌株发酵度为6 5 7 0 范围 的上限。 o24881 01 2 1 1 m d 图1 3 菌株d r 9 - 2 和x b 0 5 在5 0 0l 罐发酵过程中发酵度的变化 f i g 1 3c h a n g eo ft h ed e g r e eo ff e r m e n t a t i o ni nt h ef e r m e n t e dl i q u i do f s t r a i nd r 9 2a n dx b 0 5i n5 0 0 lf e r m e n t o