（分析化学专业论文）偶氮染料与环糊精、dna和蛋白质相互作用的研究及其分析应用.pdf

摘要 摘要 第一章分别概述了染料 超分子化学 环糊精 脱氧核糖核酸 d n a 和蛋白质的基本内容 综述了近年来染料与环糊精 小分子与d n a 及其 小分子与蛋白质相互作用的研究进展 第二章研究了偶氮染料活性艳红k 2 g 的电化学行为 建立了它的电 分析方法 在0 1 0 m o l l 的n a c l p h6 9 底液中活性艳红k 2 g 有一稳 定 灵敏的还原峰 峰电位约为一0 7 8 v v s s c e 其峰电流与浓度在 7 0 1 0 罐 1 0 1 0 4 m o l l 范围内呈现良好的线性关系 检出限为6 0 1 0 一m o l l 精密度 标准回收率均满足定量分析的要求 此外讨论了该 染料分子还原电流的性质 探讨了电极反应机理 第三章在底液为0 1 0 m o l l 的n a c i 溶液中研究了偶氮染料活性艳红 k 2 g 的极谱伏安行为 峰电位约为一o 7 8 v v s s c e 处该染料有一稳定 的 灵敏的还原峰 用线性扫描二阶导数极谱法研究了该染料与不同环 糊精的相互作用 采用 电流法 测定了包结常数 比较了不同类型环 糊精的包结能力 初探了包结点的可能位置 并对其进行了理论分析 第四章研究了偶氮染料活性艳红k 一2 b p 在o 10 m o l l 的n a c i p h6 9 底液中的极谱伏安行为 活性艳红k 一2 b p 有一稳定的 灵敏的还原峰 以线性扫描极谱法研究了该染料与环糊精的相互作用 采用 直线法 测定了该染料与各种环糊精的包结比和包结常数 比较了不同类型环糊 精的包结能力 初探了影响包结能力的可能因素 第五章研究了偶氮染料碱性棕g 的极谱伏安行为并建立了其极谱分 析方法 结果表明 在p h9 1 的n h 4 c i n h 3 底液中 该染料产生一峰形 好 稳定 灵敏的还原峰 其峰电位约为一o 6 7 v v s s e e 峰电流与染 料浓度在3 0 1 0 嗡m o l l 1 0 10 4 m o l l 呈良好的线性关系 检出限为 9 0 1 0 一m o l l 考察了1 6 种染料对其定量检测的干扰 结果表明该法 具有灵敏度高 线性范围宽 操作简便等优点 适于碱性棕g 的定量分 偶氮染料与环糊精 d n a 和蛋白质相互作用的研究及其分析应用 析 此外还研究了该染料的还原电流的性质 探讨了电极反应机理 第六章用极谱伏安法研究了碱性棕g 与环糊精相互作用的超分子体系 及其超分子体系还原电流的性质 利用 直线法 测定了该染料与不同环 糊精相互作用的包结常数和包结比 比较了不同类型环糊精的包结能力 并探讨了影响包结能力大小的可能因素和包结点位置 此外 本文还用紫 外分光光度法对碱性棕g 与环糊精的超分子体系作了研究 第七章以碱性棕g 作为电化学探针对鱼精d n a 进行分析 发现在p h 8 0 的n h 4 c 1 一n i t 的缓冲溶液中 该染料与鱼精d n a 能发生相互作用形 成超分子复合物 使其在一0 6 7 v v s s c e 处的极谱还原峰峰电流下降 在最佳实验条件下 极谱还原峰峰电流随着d n a 量的增加显著下降 且 峰电流的下降值同d n a 的浓度在o 1 0 3 6pg m l 范围内呈良好的线性 关系 检出限为0 0 4u m l 还测定了常见无机金属离子 氨基酸 碱 基 糖类及表面活性剂对d n a 测定的干扰 用于实际样品中d n a 的检 测 结果令人满意 研究了复合物还原电流的性质并结合紫 b 可见吸收 光谱法探讨了b b g 与d n a 的相互作用方式 第八章以电化学法和光度法对酸性橙i i 与牛血清白蛋白 b s a 的相 互作用进行了研究 在p h 7 2 的t r i s h c i 缓冲溶液中 该染料有一灵敏的 还原峰 峰电位约为一o 6 9 v v s s c e 加入b s a 后其还原峰电位正移 峰电流下降 据此建立了一种测定b s a 的电分析新方法 在最优化条件 下 峰电流下降值与b s a 的浓度在5 0 1 0 8 1 0 1 0 m o l l 范围内呈 良好的线性关系 检出限为3 0 1 0 m o l l 可用于b s a 的定量测定 此 外测定了该染料与b s a 的结合比和结合常数 并对结合反应机理进行了 初步的探讨 关键词活性艳红k 一2 g 活性艳红k 一2 b p 碱性棕g 酸性橙i i 超分 子 环糊精 脱氧核糖核酸 蛋白质 极谱法 伏安法 电化学探针 摘要 s t u d yo nt h ei n t e r a c t i o n so f a z od y ew i t hc y c t o d e x t r i n d n a a n dp r o t e i n a n da n a l y t i c a la p p l i c a t i o n y o u q i nl i a n a l y t i c a lc h e m i s t r y d i r e c t e db yp r o f e s s o rj i n g h a op a n a b s t r a c t c h a p t e r1t h ef u n d a m e n t a lc o n t e n t so fd y e s u p r a m o l e c u l ec h e m i s t r y c y c l o d e x t r i n d n aa n dp r o t e i nw e r ei n t r o d u c e dt h er e s e a r c ha d v a n c e so f t h ei n t e r a c t i o no fd y e sw i t hc y c l o d e x t r i n d n aa n dp r o t e i ni nr e c e n ty e a r s w e r es u m m a r j z e di nd e t a i l s c h a p t e r2e l e c t r o c h e m i c a lb e h a v i o ro fr e a c t i v eb r i l l i a n tr e dk 一2 g w a ss t u d i e da n dap o l a r o g r a p h i cm e t h o df o rt h ed e t e r m i n a t i o no fi t sh a v e b e e ne s t a b l i s h e d as t a b l ea n ds e n s i t i v el i n e a r s w e e pv o l t a m m e t r i cp e a ki s o b t a i n e da t o 7 8 v v s s e e i nn a c i p h 69 s o l u t i o n t h ep e a kc u r r e n ti s p r o p o r t i o n a lt oc o n c e n t r a t i o no v e rt h er a n g eo f7 0 1 0 一k 1 0 1 0 4 m o l l a n dd e t e c t i o nl i m i ti s6 0 1o m o l l t h i sm e t h o di ss u i t a b l et oa p p l yf o r r e a c t i v eb r i l l i a n tr e dk 一2 go ft h eq u a n t i t a t i v ea n a l y s i s t h ec h a r a c t e r i s t i co f t h er e d u c t i o np e a kc u r r e n th a sb e e ns t u d i e d a tl a s t t h em e c h a n i s mo f e l e c t r o d er e a c t i o nw a s p r e l i m i n a r yd i s c u s s i o n c h a p t e r3 p o l a r o g r a p h i ca n dv o l t a m m e t r i cb e h a v i o r s o fr e a c t i v e b r i l l i a n tr e dk 一2 gw e r es t u d i e d t h er e s u l ts h o w st h a tr e a c t i v eb r i l l i a n t r e dk 一2 gh a sas t a b l ea n ds e n s i t i v er e d u c t i o np e a ka tp o t e n t i a lo fa b o u t o 7 8 vf v s s c e i nt h en a c js o l u t i o n i n t e r a c t i o no fr e a c t i v eb r i l l i a n tr e d k 一2 gw i t hc y c l o d e x t r i n sw a sa l s os t u d i e d b yl i n e a rs w e e ps e c o n do r d e r d e r i v a t i v e p o l a r o g r a p h y t h ec o r r e s p o n d i n g i n c l u s i o nc o n s t a n t s w e r e d e t e r m i n e d b y c u r r e n tm e t h o d i n c l u s i o na b i l i t yb e t w e e nt h ed y ea n d d i f f e r e n tk i n d so fc y c l o d e x t r i n sw a sc o m p a r e d ap o s s i b l ei n c l u s i o np o s i t i o n w a sp r e l i m i n a r yd i s c u s s e da n di t st h e o r e t i c a la n a l y s i sw a sg i v e n 偶氮染料与环糊精 d n a 和蛋白质相互作用的研究及其分析应用 c h a p t e r4v o l t a m m e t r i ca n dp o l a r o g r a p h i cb e h a v i o r s o fr e a c t i v e b r i l l i a n tr e dk 一2 b pw e r es t u d i e d t h er e s u l ts h o w st h a tr e a c t i v eb r i l l i a n t r e dk 一2 b ph a sas t a b l ea n ds e n s i t i v er e d u c t i o np e a ka tp o t e n t i a lo fa b o u t 0 8 vf v s s e e i nt h en a c ls o l u t i o n i n t e r a c t i o no fr e a c t i v eb r i l l i a n tr e d k 一2 b pw i t hc y c l o d e x 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ot h ec o n c e n t r a t i o no v e rt h er a n g eo f3 0x lo 8 m o l l 1 0 1o 4 m o l la n dd e t e c t i o nl i m i ti s9 0 10 9 m o l l t h e i n t e r f e r e n c ew a sd e t e r m i n e da b o u t16k i n d so fd y e s t u f f s t h i sm e t h o dc o u l d b eu s e di nt h eq u a n t i t a t i v ea n a l y s i so fb b gi na d d i t i o n t h ep r o p e r t i e so ft h e p e a kc u r r e n tw e r es t u d i e d i nd e t a i l t h em e c h a n i s mw a sp r o p o s e df o r e le c t r o d er e a c t jo n s c h a p t e r6v o l t a m m e t r i ca n dp o l a r o g r a p h i cb e h a v i o r so fs u p r a m o l e c u l a r s y s t e mo fb a s i cb r o w ng w i t hc y c l o d e x t r i n sw e r es t u d i e d t h ep r o p e r t i e so f t h ep e a kc u r r e n tw e r es t u d i e di nd e t a i l t h ec o r r e s p o n d i n gi n c l u s i o nc o n s t a n t s w e r ed e t e r m i n e db y s t r a i g h tl i n em e t h o d i n c l u s i o na b i l i t yb e t w e e nt h ed y e a n dd i f f e r e n tk i n d so fc y c l o d e x t r i n sw a sc o m p a r e d ap o s s i b l ei n c l u s i o n p o s i t i o nw a sp r e l i m i n a r yd i s c u s s e da n di t s t h e o r e t i c a la n a l y s i sw a sg i v e n i n t e r a c t i o no f b a s i cb r o w ngw i t hc y c l o d e x t r i nw a sa l s os t u d i e db yu v v i s s p e c t r o p h o t o m e t r y c h a p t e r7d n ao ff i s h s p e r m h a sb e e n a n a l y s e db y u s i n g x v l 摘要 e l e c t r o c h e m i c a lp r o b eo fb a s i cb r o w ngi n0 10m o l ln i 1 3 n h 4 c ib u h e r s o l u t i o n p h8 o b b gm a yi n t e r a c t w i t hd n at of o r m s u p r a m o l e c u l e c o m p l e x b b gh a sas e n s i t i v e r e d u c t i v ep e a ka t o 6 7 v v s s c e o nt h e h a n g i n gm e r c u r yd r o pe l e c t r o d e a f t e ra d d i n gd n a t oa b o v es o l u t i o n t h e r e d u c t i o np e a kc u r r e n to fb b gd e c r e a s e sl i n e a r l yw i t ht h ec o n c e n t r a t i o no f d n af r o m0 10ug m et o3 6ug m e d e t e c t i o nl i m i ti so 0 4ug m e t h e i n t e r f e r e n c ee x p e r i m e n ta b o u tf o r e i g ns u b s t a n c ea n dd n ai n r e a ls a m p l e s w e r ed e t e r m i n e da n dt h er e s u l t sw e r es a t i s f i e d t h ei n t e r a c t i o nm e c h a n i s mo f t h e s u p r a m o l e c u l a rs y s t e m o fb b gw i t hd n ah a sb e e ns t u d i e d t h e p r o p e r t i e so ft h ep e a kc u r r e n to fc o m p l e xw e r es t u d i e di nd e t a i la n dt h e i r i n t e r a c t i o n p a t t e r n w a sd i s c u s s e db ys p e c t r o s c o p ya n de l e c t r o c h e m i c a l m e t h o d c h a p t e r8t h ei n t e r a c t i o no fbs aw i t ha c i do r a n g e1 1w a ss t u d i e db y e l e c t r o c h e m i c a lm e t h o da n ds p e c t r o p h o t o m e t r y i np h7 2t r i s h c lb u f f e r a c i do r a n g ei ih a sas e n s i t i v er e d u c t i v ep e a ka t 0 6 9 v v s s c e a f t e r a d d i t i o no fb s at ot h ea b o v es o l u t i o n t h er e d u c t i o np e a kc u r r e n to fa c i d o r a n g ei id e c r e a s e s a n dr e d u c t i o n p e a kp o t e n t i a l s h i f t s p o s i t i v e l y a n e l e c t r o c h e m i c a lq u a n t i t i v ea n a l y s i sm e t h o do fb s aw a sd e v e l o p e db a s e do n t h ei n t e r a c t i o nb e t w e e na c i do r a n g ei ia n db s a t h er e a c t i n ga n dm e a s u r i n g c o n d i t i o nw e r eo p t i m i z e d t h ed e c r e a s eo ft h er e d u c t i o np e a kc u r r e n to fa c i d o r a n g ei ii sp r o p o r t i o n a l t ot h ec o n c e n t r a t i o no fb s ai nt h e r a n g eo f 5 0 x1 0 81 0 x1 0 一m o l l d e t e c t i o nl i m i ti s3 0 x1 0 m o l l a c i do r a n g ei i a se l e c t r o c h e m i c a lp r o b ec a nb ea p p l i e dt od e t e r m i n et h ec o n c e n t r a t i o no f b s a t h eb i n d i n gr a t i oa n db i n d i n gc o n s t a n to fd n aw i t hb b gw e r e c a l c u l a t e db yl i n e a rs w e e pv o l t a m m e t r y t h eb i n d i n gm e c h a n i s mw a sa l s o p r e l i m i n a r i l yd i s c u s s e d k e y w o r d sr e a c t i v eb r i l l i a n tr e dk 一2 g r e a c t i v eb r i l l i a n tr e dk 一2 b p b a s i cb r o w ng a c i do r a n g ei i s u p r a m o l e c u l e c y c l o d e x t r i n s d n a p r o t e i n p o l a r o g r a p h y v o l t a m m e t r y e l e c t r o c h e m i c a lp r o b e 第一章绪论 第一章绪论 1 1 染料化学简介 1 1 1 染料简介 染料是能将纤维或其它基质染成一定颜色的有色有机化合物 通常是分子结构 较复杂的有机芳香族化合物 由于含有发色团与助色团而呈现出不同的颜色 按化学 结构可分为偶氮染料 葸醌染料 芳甲烷染料 靛族染料 硫化染料 酞菁染料 硝基和亚硝基染料 甲川 多甲川染料 二苯乙烯类染料及各种杂环染料等 按应 用性能可分为直接 酸性 阳离子 分散 还原 硫化 缩聚染料及荧光增白剂 此外还有氧化 溶剂 丙纶以及用于食品工业的食品染料l l j 染料主要用于纺织物的染色与印花 同时也广泛用于塑料 橡胶 油墨 皮革 食品 造纸等工业 从1 8 5 6 年英国科学家p e r k i n 发现的第一个合成染料苯胺紫开始 之后各种合成染料相继问世 染料工业自此成为精细化工领域的 个重要分支 近 年来 有机染料在光学和电学等方面的特性逐渐为人们所认识 2 3j 它的应用正在逐 步向信息技术 生物技术 医疗技术等现代高科技领域中渗透 染料在非染色领域 中的应用越来越重要 引 1 1 2 偶氮染料简介 分子中含有偶氮基 n n 发色团的染料统称为偶氮染料 是印染企业在对稚 料及纺织品或塑料制品进行染色加工时使用的一种化学制剂 5 j 通常具有羟基或氨基 等助发色团 染料与相应的醌腙表现出苯型 醌型的互变异构现象 根据染料中偶氮 基的数目 可以分为单偶氮 双偶氮 三偶氮和多偶氮染料 包括酸性 媒染 活 性 阳离子 中性染料 分散染料等 偶氮染料一般是将芳香胺重氮化后与偶合组 分偶合 偶合完毕进行盐析或直接干燥制成怕j 其中杂环偶氮染料色光鲜艳 分子吸 光系数大 7 j 偶氮染料约占合成染料品种的5 0 以上 是迄今为止品种数量最多的一类合成 染料 具有广泛地用途 作为各种纤维的染料 颜料和溶剂染料 以及一些各种各 样非纺织应用的色素 8 1 0 2 年9 月1 1 日欧盟发出6 l 号禁令 禁止使用在还原条件 下会分解产生2 2 种致癌芳香胺的偶氮染料 我们很有必要对这些芳香化合物对人体 健康的影响有一个科学的认识 因此对于偶氮染料的研究就不言 而喻了 偶氮染料与环糊精 d n a 和蛋白质相互作用的研究及其分析应用 1 2 环糊精化学概述 1 2 1 环糊精简介 环糊精 c y c l o d e x t r i n 简称c d 是一类由d 一吡喃葡萄糖单元 通过a 一1 4 糖苷键 首尾相连形成的环状化合物 是继冠醚以后超分子化学研究的第二代主体 化合物 是淀粉在淀粉酶作用下酶促降解生成的环状低聚糖的总称 9 j 天然环糊精有 q 1 3 y c d 它们分别含有6 7 8 个葡萄糖基 其分子结构如图1 1 l o 环糊 精所有伯羟基均坐落于环的一侧 葡萄糖单元的六位羟基构成了环糊精截状结构的 主面 较窄端 而所有仲羟基座落与环的另一侧 即二 三位羟基构成了环糊精截状结 构的次面 较阔端 环糊精的内壁由指向空腔内的c 3 和c 5 上的氢原子及糖苷键的 氧原子构成 糖苷键的氧原子上的孤对电子指向空腔内部 使环糊精空腔内产生较 高的电子云密度 从而表现出l e w i s 碱的特征 故c d 内腔是疏水性的 而c d 的 外腔却有很多羟基 这使得c d 有内疏水而外亲水的性质 眩1 c d 在碱性乃至强碱性 溶液都很稳定 但酸却可使其部分水解生成葡萄糖和系列非环麦芽糖 l3 1 表1 1 列 出了c d 的一些重要参数 旧j 图1 1 昂 c d 分子的空腔内部和外部质子位置示意图 左 和立体图 右 f i g 1 lr e p r e s e n t a t i v el o c a l i z a t i o no ft h ei n t e r n a la n de x t e r n a lp r o t o n si nt h eb c dm o l e c u l e 1 2 2 环糊精包结物的制备与表征 环糊精由于其独特的性质 具有范围极广的各类客体 与有机物 无机物 过 渡金属配合物 稀有气体均能形成包结物 1 4 1 6 在水溶液中 共增溶剂存在下 悬 第一章绪论 浮液中 可制的水溶液中的包结物 通过共研磨法 封闭容器中加热 室温摇动法 制得固相包结物 表1 1 环糊精的一些重要参数 t a b 卜1s o m ei m p o r t a n tp a r a m e t e r so fc y c l o d e x t r i n s 环糊精包结物能否形成受内因与外因的影响 其外因包括三维空i 瑚排列的相互 匹配性 范德华力 色散力 偶极 偶极相互作用 电荷转移作用 氢键 疏水性作 用力 环糊精大环张力的释放等 这几种作用力同时为包结物的形成和稳定作出了 贡献 至于其中哪一种作用力更大 则须根据不同客体分子而定 此外 温度 溶 液的酸碱度等也是影响包结物形成的重要因素 1 7 1 8 固体包结物的表征主要有x 射线粉末衍射 红外与拉曼光谱 核磁共振 热分 析 质谱 扫描电子显微镜 固体时间分辨荧光分析等方法 而溶液中包结物包结 比的测定则常用紫外吸收光谱 荧光光谱 核磁共振 差示扫描量热等方法测定 1 9 1 2 3 环糊精的衍生物 环糊精衍生物是指在保持大环基本骨架不变的情况下引入取代基后而形成的环 糊精 2 0 修饰后的环糊精腔体深度增加 体积增大 2 l 不仅分子结构发生变化 提 高了包结能力 而且其物理化学性质也发生了相应的改变 环糊精衍生物按取代度的性质大体分为水溶性 疏水性及离子性三种 水溶性 环糊精衍生物主要有支链c d 甲基化c d 羟乙基c d 羟丙基c d 及低分子量c d 聚合物等 疏水性环糊精衍生物产品有含氮阳离子产品及阴离子性产品 阴离子性 产品如羧甲基环糊精 硫酸酯环糊精和磷酸酯环糊精等 偶氮染料与环糊精 d n a 和蛋白质相互作用的研究及其分析应用 1 2 4 环糊精的应用 环糊精及其衍生物具有能通过对客体形成包结物来改变客体化合物的理化性 质 其研究的主要内容集中于新型环糊精衍生物的合成及其对小分子的识别作用 环糊精在电极表面的自组装 环糊精构造轮烷和多轮烷超分子 环糊精超分子化合 物模拟生物酶的研究 环糊精与冠醚杯芳烃识别客体分子的协同作用等方面 2 2 因 此它们在食品 烟草 染色化学及印染工业 医药 生命科学和化妆品等领域中有 十分广泛的应用前剥2 3 3 0 近年来环糊精已被成功运用到分析化学的各个领域 其 中主要是色谱分析 光谱分析 和电化学分析三个方面 3 l 35 1 1 3 超分子化学概述 1 3 1 超分子化学的概念 1 9 8 7 年 c j p e d r s e n d j g r a m a n dj m l e h n 由于超分子化学的研究成果共同 获得诺贝尔化学奖 至此化学的发展进入了一个新的时代 从分子化学到超分子化 学 作为一门新兴的学科 它是继冠醚与穴状等大环配体的发展以及分子自组装的 研究和有机半导体 导体的研究进展而发展起来的1 3 引 超分子化学主要研究两种以 上的化学物种通过分子间力相互作用缔结而成的复杂有序且具有特定功能的超分子 体系的科学 3 7 是 分子组装和分子间键的化学 是 c h e m i s t r yb e y o n dt h em o l e c u l e 3 8 1 它同时也是研究超分子或分子超结构的形成 性质及应用的化学 包括分子识 别原理 受体化学 分子自组装 超分子光化学 超分子电化学 超分子催化化学 超分子工程学 超分子生命科学等 39 它是化学和多门学科的交叉领域 不仅与物 理学 材料科学 信息科学 环境科学等相互渗透 更具有重要理论意义和潜在的 前景是在生命科学中的研究与应用m 4 1 3 2 超分子作用的概念 超分子有别于分子和配合物 它是由主体与客体在满足能量匹配 几何匹配等 条件下 通过具有分子识别能力的非共价键分子间的缔合形成的具有某种特定功能 和性质的超级分子 或者说 主客体间的关系必须满足f i s c h e r 提出的 锁和钥匙 原理 4 2 1 非共价键力包括空间效应影响下的范德华力 静电力 氢键力 相互作 用与疏水相互作用等 一般情况下 它是几种力的协同与加和 且具有一定的方向 性和选择性 其总的结合力强度不亚于化学键1 4 3 1 它是产生分子识别的关键 而分 子识别是类似 锁和钥匙 的分子问专一性结合 是形成超分子结构和体系的基础 44 4 第一章绪论 超分子作用对于某些化学反应过程如催化等具有重要的意义 特别是在生物体系 如底物与蛋白质的作用 酶催化过程 遗传密码的复制 翻译 转录等以及抗体与 抗原的作用等川 1 3 3 超分子化学研究中的物理化学方法 4 5 近年来越来越多的方法用于超分子化学的研究 主要有紫外一可见吸收光谱 4 6 郴 荧光光谱 4 9 5 0 相溶解度法 5 1 5 3 圆二色弹5 4 1 核磁共振波谱 5 5 振动光谱 5 6 5 7 1 电泳法 5 8 量热法 5 9 热分析 6 0 6 1 1 电子显微技术 6 2 结合动力学 6 3 1 衍射技术 6 4 电化掣6 5 7 1 质谱 7 2 1 介电常数法和萃取技术等方法 7 3 7 1 4小分子与d n a 相互作用的研究及其分析应用 1 4 1 脱氧核糖核酸 d n a 简介 d n a 是一种相对分子质量很大的高聚物 它的基本结构单位是核苷酸 是有成 千上万的甚至几百万个单核苷酸按一定的排列顺序组成的多聚核苷酸长链 单核苷 酸是由一个磷酸分子 一个脱氧核糖和一个碱基构成 d n a 的一级结构是由数量极 其庞大的四种脱氧核糖核苷酸通过3 5 磷酸二酯键连接起来的直线形或环形多聚 体 图1 2 左 为单链d n a 构造中的一小段 d n a 的二级结构指d n a 分子的空间 结构 1 9 5 3 年w a t s o n 和c r i c k 首先提出了d n a 分子的双螺旋结构 d n a 双螺旋模 型结构的建立具有划时代的意义 它是d n a 复制与r n a 转录和反向转录的分子基 础 7 6 77 1 图l 一2 右 是d n a 双螺旋结构的空间模型及碱基配对原理 两条反向平行 的多核苷酸链围绕同一中心轴相互缠绕 嘌呤与嘧啶碱位于双螺旋的内侧 双螺旋 的外表面有两个大小不同的螺旋形凹槽 一条较宽的称大凹槽 一条较窄的称小凹 槽 大沟的宽度为1 2 n m 深度为0 8 5 r i m 小沟的宽度为o 6 n m 深度为0 7 5 n m 碱 基的堆积力使的其在生理状态下很稳定 这两个凹槽对于d n a 分子识别非常重要 d n a 的三级结构是指双螺旋链的扭曲 包括多重螺旋 分子内单链形成的环等等 一些病毒d n a 是单股螺旋 而绝大多数天然d n a 是双股螺旋 图1 3 是d n a 三级 结构模式图 1 4 2 小分子与d n a 相互作用的方式 小分子与d n a 相互作用的模式归纳起来大致可分为非共价结合 共价结合 核 剪切作用三类 其中非共价键结合又可分为表面结合 o u t s i d eb i n d i n g 沟槽结合 g r o o v eb i n d i n g 和嵌插结合 i n t e r c a l a t i o nb i n d i n g 三种方式 如图1 4 所示 o o z o h d 偶氮染料与环糊精 d n a 和蛋白质相互作用的研究及其分析应用 i e 图1 2d n a 中多核苷酸链的一个小片断 左 和w a s t o n c r i c k 双螺旋模型及其碱基配对原理 右 f i g 1 2s m a l lf r a g m e n to fn u c l e o t i d e c h a i no fd n a 1 e f t a n dw a s t o n c r i c kd o u b l eh e l i xm o d e a n db a s ep a r i n gp r i n c i p l e r i g h t o b c 图1 3d n a 三级结构模式图 a 直线型双螺旋结构 b 环形结构 c 共价闭环超螺旋形型结构 f i g 1 3t h et e r t i a r ys t r u c u r eo fd n a as t r a i g h tl i n ef o r md o u b l eh e l i x bc i r c u l a rs t r u c t u r e cc o v a l e n tc l o s e dr i n gs u p e r h e l i xs t r u c t u r e 一般认为表面结合的小分子作用于d n a 双螺旋结构的外壁 无选择性 沟槽结 合是与核酸的大沟或小沟的碱基对边缘直接发生相互作用 大分子蛋白质结合于 d n a 的大沟槽中 而大多数小分子则是在小沟槽区作用 小沟槽内是a t 富集区 小分子通过胸腺嘧啶碱基c 2 上的羰基氧或腺嘌呤碱基n 3 上的氮形成氢键与a t 6 tlfmli上p 第一章绪论 碱基结合 小沟槽结合的分子一般有几个芳香环结构单元组成 环间通过可自由旋 转的单键连接 随着单键合适的旋转 可取代小沟槽中的水分子 嵌插结合是小分 子中的平面成分嵌入核酸的碱基之间 通过小分子芳环的离域兀体系与碱基的兀体 系间的n 兀相互作用及疏水作用 这是药物分子与d n a 发生作用的最重要的形式 之一 通常稠合芳环体系都倾向于结合在g c 富集区 与非共价结合作用相比 小 分子与d n a 的共价结合的序列特异性识别能力要强得多 7 8 s 3 共价结合主要是同d n a 碱基的反应 如亲核反应 亲电反应 加成反应等 共 价结合的小分子多表现为链内交联或链间交联 与特定碱基作用形成加合物 使核 酸双链解旋且产生弯曲 ii i 作川i ij j 人洲 1 1 儿作川i i il 淡入i i i j 图1 4d n a 与小分子非共价键作用的三种方式 f i g 1 4t h et h r e eu n c o v a l e n tb i n d i n gm o d e sb e t w e e nd n a d e o x y r i b o n u c l e i ca c i d a n ds m a llm o l e c u l e 1 4 3 小分子与d n a 相互作用的研究方法 多种实验研究方法如紫外 可见吸收光谱 线二色光谱 圆二色光谱 荧光光谱 拉曼光谱 红外光谱 核磁共振波谱 质谱 电化学 微量热 序列凝胶电泳及足 印迹分析技术 粘度等方法从不同角度对小分子与核酸之间的作用进行了广泛的研 究 此外还有多种方法如平衡渗析 原子力显微镜 扫描隧道显微镜 亲和色谱 以及x 射线晶体衍射法等可用于小分子与d n a 相互作用机理的研究 对于小分子 与d n a 复杂体系的研究 必须运用各种方法和手段进行全方位 多层次的深入研究 才能得出可靠的结论 才能准确的理解其相互作用 8 0 引 翼影一 碧 f r 偶氮染料与环糊精 d n a 和蛋白质相互作用的i i j l 究及其分析应用 1 4 4 脱氧核糖核酸的定量及结构分析 7 8 8 4 8 7 1 4 4 1 免疫化学法 有些构型的d n a 经化学修饰可以诱导产生高特异性的抗体 所产生的抗体可以 用作分析核酸的免疫化学试剂 该方法尤其适用于d n a 结构及d n a 化学修饰的分 析 用于检测抗体与d n a 的复合物的方法 有凝胶免疫扩散法 沉淀法 絮凝法 络合物的电镜分析法 酶联免疫吸附分析法 放射免疫分析法和凝胶位移分析法等 1 4 4 2 色谱及电泳法 d n a 或r n a 产物的制备及分析的关键技术是分离方法 主要是色谱及电泳技 术 前者对于单链及双链d n a 的分离及从细胞溶解物碎片中分离出基因组d n a 是 非常重要的 而电泳技术与限制性内切酶技术的结合在d n a 和r n a 的结构 序列 及功能分析方面起着非常重要的作用 1 4 4 3 光谱法 在核酸研究领域内 光谱技术广泛用于其浓度的测定 还可以用于不同d n a 和 r n a 构型的研究 该方法可以分为以下三大类 1 电子光谱 包括紫外 可见吸收光谱 荧光光谱 圆二色光谱及线二色光谱 2 振动光谱 包括红外光谱 拉曼光谱及振动圆二色光谱 3 核磁共振波谱 1 4 5d n a 小分子探针的研究 在生物化学研究的相关领域 小分子探针是指那些可以探测生物大分子各种信 息的一类小分子化合物 该类化合物可以与生物大分子发生特异性的相互作用 并 能够使小分子化合物的物理化学性质 光谱性质及电化学性质等发生改变 根据这 些性质的变化可以获得生物大分子的各种信息 核酸探针的研究涉及核酸的一级 二级及碱基的结构 利用适当的探针与核酸进行各种选择性反应以探测核酸本身所 不能给出或不能灵敏给出的结构或量的信息 常用的小分子探针 按其理化性质来分 可以分为有机染料探针 吖啶和菲啶 类 菁类染料 荧光素和罗丹明类 噻嗪和恶嗪类染料 b o d i p y 类染料 金属离 子 t b 3 e u 3 及其络合物探针 r u t m p 3 2 r u d i p 3 2 r u p h e n 3 2 r u p h e n 2 p h i 3 其中 t m p p h i p h e n 和d i p 依次为3 4 7 8 四甲基一1 1 0 令1 3 氮菲 菲醌二 亚胺 l 1 0 邻二氮菲和4 7 二苯基 1 1 0 一令1 i 氮菲 7 8 8 引 近年来 人们致力于寻 找灵敏度高 选择性 稳定性好的小分子探针 第一章绪论 1 5小分子与蛋白质相互作用及其分析应用 1 5 1 蛋白质简介 蛋白质是一类重要的生物大分子 是生命的物质基础 在生物体内占有特殊的 地位 蛋白质分子是由氨基酸首尾相连而成的共价多肽链 蛋白质的构象由一级 二级 三级 四级结构组成其空间结构 图1 5 给出了蛋白质分子的构象示意图 蛋 白质作为有机体的结构成分 具有调节有机体新陈代谢 调解或控制细胞的生长 分化及遗传信息的表达的功能 此外还具有接受