（动物遗传育种与繁殖专业论文）小鼠胚胎附植中no对子宫内膜mmp9+mrna表达的影响.pdf

湖南农业大学硕士学位论文 摘要 本研究将性成熟昆明系小白鼠随机分为未妊组( 不作处理的未妊小鼠) 、妊娠对照组 ( 注射生理盐水的妊娠小鼠) 和妊娠抑制组( 注射一氧化氮合酶抑制剂小鼠) ，分别采用 r t - p c r 方法对各组小鼠子宫内膜基质金属蛋白酶一9 ( m m p 一9 ) 基因m r n a 的表达水平进行了 检测，探讨了胚胎附植前期、附植期和附植后期子宫m 口一9 基因表达水平的变化和n 0 对 子宫砌i p - 9 基因表达的影响，其结果如下： 1 小鼠胚胎附植过程中子宫内膜_ 哪- 9 曲n a 的表达水平 结果表明：1 6 1 p - - 9 在性成熟未妊小鼠及正常妊娠小鼠的胚胎附植前期，附植期和附植 后期均有不同程度的表达，未妊组小鼠子宫m 驴- 9m r n a 的相对表达量为0 4 7 o 0 1 ；妊 娠对照组小鼠子宫l 删p - 9m r n a 的相对表达量在胚胎附植前期为0 8 1 o 0 5 ，附植期为 1 5 4 0 1 0 ，附植后期为0 4 0 ：1 ：0 0 2 。与未妊组小鼠相比，正常妊娠小鼠删p - 9m r n a 的相 对表达量在附植前期和附植期有极显著增加( p o 0 1 ) ，附植期达到高峰，附植后期恢 复到未妊组的水平。 2 小鼠胚胎附植过程中一氧化氮对子宫内膜m 驴_ 9 基因表达水平的影响 在抑制组中本研究利用一氧化氮合酶( n 0 s ) 抑制剂l - n a 艟，分别处理附植前期、附 植期和附植后期妊娠小鼠，观测一氧化氮( ) 生成受抑制时子宫内膜砌i p - 9r l r n a 表达 水平的变化。结果表明：注射n o s 抑制剂后，子宫内膜删p _ 9m r n a 水平在附植前期( 检 测不到表达) 和附植期( o 4 7 0 1 5 ) 均受到明显抑制，极显著低于妊娠对照组同期附 植过程的砌i p - 9m r n a 表达水平( p 0 0 5 ) 。 3 一氧化氮对小鼠子宫及其内膜形态变化及脱膜化的影响 光镜观察结果表明，附植过程中，妊娠对照组的子宫内膜发育明显，上皮细胞增高， 腺体发达，间质疏松，间质细胞增大，发生明显的蜕膜样变。相比较而言，抑制组子宫内 膜柱状上皮细胞相对较低，腺体数少，子宫内膜在附植后期出现较明显退行性变化，基质 变得紧密。 综上所述，一氧化氮作为一种内源性平滑肌松驰剂和血管扩张剂，对子宫内膜 i 脚i p - g m r n a 的表达有着极为显著的调节作用，在附植过程中一氧化氮抑制后能显著降低 蛐i p - - 9 基因的表达，推断n o 可能部分通过对转录水平的调控来影响m m p - 9 的表达，并进 一步影响子宫内膜发育和胚胎的附植。 湖南农业大学硕士学位论文 关键词：胚胎附植一氧化氮子宫内膜基质金属蛋白酶基因表达 a b s t r a c t s e x u a l m a t u r em i c ew c i er a n d o m l ya s s i g n e dt o3g r o u p s ：n o n - p r e g n a n tg r o u p ( w i t h o u t t r e a t m e n t ) 、p r e g n a n tc o n t r o lg r o u p ( t r e a t e dw i t h0 9 s o d i u mc h l o r i d e 硒e c t i o n ) a n d i n h i b i t o rg r o u p ( t r e a t e dw i t hn i t r i co x i d es y n t h a s e i n h i b i t o r ) t h em r n ae x p r e s s i o no f m a t r i xm e t a l l o p r o t e i n a s e - 9 ( h m 心- 9 ) o f 姗眦e n d o m e t r i u mi nt h eg r o u p sw a sd e t e r m i n e db y t h ei c v c f s 4 。t r a n s e r i p t i o n - p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n ( 盯- r c x ) t h eo b j e c t i v eo ft h i ss t u d yw a s t oi n v e s t i g a t ec h a n g e so fm r n a e x p r e s s i o no fm o b s ce n d o m e t r i u mm m p - 9i nt h ee a r l y i m p l a n t a t i o np h a s e ，i m p l a n t a t i o np h a s ea n dl a t ei m p l a n t a t i o np h a s ea n d t od e t e r m i n et h ee f f e c t o f n i t r i co x i d e ( n 妫o i li t 。mr e s u l t sw c g t ：a sf o l l o w s ： 1 t h ee x p r e s s i o nl e v e lo fe n d o m e t r i u mm a t r i xm e t a l l o p r o t e h m s e - 9m r n ad u r i 唧n l o l l l s e e m b r y oi m p l a n t a t i o n t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h e r ew a st h ed i f f e r e n te x p r e s s i o no fe n d o m e t r i n mm m p 9 m r h ai nt h en o n - p r e g n a n tm i c ea n dt h ep r e g n a n tm i c ed u r i n ge m b r y oi m p l a n t a t i o n , w h i c h w c i cf o u n da tal e v e lo f0 4 7 - - - 0 0 1i nt h en o n - p r e g n a n tm i c ea n do 8 1 0 0 5i nt h ee a r l y i m p l a n t a t i o np h a s e 1 5 4 0 1 0i n t h ei m p l a n t a t i o np h a s ea n do 4 0 0 0 2i nt h el a t e r i m p l a n t a t i o np h a s e ，r e s p e c t i v e l y i nc o m p a r i s o nw i t ht h en o n - p r e g n a n tm i c e ，t h ee x p r e s s i o no f m m p - 9m r n aw a ss i g n i f i c a n t l ye n h a n c e di nt h ee a r l yi m p l a n t a t i o n p h a s ea n d i nt h e i m p l a n t a t i o np h a s e ( p o 0 1 ) ，r e a c h i n gu pt ot h e 缸t i g i n m i nt h ei m p l a n t a t i o np h a s ea n dt h e n g e t t i n gb a c ki nt h el a t ei m p l a n t a t i o np h a s et ot h el e v e lo f t h en o n - p r e g n a n tm i c e 2 e f f e c to f n i t r i co x i d eo ne x p r e s s i o no f m t r l xm e t a l l o p r o t e i n a s e - 9m r n a d u r i n gm o u s e e m b r y oi m p l a n t a t i o n t h e c h a n g e so ft h em r n ae x p r e s s i o no fm o u s ce n d o m e t r i u mm m p - 9 w e r cd e t e r m i n e d i nt h ei n h i b i t o rg r o u p i nw h i c hp r o d u c t i o no fn ow a ss u p p r e s s e db yt r e a t m e n tw i t h 丑衄r i c o x i d es y n t h a s ei n h i b i t o rl - n a m ei nt h ee a r l yi m p l a n t a t i o np h a s e ，i m p l a n t a t i o np h a s ea n dl a t e i m p l a n t a t i o np h a s e t h e r e s u l t sw e r es h o w e dt h a tt h em r n ae x p r e s s i o no fm o u s e c n d o m c t r i n mm l v l p - 9i nt h ee a r l yi m p l a n t a t i o np h a s e ( n oe x p r e s s i o n ) a n di m p l a n t a t i o np h a s e n 湖南农业大学硕士学位论文 ( 0 4 7 4 - 0 1 5 ) i nt h ei n h i b i t o rg r o u pw a sr e s t m 抽e da n dw a ss i g n i f i c a n t l yl o w e rt h a nt h a ti n p r e g n a n tc o n t r o lg r o u p ( p 0 0 5 ) ；l - n a i 匝0 2m g 只处理组植入胚胎数显著降低( p o 0 5 ) 。为迸一步探讨n o t 胚胎植 入中的作用机理，用明胶酶谱方法检测了子宫中m m p s - 2 和l 删p s - 9 的活性，结果显示：与 对照侧相比，l - n a m e0 2m g 只处理组子宫中i 删p - 2 的活性没有变化，而m 肿_ 9 活性显著 下降；l - n a m e 与s n p 合并应用后，1 6 1 p - 9 的活性恢复正常。结果表明，n o n , j , 鼠胚胎植入 起促进作用，这种作用可能是通过影响 伽，_ 9 的活性实现的。 袁益明等“”在研究n o 对哮喘大鼠m 肝s 及金属蛋白酶组织抑制物表达的影响时发现 l - a r g 组i 脚p - 2 m r n a 水平较哮喘组增加，而t 1 m p - i 水平两组比较差异无显著性，同时肺组 织n 扩和n o p - 水平与m 肝2m i l m 水平呈显著正相关，表明n 0 可能影响哮喘大鼠蛐舻一2 的表达， 改变m m p 一2 t i m p 一1 平衡。 g il b e r t 等m 1 在体外培养的大鼠主动脉平滑肌细胞中，用非选择性n o s 抑制剂l - n m m a 抑制i l 一1 b ( 白细胞介素- 1 ) ，t n f a ( 肿瘤坏死因子一d ) 等细胞因子诱导的n o s 表达生成 的大量n o ，发现l n m m a 以剂量依赖性方式增加舯一9 的合成与表达，而舯一2 表达并无明 显的增高。u p c h u r c h 等报道了相同的研究结果。m i l i n d 等m 1 通过腺病毒载体将e n o s 基因 转染体外培养的大鼠主动脉平滑肌细胞，为证实n o l o 制v s m c ( 血管平滑肌细胞) 的增殖与 迁移是通过调节h 咿的活性与表达而介导；结果发现e n o s 基因转染后v s m c 的增殖明显被抑 制，i 脚p - 2 及i & i p - 9 的活性明显降低，而m 肿抑制剂t i m p - 2 表达明显增加。另外，在细胞培 养基中加入n o 供体和c g m p 类8 - b r o m o c g m p 培养2 4 h 后，同样发现舯一2 与硒俨一9 活性明显降 低，表明n 0 可能通过c g m p 调节m 舻s 的活性。e b e r h a d t 等应用n o 供体s 一亚硝基一乙酰青霉 胺( s n a p ) 发现在肾小球膜细胞中n o 对于i l 一1 p 诱导的i 删p - 9 m r n 水平有显著地抑制作用。 同样表明内源性n o 的产生对m 船啕的表达呈抑制作用。 m m p s 是一个结构同源、依赖锌离子并以e 咧成分作为水解底物的蛋白酶家族。它通过 1 4 湖南农业大学硕士学位论文 对e c m 的降解而参与机体的多种生理和病理过程。对大鼠子宫分离组织的研究表明，n o s 的抑制剂能降低m m p - 2 的活性，相反n 0 的供体却能提高m m p 一2 的活性，提示n 0 可能通过上 调m m p 一2 而参与大鼠胚胎的植入过程”。众多研究表明，环磷酸鸟苷( c g m p ) 是n 0 作用于 靶细胞产生的主要第二信使，可以通过下游许多分子发挥n o 的作用m 1 。鉴于此，沈政等 采用小鼠胚泡体外植入模型，利用n o s 抑制剂l 一单甲基一精氨酸、n o 供体s 一亚硝基一乙酰 青霉胺8 - b r c g 肝对胚泡黏附扩展以及m m p - 2 分泌的影响进行研究发现，n o 能促进体外小鼠 胚泡的黏附、扩展及m m p - 2 的分泌，提示n 0 的这些作用可能是通过c g m p 来实现的。 2 6 问题与展望 成功的胚胎植入要求胚胎与子宫内膜发育一致，体内研究表明，n 0 可能从胚胎发育 和影响子宫环境两方面参与胚泡植入。m 妒s 作为e c m 主要降解酶之一，是一把双刃剑，既 有保护性作用，又有引起损伤性作用嘲。这种差异可能存在于胚胎附植的不同阶段。尽 管人们对于h 咿s 的结构、生物化学特性、功能、催化机制、特异性的底物及t i m p s 对它们 抑制的机制都有了深刻的了解，但仍有许多问题未弄明白。对于前m 妒一2 _ t i 肝一2 复物的 结构的了解十分有助人们了解前m 俨一2 在细胞表面如何与t i 肝一2 与m t i - 砌i p 装配在一起 n 町。然而，在细胞迁移之间是如何进行时间与空间上的装配这样精确的机制尚不可知。 另外，尽管胶原酶是m 妒s 家族中首先被发现的成员，但到底是叫l 型胶原酶还是裂解三螺 旋胶原酶人们还不知道。同时t i 肝一3 对a d a i i 家族的金属蛋白酶的抑制机制也有待于人 们去认识。 基质金属蛋白酶水解细胞外基质是滋养层细胞侵袭的前提条件，了解和掌握基质金 属蛋白酶的作用及调控机制，可帮助我们更精确地把握滋养层细胞侵袭行为。虽然目前 国内外已对m 口s 系统在生殖中的作用作了大量广泛的研究，但尚缺乏对a n 舻s 抑制剂如 肛傩、p n l 等在滋养层细胞侵袭及胚胎植入时的作用及作用机制的研究，深入蛋白酶抑 制剂的研究有助于防治自然流产、妊高征、宫内发育迟缓等疾病，促进避孕技术研究的 发展，并可对恶性肿瘤的治疗提供新的线索。 在胚胎植入过程中n o 调节h 删p s 的活性和表达的机理并不清楚，可能通过c g m p 等不同 的途径调节m m p s 的变化及m m p s t i 卯的平衡，从而影响胚胎附植的成功与失败，因而研究 对m 肝的调节作用及具有非常重要的意义。同时，了解n o 与删p 之间的相互关系将为胚 胎附植的分子调控机理的研究提供新的手段和方法。但n 0 对m 咿的调节作用可能较复杂， 湖南农业大学硕士学位论文 并不是简单的促进或抑制，可能存在一个n o 浓度的临界值，临界值上下的浓度产生的作 用可能不同甚至相反，故仍需大量的研究。 2 研究的目的与意义 本研究将通过盯呻僳的方法检测妊娠早期m 肛_ 9 基因的生理表达及在n 0 抑制情况 下的表达，探讨胚胎附植过程中n o 和m 驴一9 的生理作用，揭示m m p - - 9 在胚胎附植前后的 生理变化特点，并通过不同处理下小鼠子宫内膜的变化来了解n o 、m m p - 9 的作用机理及n o 与m 咿_ 9 之间的相互关系。研究围绕小鼠胚胎植入过程中n o 在妊娠早期的不同时期对 _ m 伊s 活性和表达的调节，探讨m 肝s 活性和表达的动态变化，以充分了解n o 在植入中的 作用机理，以达到进一步了解胚胎植入的网络级联调节通路的目的。本研究对深入探讨 早期胚胎发育机制，揭示其发育过程的调节规律及对了解一氧化氮、m m p - 9 的具体的生理 作用和对胚胎附植过程的作用分子机理有极其重要的意义，为提高胚胎附植率、动物产仔 数及一氧化氮相关疾病的治疗提供了重要的供理论依据和新思路。 湖南农业大学硕士学位论文 材料与方法 1 验材料 1 1 试验用卜硝基一l 精氨酸甲酯 l - n a m e 为美国s i g m a 公司产品，其基本资料如下： 形态： 白色结晶 分子量：2 6 9 7 分子式：c 7 h 1 5 n s 0 4 h c l 结构： 晰 刚、i 飞吲意讹懈t hhh ”刑 。 纯度：9 8 b y 印l c 溶剂：8 2 0 ( 5 0m g m 1 ) 贮存：- 2 0 。c 避光冷冻保存 1 2 试验动物 试验动物为昆明系小白鼠，购自湖南中医学院小动物实验室，7 0 日龄，体重3 5 9 左 右。饲料一并购入，自由采食，自然采光进行饲喂，有完整的历史记录。 1 3 主要试验仪器及型号 梯度p c r 仪：德国c p p e n d o r f 生产，型号为5 3 3 1 稳压稳流电泳仪：北京六一仪器厂生产，型号为d y y - 6 b 凝胶成像系统：美国u v ps i o l m a g i n gs y s t e m 生产，型号为g d s 一8 0 0 0 紫外分析仪：北京六一仪器厂生产，型号为w d 9 4 0 3 b 紫外分光光度计；德国e p p e n d o r f 生产，型号为6 0 3 10 5 4 3 0 超低温冰箱：青岛海尔股份有限公司生产，型号为b d - 3 9 6 l t - 6 5 w 台式离心机：德国e p p e n d o r f 生产，型号为c e n t r i f u g e5 4 1 5 d 低温离心机：德国c p p e n d o r f 生产，型号为c e n t r i f u g e5 8 1 0 r 微波炉：青岛海尔股份有限公司生产，型号为h r 6 7 0 2 d w 立式自动电热压力蒸汽灭菌器：上海申安医疗器械厂生产，型号为l d z x - 4 0 b i 低温离心机：德国e p p e n d o r f 生产，型号为c e n t r i f u g e5 8 1 0 r 1 7 湖南农业大学硕士学位论文 超净台：苏净集团安泰公司 恒温培养箱：哈尔滨市东联电子技术有限公司 立式自动电热压力蒸汽灭菌器：上海申安医疗器械厂生产，型号为l d z x 4 0 b i 制冰机：德国s c o t s m a n 生产，型号为a f l 0 0 超纯水机：重庆颐洋企业发展有限公司生产，型号为a u p - 1 3 5 g - 2 干燥箱：上海跃进医疗器械厂生产，型号为1 0 1 - 2 - b s 1 4 主要试剂及来源 t r i o l ：美国i n v i t r o g e n 公司 i 汀- p c r 试剂盒：德国m b i 公司 2 x t a qp c rm a s t e r m i x ：货号：k t 2 0 1 ，购自北京天为时代科技有限公司 琼脂糖及t r i s ：购自r o c h e 公司 g e n er u l e r t m i o o b p d n al a d d e r ：货号：m d l 0 9 ，购北京天为时代科技有限公司 缓冲液和常用试剂的配备： ( 1 ) w e 缓冲液：l o mm o l lt r i s c i ( p h8 0 ) 、l mm o l le d t a ( p h 8 o ) ，高压灭 菌。 ( 2 ) 5 0 x t a e 缓冲液；2 4 2 9t r i s 溶于7 0 0 r a l 双蒸水中，加入5 7 1 m i 冰乙酸、1 0 0 m l 0 5 m o l le d t a ( p h8 o ) ，定容至1 0 0 0 m l ，室温存放待用。 ( 3 ) 琼脂糖凝胶电泳上样缓冲液：0 2m o l le d t a 、3 0 甘油、0 2 5 - - 甲苯青、0 2 5 9 6 溴酚兰。 。 ( 4 ) l m o l lt r i s c 1 ( p h8 o ) ：将1 2 1 i gt r i s 溶于8 0 0 r a l 双蒸水中，加浓盐酸 调p h 到8 0 定容至1 0 0 0 m l ，灭菌备用。 ( 5 ) 0 5 m o l le d t a ( p h8 0 ) ：8 0 0 r a l 双蒸水加入1 8 6 1 9 二水乙二胺四乙酸二钠， 加n a o h 调p h 值至8 0 ，定容至1 0 0 0 m l ，灭菌备用。 ( 6 ) i o d e p c ：1m ld e p c 溶解于1 l 双蒸水中，用磁力搅拌器搅拌3 0 r a i n 以上，高 压灭菌。 2试验方法 2 1 试验分组及处理 湖南农业大学硕士学位论文 挑选性成熟、生长健康、体重3 0 9 左右的雌性小白鼠。每次2 0 只进行超排处理。下 午2 4 时腹腔注射p m s gi o i u 只，4 6 4 8 小时后腹腔注射h c 6l o i u 只，并与l o 只公 鼠按1 ：1 合笼，过夜，第二天早上8 ：0 0 检查阴道栓，以验栓呈阳性为妊娠第l d ，根据胚 胎发育特点( 一般4 5 d 胚泡开始附植子宫内膜) ，将妊娠早期分为附植前期( d i d d ) 、附 植期( d 5 d 6 ) 和附植后期( d 7 d i o ) 试验分三期进行( 附植前期，附植期，附植后期) ，并随机分为3 组，即将处于妊娠早期 各个阶段( 附植前期d 4 、附植期d 6 和附植后期d 9 ) 的孕鼠随机分为注射生理盐水的对照组 和和注射n o s 抑制剂的n o s 抑制组以及处于相同日龄未作交配小鼠的未妊组，每组5 个重 复。对照组和n o s 抑制组采取腹腔注射的方法处理，分别于各个阶段采取子宫前4 8 h ，对 照组注射生理盐水o 1 m l 只，抑制组注射一氧气化氮合酶抑制剂l - n a 娩( l 一硝基一精氨酸 甲酯) s m y r ，并于妊娠第4 天、6 天和9 天脱臼处死试验鼠，剖腹采取子宫，未妊组小鼠则 不作任何处理，并与其他组同时采取子宫。各组子宫采取后，剔净系膜组织，随即进行检测。 左侧子宫用于总r n a 提取，右侧子宫用于切片制作。 2 2m h p - 9 半定量r t - p c r 2 2 1 总r n a 提取 取5 0 m g 左侧子宫组织样于研磨器中，迅速加入l m i t r i z o l 试剂，研碎并剧烈振荡至 透明的，以充分裂解细胞。室温5 分钟后，将上清移至新e p 管中，加入0 2 m l 氯仿，摇 动1 5 s ，室温放置2 3 分钟，然后在1 2 0 0 0 印m4 c 离心1 5 分钟。转移约4 0 0pl 水相至 一新管内，再加入0 5 r i d 异丙醇混匀，4 c 放置1 0 1 5 分钟。在4 c 下1 2 0 0 0 r p m 离心1 0 分钟。弃上清，加i m l 7 5 乙醇洗涤r n a ，4 c 7 5 0 0 r p m 离心5 分钟。离心后，倒出乙醇， 置空气中干燥5 1 0 分钟，再加入适当的d e p c 处理水，室温下溶解1 0 2 0 分钟。 2 2 2 引物的设计与合成 根据 i - ( h t t p ：w w w n c b l h i m n i h s o y ) g e n b a n k 公布的m t p 一9 基因及内参照b - a c t i n 基因序列，通过p r i m e rp r e m i e r5 软件按引物要求完成，并由北京奥科生物工程 有限公司合成。m m p - 9 基因引物序列为5 一t 从c c ct 6 6t c ac c g g a ct t c - 3 ( 上游引物) 和5 吐t ac g tt c cc g gc t ga t ca 6 - 3 ( 下游引物) ；内参照且一a c t i n 的引物为5 - a c a c r gt 6 cc c at c ta c 6a 6 6 - 3 ( j z 游引物) 和5 a 6 6g g cc g ga c tc 6 tc a ta c t 一3 ( 下 游引物) 。 2 2 3 反转录 湖南农业大学硕士学位论文 在离心管中加入3 l lgr n a 模板，1 u 1 随机引物o l i g o ( d t ) ，8 p 1d e p c 处理水，3 5 秒简短离心，7 0 温育5 分钟，冰浴2 分钟，再加入4pl5 r e a c t i o nb u f f e r ，1l ilr n a s e i n h i b i t o r ，2 工ll d n t p 3 5 秒离心，3 7 温育5 分钟，加入r e v e r t a i dm _ m u l vt r a n s c r i p t a s e 1pl ，共2 0pl 反应体系4 2 温育l d , 时后，7 0 温育1 0 分钟，冰浴2 分钟。即可得n c d n a 产物。 2 2 4p c r 扩增 在离心管中加入1l llc d n a 产物，1 2 5l llt a k a r at a qm i x t u r e ，9 5pl d d h 2 0 , 2 0 p m o l 上下游引物，反应体积共2 51 11 。p c r 反应条件：预热9 5 ，5 r a i n ；然后 9 4 变性，4 5 s e c ；6 0 退火，3 0 s c c ；7 2 延伸，4 5 s e c ，3 0 个循环；然后7 2 末延伸l o m j n 。 2 2 5 琼脂糖凝胶电泳 向1 5 m l t a e 电泳缓冲液中加入1 5 m g 的琼脂糖，在微波炉中加热使其溶解，稍微冷却后， 加入浓度为0 5 | ig i i1 5 3 e b ( 溴化乙淀) 2 2u1 ，混匀后将凝胶倒入制胶板中，室温放置 2 0 m i n ，待凝固后，小心移去梳子，取p c r 反应液3 5l il ，用微量移液器将样品缓缓加入加 样孔中，6 0 v 恒压电泳3 0 m i n ，电泳完毕后，紫外灯下观察结果，并用凝胶图像系统扫描分 析电泳结果。 2 2 6 半定量及统计分析 以b - a c t i n 作内参，重复进行3 洳4 m p 一9 和b - a c t i n 的p c r 扩增，对其产物进行凝胶电 泳检测。运用u v i p r o 凝胶图像分析系统摄像并扫描分析，以目的基因条带的吸光度( a ) 值 与p - a c t i n 条带a 值的比值作为目的基因m r n a 的相对表达强度。凝胶电泳图的目的基因条 带经q u a n t i yo n e 软件( b i a - r a d ) 扫描后，根据所得的各组数据计算出目的基因的相对 表达量，两组均数间比较采用t 检验，多组均数间比较用方差分析，显著性差异以p o 0 5 和 p ( o 0 1 为标准，数据以i s 表示，均采用s a s 8 1 软件包进行统计分析。 2 3 子宫组织切片的制备 2 3 1 取材 小鼠处死后，应快速取出所需的子宫组织。取材的刀要锋利，严禁用手或镊子挤压， 以免损伤组织。切取的组织块厚度一般为0 5 - 1 o c m ，大小1 5 - 2 o c m ，以免影响固定效 果。 2 3 2 固定 湖南农业大学硕士学位论文 固定是将组织块用福尔马林浸泡，使组织内的蛋白质等成分迅速凝固或沉淀，停止 细胞濒死前或死亡后的变化。同时组织固定后不易变形，有利于以后的组织处理。所以 组织一旦离体必须及时固定，固定液的量大约为组织的5 倍。常用1 0 的福尔马林、z e n k e r 氏等固定液。固定时间约为2 4 h 。 2 3 3 冲洗 固定好的组织块需经流水冲洗2 4 h ，冲洗不彻底容易造成脱片和染色不佳。 2 3 4 脱水和透明 脱水就是利用脱水剂将组织内的水分置换出来，以利于有机溶剂的渗入。脱水是否 彻底，直接关系到组织能否充分透明。脱水一般采取上行梯度酒精，从8 0 酒精、9 5 酒精至无水酒精。还要注意组织在无水酒精内时间过久，容易发脆，一般约为4 h 。组织 块脱水后就进入透明步骤，即经过一种既能与脱水剂混合，又能与石蜡相溶的媒介物质。 目前最好的透明剂是二甲苯，但二甲苯容易使组织发脆，所以在二甲苯中时间也不宜过 长，一s t 4 0 - 6 0 m i n 。 2 3 5 浸蜡 组织透明后，在熔化的石蜡内浸渍的过程称为浸蜡。浸蜡温度过高( 超过7 0 ) ，会 导致组织发硬，还会使组织内的抗原受到破坏。浸蜡用的石蜡熔点一般在5 6 2 3 - 6 0 2 2 ， 浸蜡温度控制在6 0 c - 7 0 c 。浸蜡时间的长短直接影响组织切片，不同的组织浸蜡时间不 同，通常较脆组织如肝、甲状腺、脾等浸蜡2 - 3 h ，含有结缔组织的器官如胃、膀胱、肠 等浸蜡时间要延长6 h 。所用的石蜡如有杂质尽可能过滤，以防附着在组织上，影响切片 与观察。鼠块组织时问量化自动脱水，透明，浸蜡流程： 乙醇溶液 7 5 3 5h 804h 9 5 i2h 9 5 i i2h 1 0 0 i 1h2 0m i n 1 0 0 i i2h2 0m i n 1 ：1 二甲苯与酒精 1 0m i n 二甲苯i 3 0m i n 湖南农业大学硕士学位论文 二甲苯i i 石蜡i 石蜡i i 石蜡 2 3 6 包埋 3 0m i n 1 0m i n 1 5 m i n 3 5h 用包埋剂来支持组织的过程称为包埋。最常用的是石蜡包埋法。包埋的关键是平整 和方位。包埋时，要求用镊子轻压组织块拱起部份，使之平贴于底部，通常采用组织的 最大面包埋；囊壁、管腔组织应竖直包埋。修去两边的余蜡( 指切片时与切片刀垂直的两 侧) 。 2 3 7 切片 切片的第一步需粗切。粗切的厚度2 0 - 4 0um ，粗切至组织全部暴露后，再进行细切。 细切至组织块表面均匀一致，无白点。切片时要求用力均匀、柔和，切片厚度一般为3 5 l im ，切下的蜡膜大小、形状应与组织块上的组织大小形状一致。如气温较高，石蜡组织 块较软可用冰块局部冰冻( 操作状态下) ，使组织块变硬便于做连续性切片；如气温较低、 石蜡组织块较硬时可用大拇指热敷或用嘴吹气加温，使组织块变软再做连续性切片。 2 3 8 展片与捞片 把切片放人温水中展开即为展片。展片水温应在4 8 c - 5 5 c ，这主要和包埋蜡的熔 点有关：水温过高，会引起组织细胞散开；水温过低，切片皱摺无法摊平。展开片子上 的皱摺，有两个方法：在切片时边切边向蜡片吹气，这样片子放到热水里会自然展平； 切片结束后，先把切片放在3 0 酒精水溶液中，让酒精的张力自动把皱摺展开，然后 再将切片移到热水中，酒精浓度不宜过高，否则容易引起切片破碎，出现裂隙。脂肪类 组织遇到酒精会散开，故不能用此法。捞片时，要选择那些完整、无皱摺的切片，粘贴 于载玻片上。 2 3 9 烤片和脱蜡 烤片是烤干切片上多涂的水分和石蜡，并使切片与载玻片牢固粘贴。一般在6 0 c 的 温箱内进行，温度过高，会引起切片的组织细胞收缩；时间太短( 少于2 0 分钟) ，容易造 成脱片。脱蜡也相当重要，如果脱蜡不干净，切片不易着色或着色不匀。所以在脱蜡过 程中，脱蜡剂( 松节油) 要常更换( 用1 5 - 2 0 次) 。烤片结束后立即将切片放在温箱内预热( 4 0 c - 4 5 c ) 的松节油i 、i i 中1 5 m i n ，然后经下行梯度酒精洗去松节油至水。 湖南农业大学硕士学位论文 2 3 1 0 染色 染色理想的切片在显微镜下应是细胞核与细胞质蓝红相映，色泽鲜艳，核浆对比明 显，核膜及核染色质颗粒清晰可见。常用脏染色，以增加组织细胞结构各部分的色彩差 异，利于观察。苏木精( h e m a t o x y l i n ，h ) 是一种碱性染料，可将细胞核和细胞内核糖体 染成蓝紫色，被碱性染料染色的结构具有嗜碱性。伊红( e o s i n ，e ) 是一种酸性染料，能 将细胞质染成红色或淡红色，被酸性染料染色的结构具有嗜酸性。染色前，须用二甲苯 脱去切片中的石蜡，再经由高浓度到低浓度酒精，最后入蒸馏水，就可染色。呱染色过 程是： 将已入蒸馏水后的切片放入苏木精水溶液中染色数分钟。 酸水及氨水中分色，各数秒钟。 流水冲洗i 小时后入蒸馏水片刻。 入7 0 和9 0 酒精中脱水各1 0 分钟。 入酒精伊红染色液染色2 - 3 分钟。 2 3 i i 脱水和封片 切片脱水采用上行梯度酒精。浓度低的酒精比浓度高的酒精更容易脱水，但也容易 使伊红退色故脱水时间要短( 1 2 m i n ) ，也可无须用酒精脱水而直接晾干。切片经二甲苯 透明。用中性树胶封片，一定要避免气泡的产生。 湖南农业大学硕士学位论文 结果与分析 1 总8 n a 提取结果 提取的总r n a 经紫外分光光度计测得a 2 “a 瑚在1 8 到2 0 之间，并且在o 8 琼脂 糖凝胶电泳上可清晰看到2 8 s 和1 8 s 两条带( 图2 ) ，其亮度比为2 ：1 ，并可见5 s 带， 表明所提的r n a 纯度高，未降解，可作为逆转录反应的模板。 图2 总p , n a 电泳图 2 退火温度、循环次数和引物浓度的选择 2 1 退火温度 根据合成引物的t m 值：采用2 ( a + t ) + 4 ( g + c ) ，正反义平均数上下波动4 5 进行 检测，琼脂糖凝胶电泳确定以6 0 c 为最佳退火温度。 2 2 循环次数的选择 内参循环次数的确定( 见图3 ) ，从1 - 1 0 号带分别为1 5 ，1 7 3 1 ，3 3 个循环，检测结果 以2 7 个循环为最佳循环次数。1 0 1 p - 9 循环次数的确定( 见图4 ) ，1 号带为内参，从2 - 1 0 号带分别为2 5 ，2 7 3 9 ，4 1 个循环，检测结果以3 7 个循环为最佳循环次数。 1284 5678 91 012345 67891 0 图3内参照不同循环次数电泳图4m l p - 9 不同循环次数电泳图 2 3 引物浓度的选择 湖南农业大学硕士学位论文 引物浓度的确定( 见图5 ) ，l 、2 、3 、4 号带分别为引物浓度5 ，1 0 ，2 0 ，3 0 p m o i ，检测 结果以4 号带2 0 p m o i 为最佳引物浓度。 l234 图5 砌i p - 9 不同引物浓度电泳图 3 未妊组、妊娠组和抑制组小鼠子宫删p _ 9 琼脂糖电泳检测结果 3 1 未妊组小鼠子宫m m p - 9 的表达检测结果 在与对照组和抑制组的附植前期、附植期、附植后期相同日期采取未交配小鼠子宫 进行检测，其m m p - 9 在各时期都有相当近似的表达( 见图6 ) ，电泳图第一条带为m a r k e r 第2 - 6 号带为内参，7 - 9 号带为m m p - 9 。 123 456789 图6 未妊组小鼠子宫删p _ 9 电泳图 3 2 妊娠对照组m m p - 9 的表达检测结果 在小鼠交配见阴栓后的第2 天、第4 天和第7 天注射生理盐水0 1 m l 只，4 8 小时后 处死小鼠采取子宫进行检测，各时期都有m 咿- 9 的表达且有明显的差异( 见图7 ) ，电泳图 从上到下分别为附植前期( 1 - 5 号带为内参，6 - 1 0 号带为m m p - 9 ) ，附植期( 1 - 5 号带为内 参，6 一1 0 号带为r a p - 9 ) 和附植后期( t - 3 号带为内参，4 - 6 号带为r a p - 9 ) 。 湖南农业大学硕士学位论文 图7 妊娠对照组小鼠子宫m m p - 9 电泳图 3 3 抑制组m m p - 9 的表达检测结果 在小鼠交配见阴栓后的第2 天、第4 天和第7 天分别注射n o s 抑制剂0 5 m g 只，4 8 小时后处死小鼠采取子宫进行检测。在附植前期检测不到m m p - 9 的表达，在附植期和附植 后期均有不同程度的表达( 见图8 ) 。电泳图中1 - 5 号带为内参，6 一1 0 号带为m m p - 9 。 图8n o s 抑制组m m p 一9 电泳图 湖南农业大学硕士学位论文 4 试验各组子宫m 肝啕基因的相对表达量 根据凝胶电泳图目的基因条带的扫描，对各组在附植前期、附植期、附植后期的m m p 一9 基因的相对表达量进行了分析，结果见表5 。锄4 p - 9 基因的相对表达量的最低值为0 ( 抑 制组附植前期) ，最高值为1 5 4 ( 妊娠对照组附植期) 。 表5m 咿一9 基因条带扫描的相对表达量 t a b l e5t h er e l a t i v eq u a n t i t yo f 蛐俨9g e n ee x p r e s s i o n 5 正常附植过程中子宫m 肝一9m r n a 的表达特征 如图9 显示，m m p - 9 的表达在正常附植前期和附植期呈增长趋势，附植期达到最高， 与未妊小鼠子宫内膜的表达量相比有极显著的提高( p o 0 1 ) ；在附植后期m m p - 9 的表达 又恢复到未妊小鼠的水平。 图9 正常附植过程中小鼠子宫j 6 1 p - 9m r n a 的表达特征 f i g 9t h em l 姒e x p r e s s i o no fe n d o m e t r i a lm m p - 9i nm i c ed u r i n gi m p l a n t a t i o np h a s e 6 附植各时期n o s 抑制组m 肝一9 m r n a 的表达特征 如图1 0 显示，用n o s 抑制剂处理后，小鼠子宫内膜m m p - 9 的表达在附植前期完全抑 制，附植期和附植后期的表达量分别达到0 4 7 和0 5 5 ，的较低水平。 湖南农业大学硕士学位论文 图l o 抑制组删p 9 m 蹦 的表达特征 f i g 1 0t h em 烈ae x p r e s s i o no fe n d o m e t r i a l 帅- 9i nm i c ed u r i n gi m p l a n t a t i o np h a s e w i t hn o si n h i b i t i o n 7 对照组与n o s 抑制组小鼠附植各时期m 肿一铀r n a 的表达量差异 如图l l 显示，对照组小鼠子宫m m p - g m r n a 的相对表达在附植前期和附植期分别为 0 8 1 和1 5 4 ，明显著高于抑制组；附植后期则在两组之间差异不明显。 图1 1 小鼠胚胎附植各组m m p - 9m r n a 表达的结果比较 f i g 11t h em l me x p r e s s i o no fe n d o m e t r i a l 砌舻9i nm i c ed u r i n gi m p l a n t a t i o np h a s e 8 子宫内膜组织形态学观察结果 8 1 附植前期子宫内膜形态的观察 湖南农业大学硕士学位论文 子宫壁由外到内分为外膜、肌肉和内膜三层。子宫内膜的一般结构是由单层柱状上 皮( 纤毛细胞和分泌细胞) 和固有层( 基底层和功能层) ，固有层主要由基质细胞、子宫腺、 螺旋动脉组成。在附植前期，形态学观察显示，妊娠对照组和抑制组的子宫内膜均有一 定程度发育，但妊娠对照组子宫内膜发育明显，腺体数量明显增多( 图1 2 ) 。 图1 2 附植前期子宫切片图( 1 0 0 x ；左圈为对照组，右圈为抑制组) f i g 1 1e n d o m e t r i a ls e c t i o ni ne a r l yi m p l a n t a t i o np h a s e ( 1 0 0 ： l e f t ：c o n t r o lg r o u p ；r i g l l t ：i n h i b i t o rg r o u p ) 8 2 附植期子宫内膜的观察 在附植期，形态学观察显示。妊娠对照组的子宫内膜进一步发育，柱状上皮细胞增 高，腺体发达，羽状突起非常明显；抑制组子宫内膜柱状上皮细胞相对较低，腺体数少， 腔表面上完整，羽状突起较少( 见图1 3 ) 。对照组螺旋动脉丰富且扩张，基质细胞形成蜕 膜细胞，发生明显的蜕膜样变，基质变得疏松，同时子宫内膜腺呈现出明显的活动状态： 而抑制组子宫内膜基质则相对致密( 见图1 4 ) 。 图1 3 附植期子宫切片图( 1 0 0 x ：左图对照组，右图抑制组) 湖南农业大学硕士学位论文 f i g 1 3e n