（微生物学专业论文）231菌种烃代谢产物分析与高粘油降粘机理的初步探讨.pdf

摘要 2 3 1 菌种是从高粘原油中分离到的 且对高粘油有明显降 粘效果 并经高 粘油井现场应用试验有显著增油效果的优良菌种 2 3 1菌种以烃为碳源生长代谢 其代谢产物分析鉴定表明 产生的短链脂 肪酸主要是乙酸 产酸量0 0 1 5 m o l 几 产生的气体主要是c 0 2 和c h a 产气量为 2 产生的表面活性剂是一种胞外离子型的糖脂 糖的部分为鼠李糖 脂肪酸 部分基本结构单位为十碳癸酸 糖脂含量为1 1 2 5 g l 临介束胶浓度 c m c值 为2 0 0 m g l 乳化性能良 好 2 3 1菌种如上多种代谢产物综合作用十高粉原油 是使高粘原油降粘 增 加其流动性 矿场试验有显著增油效果的主要原因 关健词 2 3 1 菌种 短链脂肪酸 降粘 糖脂 ab s t r a c t 2 3 1 w h i c h i s i s o l a t e d f r o m h i g h a s p h a lt c o n t e n t o i l c a n d e c r e a s e t h e v i s c o s i t y o f t h e o i l s t r i k i n g ly i t h a s i m p r o v e d t h e p r o d u c t o f o i l o n f i e l d a p p l i c a t i o n s s u c c e s s f u l l y 2 3 1 c a n g r o w a n d m e t a b o l i z e t h r o u g h c a r b o n r e s o u r c e s o f h y d r o c a r b o n t h e p r o d u c t s a n a l y s i s i n d i c a t e s t h e m a i n s h o r t c h a i n f a t t y a c i d i s a c e t a t e t h e a m o u n t o f a c e t a t e i s 0 0 1 5 m o 1 l t h e o u t p u t o f g a s w h i c h t h e m a i n c o m p o s i t i o n i s c 0 2 a n d c h 4 i s a b o u t 2 t h e s u r f a c t a n t i s g l y c o l i p i d a k i n d o f a n i o n s urf a c t a n t o u t s i d e t h e c e l l t h e g l y c o l ip i d w h i c h c o n t e n t i s 1 1 2 5 g l i s c o m p o s e d o f r h a m n o s e a n d t e n c a r b o n f a t t y a c i d i t s c r i t i c a l m i c e l l e c o n c e n t r a t i o n i s 2 0 0 m g l i t h a s t h e g o o d a b i l i ty t o e m u s i 勿t h e o i l t h e m a i n r e a s o n o f i m p r o v i n g t h e p r o d u c t o f o i l o n f i e l d a p p l i c a t i o n i s t h e c o m p r e h e n s i v e e f f e c t o f t h e m e t a b o l i t e k e y w o r d s 2 3 1 t h e h i g h v i s c o s i t y o i l t h e d e c r e a s e o f v i s c o s i t y s h o rt c h a i n f a t t y a c i d t h e g a s g ly c o l i p i d 前 一 一确 厂 一 采油微生物概述 微生物提高原油采收率 me o r 是石油微生物学科中发展最快 最活跃的 一个分支 微生物采油技术以显著的经济效益和社会效益为石油开采界所关注 该技术被三次采油专家称之为继传统的热力驱 化学驱 气体驱之后又一新的提 高原油采收率技术 在采油微生物研究初期 主要侧重于菌种的筛选 菌种的性能评价 室内 模拟实验 矿场应用试验与提高原油采收率机理的研究 近些年来 微生物采油技术在广泛应用的基础上 其深入研究主要表现在 两个方面 一是微生物采油技术与矿场工程学的深入研究 二是石油微生物菌种 的生物学特性的基础研究 为给微生物采油技术提供性能优良的菌种 采油微生物菌种的基础研究空 前活跃 主要有如下五个方面 一 采油微生物生理学研究 主要研究采油微生物以 烃为碳源 模拟贮油层极端环境和条件 在培养过 程中生长 产短链有机酸 产气 产生物表面活性物质 产有机溶剂 产生物聚 合物的 情况 z 3 1 经代谢产物分析 确定 代谢产物与提高原油采收率的 相关 性 从而阐明微生物采油作用机理 二 石油微生物遗传学研究 烃降解微生物遗传学是研究的重点 山于石油微生物对烃降解存在 共代 谢 现象 所以 对烃降解的遗传系统比 较复杂 对于短链烷烃分解代谢遗传学的 了解 首先来自 腐臭假单胞菌的系统研究工作 出色地证明了一整套遗传学座位 的存在 这些座位位于o c t质粒与染色体上 不动杆菌长链烷烃分解代谢的遗 传信息只位于染色体上 由于烃降解基因常常携带在质粒上 且成簇聚集 所以 烃降 解质粒的分子生物学研究仍是目 前研究的重点 烃降解基因工程菌株构建仍 是研究者们的努力方向 构建的基因工程菌株或用于微生物采油 或用于烃污染 的环境保护 三 嗜热菌 耐温菌的基础研究 深部贮油层 8 0 以 上的高温环境 使采油微生物菌种转向 嗜热菌和高温耐 温菌 3 8 1 其应用研究 主要 研究 嗜热菌和高温耐 温菌的 筛选方法 特殊的 培养 方法和保存方法 就基础研究 仍集中在嗜热酶 耐热酶以及耐热遗传物质耐热 机理的研究 主要探讨这些耐热高分子的一级结构 空间构型和耐热的相关性 以及能使这些生物大分子耐热的保护性装置 四 石油微生物酶的研究 石油微生物之所以能利用结构复杂的烃类为碳源 是因为石油微生物有两 个最基本的生物学特性 一是能产生表面活性物质 使菌体细胞与烃类分子充分 接触 二是产生烃降解酶 将复杂的不能进入细胞的烃类分子降解为简单的能进 入细胞的烃类小分子 目前的研究表明 石油微生和的降解高蜡油的能力远高于 降解高胶质 沥青质原油的能力 所以微生物采油技术成功的范例全是高蜡油 而高粘油甚少 其原因可能是降解酶难以作用于高粘油 五 石油微生物的分类鉴定 采油微生物多是极端环境微生物 大部分归属于真细菌 而极端嗜热菌等 即为古细菌 古细菌在细胞膜的 脂类 细胞壁成分 核糖体的1 6 s r r n a t r n a 成分以 及生态环境皆不同于真细菌 因此 采油微生物的分类鉴定及分子生物学 研究就要引入 古细菌 a r c h a e b a c t e r i a 这一重要概念 古细菌的研究方法与 真细菌不同 二 采油微生物研究进展 采油微生物研究主要在生理学 遗传学 高粘油采油机理等方面取得一些 研究进展 一 采油微生物生理学研究进展 生理学研究进展主要集中在两方面 贮油层条件如温度 p h 矿化度 产物的影响 重金属 一是代谢产物的分析研究 二是模拟 压力等环境条件对菌体生长及代谢 采油微生物代谢产物的分析研究 主要是指在模拟贮油层条件下产酸 产 气 产表面活性物质的研究 这些研究皆与阐述微生物采油机理密切相关 产酸主要是指产低分子量的脂肪酸 采油微生物产生低分子量的有机酸多 有报道 9 1 主要是乙酸 丙酸 丁酸及某些二元t x 酸 低分子量有机酸的测定 方 法国内 外已 有不少报导 但针对石油微生物小分子量有机酸的分析报导则较少 采油微生物产生的短链有机酸 可有效地溶解贮油岩层孔隙中沉积的碳酸 盐 可有效地腐蚀石英与碳酸盐表面 从而增大孔隙度与有效地渗透率 增加油 的流动性 提高原油采收率 同时酸与碳酸盐 发生化学反 应生成c o 2 c 0 2 溶于 油而降低油的粘度 采油 微生物产生的气体主要是二氧化碳 甲 烷 氢气等气体 1 0 11 7 产气的 气相色谱分析多有报道 其采油机理主要是恢复贮油层压力 气体高压下溶于原 油使其膨胀 降低粘度 增加油的流动性 石油微生物产生表面活性物质是共有的生物学特性 所以石油微生物是表 面活性物质天然的基因库 表面活性物质可形成强烈的油一水乳化 所以普遍认 为采油微生物产生的胞外表面活性物质是降低原油粘度 提高其流动性 提高原 油采收率的主要因素 因此 表面活性物质是采油微生物代谢产物中主要的研究 对象 其研究论文颇多 石油微生物产生的生物表面活性物质 是一种集亲水基团和憎水基团于一 身的两亲化合物 憎水基团一般为脂肪酞基链 而极性亲水基则有多种形式 如 糖脂中的糖基 磷脂中的含磷酸部分或氨基酸的按基部分 所以石油微生物产生 的表面活性物质以糖脂 磷脂 脂肤等三种分子结构类型居多 石油微生物以各种基质 特别是以烃为基质时大量产生表面活性物质 烃 诱导石油微生物产表面活性剂有两方面原因 一是当表面活性物质为胞外产物 时 利于烃类物质乳化 二是当表面活性物质为胞壁结合型时 利于烃类透过细 胞 膜 外 的 周 质 空 间 2 3 7 糖脂是生物表面活性物质中最重要的一类 产生糖脂的细菌类群主要包括 假单胞菌 棒杆菌 诺卡氏菌 分支杆菌 枯草芽抱杆菌 不动杆菌等 由于糖 基的种类和数量不同 脂肪酸的种类和数量不同 所以糖脂表面活性物质数量最 大 品种最多 主要的糖脂类表面活性物质是二糖基甘油二脂 鼠李搪脂和海藻 糖二分支菌酸脂 许多g 一 细菌 特别是假单胞菌皆产生胞外型鼠李糖脂 假单胞菌产生的鼠 李糖脂研究较深入的是铜绿假单胞菌 2 2 7 不同的培养条件下 不同的 基质中 产生结构不同的鼠 李糖脂 不同的 微生物虽然产生不同的表面活性物质 但表面活性物质的生物合成 有相同的调控规律 烃类物质诱导表面活性物质合成 而糖类物质有时则抑制其 合成 例如 铜绿假单胞菌 p s e u d o m o n a s a e r u g i n o s a 以 正构烷烃为 碳源时 合成鼠李糖脂 以葡萄糖或乙醇为碳源时则不合成鼠李糖脂 假丝酵母 c a n d i d a s p 只能以 正构 烷烃或甘油 三酷为 碳源产生 甘露 糖赤鲜 糖醇脂 而 碳水化合 物则 抑制其合成 在生物表面活性物质合成中 葡萄搪和其初级代谢产物可抑制其合 成 例如 在铜绿假单胞菌以正构烷烃为碳源产生鼠李糖脂时 在介质中加入葡 萄糖 醋酸盐 玻拍酸盐或柠檬酸盐时 鼠 李糖脂产率大幅度下降 氮源 温度 生长速率也调节生物表面活性物质的生物合成 从培养物中分离糖脂时 先要确定其是胞外产物型还是胞壁结合型 离子 型糖脂一般是胞外产物 非离子型糖脂主要是胞壁结合型 生物表面活性物质有多种提取方法 采用什么样的提取方法 要视生物表 面活性剂的性质 是水溶性还是非水溶性 是阴离子型还是非离子型 是胞壁结 合型还是胞外产物型而定 不同类型产物皆有相应的分离提取方法 而没有共同 的分离方法 除经典的提取方法外 最近还发展有随程提取方法 这是一种连续 的提取方法 生物表面活性剂的结构分析方法已日 趋成熟 8 为了 鉴定糖脂的结构 在酷 键和0 一 配糖键的鉴定中 可用t l c以及糖 脂特异性鉴定试剂对其鉴定 然后 控制酸性或碱性条件下水解 分别鉴定糖基和脂肪酸结构 以混和正构烷烃为碳源培养石油微生物时 会导致糖脂产物中出现混和脂 肪酸残基 这将使糖脂中脂肪酸残基的结构分析难度增大 除糖脂外 含氨基酸 类脂的鉴定以及脂肤的鉴定方法也日 趋成熟 表面活性物质的评价方法己 有很多 4 3 1 4 1 但常用的方法是表面能力的测 定 c m c 值是通用的 表 面活性效能 尺 度 c m c 值越大 则 表面活 性效能 越高 乳化性能测定可通过乳化时间估算 这也是衡量表面活性效能的一种方法 总之 采油微生物生理学方面的 研究以产酸 产气 产表面活性物质为主 要研究内容 并以 此为依据阐述微生物采油机理 关于胞外酶特别是石油裂介酶 用于稠油开采偶有报道 二 石油微生物遗传学研究 进展 石油微生物遗传学研究进展主要是建立了细菌以烷烃 蔡和水杨酸 甲苯 和二甲 苯三类典型烃类物质生长的遗传学模型 1 9 7 3 年 a m c h a k r a b a r ty 等 人研究 腐臭假单胞菌 p s e u d m o n a s p u t i d a 以 辛烷 o c t 为底物生长时发现 在酶的作用下辛烷被氧化成相应的醇 醛和脂 肪酸 脂肪酸经0 一 氧化分解为 a c t ty l c o a或p r o p i o n y l c o a 经多方面实验根 据 a m c h a k r a b a r ty等人指出 腐臭 假单胞菌以 辛烷为 底物生长的 基因 携戴 在 o c t 质 粒上 1 9 7 6 年 s i n g e 和f i n n e r ty发 现不动 杆菌 a c i n e t o b a c t e r 以 十六 烷为底物生长的基因在染色体上 用腐臭假单胞菌作的大量研究证明 短链烷烃与解代谢的遗传基因位于 o c t质粒和染色体上 与此相反 用不动杆菌和其它微生物所作的研究证明 长链烷烃分解代谢基因只存在于细菌染色体上 1 9 7 9 年 f e n n e w a l d 等绘出了 腐 臭假单胞菌 p p g 6菌株短链烷烃氧化所需基因 位点的遗传学模型 如下图 所示 这是至今所了解的烃降解最复杂的遗传系统 烷烃 诱导物 朴 一 一 一一 一 一 一 一 一 工 一 今 o c t j i1 p ba a i k b a i k a a l k e a l k d a l k ra l k c 烷烃一一一一份醇 分醛一 一分脂肪酸 她 体 一一为 仁 一一刀一 一弃 一一 辛 2 一 a l c a a i c b a l d a a l d b o l e 研究证明 位于质粒上的解烃基因常聚集成簇 形成操纵子型控制单位 多数受正作用因子调节 已经证明这些基因簇多数具有广泛的同源性 对烃降解 途径的遗传组织和调节机理的了解 加速了对解烃菌遗传工程的研究和应用 有关蔡代谢的生物化学和酶学知识非常丰富 在此基础上 以蔡为代表的 双环芳香烃降解的遗传学研究取得重大进展 1 9 7 2 年 a m c h a k r a b a rt y 首先证 实了腐臭假单胞菌r i 菌株以水杨酸酷为底物生长所需的遗传信息由称为s a l 的 质粒所携带 1 9 7 3 年 d u n n 和g u n s a l u s 研究了 腐臭假单胞菌p p g 7 对蔡的利用 结果有力地表明蔡和水杨酸酷通过可诱导的间位裂解途径进行降解所需的全部 遗传信息由称为 n a h 的质粒所携载 而邻位途径降解活性似乎是由染色体编 码 1 9 8 2 年 y e n 和g u n s a l u s 确定7 腐臭假单 胞菌即g 7 菌株中8 3 k b 的n a h 7 质粒上的 n a h 座位 如下图所示 蔡操纵子 比1操纵子 水杨酸醋操纵子 n a h 2操纵子 水杨酸脂 酚劝康 t公1奋蟋上粘 a i顶 二当 bl 2 1 基 c 3 酸半醛 2 4 基康酸酷 2 4 基酮酸醋 d 3 毒 2 草巴豆酸酷 e d 2 酮基 4生 戊 烯 酸 f 0 水耘 f o 毒 2 一 酮基 4 轻基戊烷酸酷 m 0 毒 丙酮酸酣 乙醛 用腐臭假单胞菌所作的甲苯的降解遗传学表明 称为t o l的代谢质粒决定 了间位途径活性以及间一甲苯甲酸酷和对一甲 基甲 酸酌向甲 基儿苯酚转化所需 的甲苯甲酸酷加氧酶 该菌有两套苯甲酸酷氧化系统 一个由t o l质粒决定 一个由细菌染色体决定 综上所述 烃降解遗传系统中 烃降解质粒分子生物学研究仍是热点 对 烃降解途径的遗传结构和调节机理的了解 加速了对解烃菌遗传工程的研究和应 用 1 9 7 5 年 f r i e l l o 等用质粒转化的方法构建了一株同时含c a m o c t t o l 和n a h四种降解性质粒的 超级细菌 能快速降解油污染物中的烃类物质 进入八十年代以来 人们对某些烃降解基因进行了克隆和表达研究 1 9 8 1 年 i n o u y e 等先后把t o l质粒中的x y l b 苯z 醇脱氢酶 x y l e 儿苯酚2 3 一 二氧酶 基因和x y i d e f g操纵系及其调节基因x y i s 在e c o l i 质粒载体上克 隆并获表达 1 9 8 3 年 s h e l l 使蔡质粒n a h 7 中的n a h l 操纵子和n a h 2 操纵子的 一部分与质粒连接起来 并获表达 三 高粘油采油机理的研究现状 1 9 9 1 年 美国的 原油和气体杂志 中指出 目前大部分me o r现场试验 皆是在含蜡量高的轻质油中进行 而胶质 沥青质含量高的高粘油微生物采油尚 缺乏足够的资料 显然 原油粘度越高 通过微生物生命活动降 低其粘度 增加 其流动性也越困难 近两年来 高粘油m e o r现场试验虽有成功的 报导 但廖廖无几 微生物 对高粘油降粘作用机理有如下推测 一是微生物把高粘油中的沥青烯和树脂酸高 分子降 解为低分子化合物 降低了 高粘油的 平均分子量 二是以 粘油为碳源的 微 生物产生表面活性物质 将高粘油乳化成水包油的乳状液 降低高粘油的粘度 一般生物表面活性剂可使高粘油降低粘度4 0 三是微生物产生的c 0 2 等气体 使原油特别是高粘油粘度降低 产油量增加 目 前 高粘油微生物采油技术报导极少 高胶质 沥青质含量也给高粘油 的 微生物开采带来不少困 难 因此 筛选高粘油优良 菌种 进行高粘油 m e o r 矿场试验 探讨高粘油微生物采油机理 是目 前世界上急需解决的一项技术难 题 三 选题的科学依据及重要意义 我国辽河油田是世界著名的高粘油田 原油最高粘度可高达 1 0万 m p a s 胶质 沥青质含量6 0 以上 给实施微生物采油技术带来极大困难 1 9 9 3年 美国派克公司来辽河油田推广应用采油微生物产品 结果 矿场 应用试验无一成功 实践证明 高粘油微生物采油是相当困难的 对菌种的生物 学特性有极高的要求 1 9 9 6年 我们和辽河油m协作 开展了高粘油 me o r的科技攻关 从 5 0 多 个菌种中选育到2 3 1 菌种 该 菌种7 0 0c 高温下使粘度为2 6 0 0 m p a 的4 4 油 粘度降低 3 0 左右 三口油井的现场应用试验 两个月累计增产原油 7 0 6 t 其 中 1 6 1 4 注入微生物前采油枯竭 产液量和产油量为0 首次注入微生物和 营养液后 产液量最高为1 5 m 3 d 产油量由 增至2 8 t d 先后三次 注入微生物 五个月累计增油5 7 9 t 投入与产出比超过1 3 其增油水平居世界先进水平 为 高粘油微生物采油技术提供了成功的范例 2 3 1 菌种是有重大开发应用价值的菌种 应作系统研究 2 3 1 为什么能显 著降低高粘油粘度 为什么下井应用有如此好的增油效果 为了科学地回答这 些问题 我们选择了 2 3 1 菌种代谢产物分析及对高粘油降粘作用机理的探讨 这一研究课题 争取对高粘油降粘机理研究作出我们的贡献 石油微生物实验室的发展目 标是建立全国的菌种库 现分离筛选到 3 0 0多 个菌种 其中己在矿场实际应用的约2 0 种 菌种库要求对每一实际应用的菌种 要进行系统研究 要阐明其主要的生物学特性 2 3 1作为菌种库中的第一个菌 种 其研究有着示范作用 尤其要摸索一些研究方法 为其它菌种的研究提供经 验教训 所以 该选题有着重大的科学意义和现实意义 材料与方法 材料 一 菌种 2 3 及初筛各菌种均由本实验室提供 二 原油 辽河油田提供 定为 4 4 油 p 2 0 9 c m 3 0 9 6 v 5 0 m p a s 2 6 0 0 凝固点 2 蜡含量 7 5 胶质沥青质含量 3 6 8 三 培养基 1 基础培养基 k h 2 p 0 4 0 3 4 n a 2 h p 0 4 0 1 5 n h 4 2 s o 4 0 4 mg s 0 4 0 0 7 酵母粉0 0 0 1 p h 7 5 2 二 肉汤培养基 蛋白陈1 牛肉膏 5 na cl 0 5 p h 7 5 3 固体培养基 肉汤十1 5 琼脂粉 4 软琼脂培养基 肉汤培养基 石 琼脂粉 5 液蜡培养基 基础培养基 2 液体石蜡 6 原油培养基 基础培养基 2 原油 四 试剂 i类脂展层剂 石油醚 丁酮 乙酸9 5 4 1 2 类脂显色剂1 3 1 铝酸钱一高氯酸显色剂 a 3 g 钥酸钱溶于2 5 m l 水中 b 1 nhc1 c 6 0 高氯酸 a 3 0 m l b 1 5 m l c 混合 3 糖脂显色剂 1 葱酮 硫酸或5 0 硫酸 4 葱酮硫酸比色法葱酮试剂 溶解2 g 葱酮于浓硫酸 a r 9 5 5 中 当日 配制使用 5 单糖展开剂 正丁醇 醋酸 水 4 1 2 6 单糖显色剂葱酮试剂 溶解0 3 g 葱酮于l o m l 冰醋酸中 加入2 0 m l 9 6 乙醇 3 m l 浓磷酸 和 l ml 水 五 药品 薄层层析硅胶 g 6 0 型 中国青岛海洋化工集团 梭甲基纤维素钠 上海试剂一厂 甲酸 乙酸 丙酸 丁酸 戊酸 己酸 a r 氯仿 a r j 甲醇 a r 天津化学试剂一厂 葱酮 a r 上海试剂一厂 其它药品均为分析纯 六 主要实验仪器设备 界面张力仪 承德市材料试验机厂 一 旋转薄膜蒸发器z f q 一i o l 天津玻璃仪器厂 7 2 1 可见分光光度计 上海第三分析仪器厂 7 5 2 紫外光栅分光光度计 上海第三分析仪器厂 n d j 7 9 型旋转式粘度计 同济大学机电厂 笔式酸度计 h a n n a公司 g c 7 a气相色谱仪 日本岛津 气相色谱数据处理器c r i b 岛津 磁力搅拌器 常州国华电器设备有限公司 d d b 3 0 0 多通道电子蠕动泵 浙江象山电子仪器厂 红外 b io r a d f t s 6 0 0 0 u m a 5 0 0 显微镜 高效液相仪 wa t e r s 5 1 0 泵 wa t e r s 4 1 0 示差折光检测器 核 磁 共 振 v a r i a n 洲1丁 y p lu s 4 0 0 s p 2 3 0 5 全型色谱仪 北京分析仪器厂 微量注射器 l u l 上海医用激光仪器厂 玻璃管硅胶层折柱 1 8 c m x 2 1 c m 自备 水浴摇床 江苏太仓实验仪器厂 冷冻干燥机 美国 方法 一 研究路线 i ih 水样 丰 初 筛 5 0多个菌种 丰 对 4 4 油 分 散 效 果 和 高 a 下 降 枯 效 果 2 3 1 菌种 培养液 变化分析 定性分析 1 性评价 气相色谱 月 旨 肪酸分析 气相色谱 糖组分分析 薄层 高效 液相 二 研究方法 一 菌种初筛及性能评价 基础培养基 2 原油 5 接种量 3 7 摇床培养3 天 观察结果 原油分 散细腻 不挂壁为佳 二 2 3 1 对高粘油降粘效果 2 5 0 m 1 锥 形 瓶 加0 5 g n h 4 c 1 0 5 g k 2 h p 0 4 5 0 m 1 4 4 油 灭菌 接 种5 0 m 1 菌液分别 在5 5 0c 6 5 0c 7 0 不同温度下 水浴摇床培养7 天 原油脱水 测 粘度 以空白 作对照 计算降粘率 三 短链有机酸分析13 3 3 5 1 i 定性分析 取发酵液3 0 0 m l 置于蒸馏烧瓶中 用 l o m l 磷酸酸化 在接收瓶中放入i o m l 燕馏水并使冷凝管浸入其中 蒸馏 当蒸馏瓶中剩下少量溶液时 稍冷 加入 2 0 m l 蒸馏水继续蒸馏 馏出 液用5 0 n a o h中 和至p h 8 然后 在8 0 恒温水 浴锅中 用旋转蒸发器浓缩至5 m l 或经冷冻干燥后 将试样转入l o m l 容量瓶中 用盐酸 酸 化至p h 蕊 3 定容 取0 1 4 1 作气相色谱分析 以 小 分子 有机酸甲 酸 乙酸 丙酸 丁酸 戊酸 己酸为标准品 层析条件为 有机酸交联石英毛细管柱2 5 m x 2 5 m m 柱温1 1 0 0c 检测及汽化室温度 2 0 0 0c 尾吹6 0 m l m i n 线速1 2 c m s e c h z 6 0 ml mi n ai r 4 0 0 ml mi n 2 产量分析 以n a o h做标准液 以百里酚兰做指示剂 对样品 进行酸碱 滴定 测定产酸量 四 产气分析 用5 0 0 m l 输液瓶 液蜡培养基接0 3 酵母粉 2 0 接种量 内壁涂油 3 7 静置培养 倒置于同 样培养环境的广口 容器中 观察产气量 气相色谱分析气 体组成成份 色谱条件 t d x 6 0 8 0 11 柱长2 m x 4 m m 柱温5 0 0c 检测及汽化室温度 1 0 0 c 热导t c d检测器 桥流1 5 0 m a 五 表面活性剂分析 1 产生时间的测定 将种子液转接于液蜡培养基中 5 接种 3 7 0c 振荡培养 分别于 1 2 3 4 5 天取样 即时测表面张力 发酵液离心 称菌体干重 2 产物提取 及纯化 1 8 2 5 1 将发酵液用1 0 h 2 s o 4 调p h至6 0 加入2 倍体积的 氯仿 甲 醇 2 1 v n 混和液磁力搅拌3 0 m i n 萃取 合并有机相 5 5 用旋转薄膜蒸发仪减压蒸馏去 溶剂 得粗产物 将粗产物溶于一定体积 约5 m 1 氯仿中 过硅胶柱 先后用 氯仿 氯仿 甲 醇 2 1 洗脱 收集并蒸去各种溶剂 得纯品 3 产物的定性分析 3 1糖脂的定性分析 3 1 1 产物的薄层分析 以硅胶一狡甲基纤维素钠铺平板 分别以粗品和纯品为样品 用类脂展开 剂展层后 分别用类脂显色剂 铝酸钱一高氯酸 及糖脂显色剂 1 葱酮一硫 酸液 显色 类脂显色剂在 1 0 5 加热2 0 分钟 糖脂显色剂 1 1 0 加热5 分钟 显色后计算r f 值 3 1 2红外光谱分析 3 1 3核磁共振分析 3 2脂肪酸定性分析 3 2 3 4 1 将糖脂纯品加 1 m o l l n a o h 一 乙醇液 置9 0 水浴中1 小时 加水并酸化后 用乙醚萃取 醚相为脂肪酸样品 水相为糖样品 脂肪酸样品干燥后用5 h c l c h 3 0 h甲 酷化 1 1 0 下1 8 小时 蒸去溶剂后 溶于己 烷 进行气相色谱分析 色谱条件 d e g s柱0 2 5 m m x 2 5 m 柱温 1 8 0 0c 汽化检测室温度 2 5 0 c f i d氢火焰离子化检测器 尾吹 6 0 m l mi n 线速 1 2 c m s e e 进样量 0 2 11 1 3 3糖的定性分析 水相中的糖样品进行薄层检测和高效液相色谱分析 薄层展开剂为正丁 醇 醋酸 水 4 1 2 以单糖显色剂葱酮试剂显色 1 1 0 加热 5 6分钟 高 效液相色谱样品径5 u m微孔滤膜过滤 色谱条件为 甲 醇 水 0 6 0 4 流 速 i m i 分 4 产物定量分析 经硅胶柱纯化的纯品经真空干燥后称重计算收率 有 效 成 份 经 葱 酮比 色 法 定 量 测 定 糖 脂 含 量 16 2 5 标 准曲 线一 取0 1 叭 的 葡聚糖溶液0 0 5 0 1 0 0 2 0 0 3 0 0 4 0 0 6 0 0 8 0 m l 用蒸馏水补至 l o o m i 分别加入4 o o m l 葱酮试剂 迅速浸于冰水中 冷却 各管加完后 一 起浸于沸水 中 1 0 分钟取出 自来水冷却 室温 1 0分钟 6 2 0 n m比色 以蒸馏水为空白 得标准曲线 样品含量测定一一取纯样品溶液 i o o m l 加入蕙酮试剂 同法操作 比色 5 表面活性剂性能评价 5 1表面张力的测定 5 2 c m c 值测定 2 0 2 6 1 以不同浓度糖脂的表面张力作图 5 3糖脂乳化性能 测定 9 1 7 1 将纯品溶于o 1 m n a h c 0 3 配成0 1 的浓度 取l o m l 装入试管 加入煤油 i m l 经3 0 秒钟搅拌 定时观察乳化液水相 油相和乳化相的体积变化 六 原油组分分析 2 9 3 0 1 经2 3 1 作用后的残油进行原油组分分析 层析条件为 层析柱 s e 甲基硅橡胶 交联石英毛细柱 3 0 m x 2 5 m m 检测器 氢离子化检测器 f i d 柱温 1 1 0 c 恒温 1 6 m in 以4 c m i n 升至3 2 0 c 恒温 1 6 m i n 气化室和检测室温度 3 3 0 1c 尾吹 6 0 m l m i n 载气 氮气 线速 1 2 c m s e c 燃气 氢气 流量3 0 5 0 m l m i n 助燃气 空气 流量3 0 0 5 0 0 m l m i n 七 菌种其它性能评价 1 菌浓测定 基础培养基 2 液蜡 5 接种量 3 7 培养 3天做种子液 4个稀释度为 1 0 5 1 0 6 1 0 7 1 0 8 取1 0 0 11 1 以 软 琼脂 铺上层 3 7 0c 培 养 记 录菌落个数 2 初 始p h 影 r pl 2 8 1 培养基初始p h分别调为4 1 0 5 接种于液蜡培养基 3 7 0c 振荡培养3 天 测表面张力 稀释 2 0 倍 测 o d 6 0 0 3 矿 化 度 影 响 2 7 1 5 接种于不同浓度n a c l 培养基中 0 5 1 o 2 3 4 5 6 7 8 9 1 0 3 7 0c 振荡培养3 天 测表面张力 稀释2 0 倍 测o d 6 0 0 0 4 不同氮源中的生长情况 在培养基中分别以n a n 0 3 n h 2 2 c o n h 4 c i n h 4 2 s o 4 n h 4 2 h p 0 4 作氮源 2 正烷烃 p h 7 5 3 7 0c 振荡培养3 天 测表面张力 稀释2 0 倍 测 od6 0 0 结果与讨论 一 2 3 1 菌种筛选 降粘效果与矿场应用结果 1 菌种筛选程序 广泛采样 高粘油 高粘油井地下水 炼油厂 污水处理厂等 一富集培 养 定向驯化 热处理 1 0天 复壮培养一性能考察 综合评价 菌液产品 生产 根据如上菌种筛选程序 共获得5 0 多个菌种 经3 7 对4 4 高粘油分散实 验结果 5 5 c 6 5 c 7 0 c 高温下对4 4 高粘油的降粘实验结果 确定2 3 1 菌种 为作用于4 4 高粘油的最佳菌种 2降粘效果 对原油的降粘率是菌种性能评价的最关键指标 2 3 1 在不同高温下对 4 4 高粘油的降粘率见表一 表一 2 3 1 不同高温下对4 4 油的降粘结果 44 t 1 1j04i4 1 卜 七 飞不 卜 1 丫口 产卜 只一气二气 日自气 卜 了 卜 1 叼 i tht 八d 4 确已 以 目 34 勺 t 卜 月 4 1卜 1 试 j确 二 升乙 1 4 子 一 a w 7 这 7 又 飞1 汗96444 二 色 k 11 k1l1 k i a 写4 低分子有机酸标准色谱图 1 7 i ki 1 4 or 乙酸 a 10 士吕沛 三 ii r 1二 诊 夏 了f 一 1 4 竺i i 片 f t o i 轰 p l 1 g 7 嗯址泊6 9 奋 笠 曰卜 污拼遭 门 1 乙酸 inf 州 七t t 二 甲趁 一 f41 l f 宝 了 1 h1 4 i川f 厄 忿 渔 1 a 1 4二岸 拼h r 曰f 日i二 4v 二 二 二3 7 封曰 图b 图3 发酵液中短链有机酸色谱图 a 3 7 0c 原油培养基b 5 5 原油培养基 1 9 山图2 及图3 可见 发酵液中有乙酸存在 2 产酸定量分析结果 经酸碱滴定 产酸量为0 0 1 5 m o l l 三 产气分析结果 2 0 接种量 3 7 0c 静置培养以后 在 5 0 0 m l 反应液体积中 产气量大约为 l o m l 即产气量大约为2 0 气相色a分析见图4 图5 e f t h 了气l t 4 屯2 1 4 t 7 6 4 二氧化碳 st0f 图 a 三t 门从 t气0 2 4 1 2矛 5 2 皂 气 丘 甲 烷 图 b 图4 气体分析色相色谱标准图 a 二氧化碳标准色谱图b 甲烷标准色谱图 闷 g 丁只 q 4 1 气 4 气 长5 甲图 交 一一 一 扛心 a 一一二 氧化碳 厂 李 t i t 认 沈 一ji挂 几 r以 i 7 4 己 飞 a 日p 4 f厂1 日f i nt 5 7 乃r r 7 只7 72s 7飞少q q 经1别日勃 i 一 hi 1 x 1 q 夕口3q 1 4 目 介山1刁 2 3 1 产气分析色谱图 由图4 及图5 可见 2 3 1 所产气体种类有二种 c 0 2 和c h 4 气体 四 表面活性剂分析结果 1表面活性剂产生时间测定结果 表面活性剂产生时间测定结果见图6 0 一月卜一 门卜 一 表而张力 菌体 干 t 急 阁斗耸忽 名 5 n nc 2 010 八曰八曰on曰n们n曰n nll八目 r叮 匕一od 八乃门 1 写之已 只米旧粥 1 2 3 4 5 生长天数 天 图6 表面活性剂产生时间 由核磁共振谱图 3定量分析 经纯化后的样品 蕙酮曲线如图1 6 0 存在下列基团 c h 3 c h 2 一 及糖环上的c h 3 真空干燥后糖脂收率约为1 2 g l jll 0闪9自0 0 健0 0 1 0 0 2 0 0 3 币 0 4 0 0 5 一一 j一 一一 一 上一 一 一 0 0 6 0 0 70 0 8 0 0 9 浓度 9 几 图1 6 蕙酮曲线 由 葱酮曲 线查出 糖脂含量在 0 4 7 g l 乘以 稀释倍数 2 5 得糖脂有效含量 为1 1 2 5 g l o 4表面活性剂性能评价 4 1表面张力测定结果 以不同 温度 不同培养基培养的表面张力数据如表三所示 表三低温 高温下不同培养墓表面张力 m n m 测定结果 露一 逻 矍 3 7 c 5 5 c 对照 6 9 2 7 0 1 液蜡培养基 n a n 0 3 氮源 3 9 6 5 1 4 原油培养基 4 2 1 6 2 0 由表三可见 表面张力较对照有明显下降 4 2 c mc值测定结果 不同浓度的纯品的表面张力测定结果如图 1 7 5 0 1 0 0 1 5 0 2 0 0 2 5 0 3 0 0 3 5 0 浓 度 m g l 尸 1 11 一一ji卜icu 八曰二刁八曰尸0八曰弓ot乃0 行 卜 匕二dsd 4几jqn 只米旧脚 图 1 7 不同浓度摘脂的表面张力 由图 1 7可见 最低表面张力为 3 9 m n m 临界束胶浓度 c m c 值为 2 0 0 m g 几 4 3乳化性能分析结果 0 1 的糖脂溶液与化学合成乳化剂t w e e n 进行对比 其结果如图 1 8 所示 0 1 鼠李糖 相 一日 乳化相 乎攀刚 日 势 rlf fill l m i ni oj工材曰一了 匕sj任门口八乙 0 1 234567891 0 mi n a 图1 8 糖脂和 a 0 1 糖脂乳化性能分析b 0 b 孚 l 化性能比较 1 t w e e n 2 0 t l 化性能分析 由图1 8 可见 该糖脂乳化性能较稳定 且优于化学乳化剂t w e e n 2 0 a 五 原油组分分析 原油与测定降粘效果显著的残油进行气相色谱分析 结果如图1 9 图2 0 所 不 ca gaofeng1 9 6 06 01 01 6 ch a nn e l a 一 5 o o n一 co2溯 0 门口3 0 0 0 巧 一 0255 0 m i 一 图 1 9 原油组分的气相色谱图 2 8 c gao feng 98 0601 017 cha nn el a 明 l 001 胜1卜 1 0 20 3 0 4 0 5 0 6 0 mi nu t e s so 90 1 7o 图2 0 原油经2 3 1 作用后残油的气相色谱图 2 9 气相色谱结果分析见表四 表四 2 3 作用前后原油组分变化 c o p rc s p h c1 c z z ca c9 主矽峰 主碳峰 出峰时 间 分 对照8 3 5 5 6 0 9 0 1 3 7 8 0 0 1 7 2 0 6 1 1 1 9 1 0 0 9 2 3 0 6 4 4 1 6 4 6 5 1 4 2 c3 17 0 3 0 3 残油8 0 6 2 5 9 2 3 1 3 6 7 4 6 1 6 8 0 7 1 1 0 8 2 3 9 8 1 2 5 4 8 2 6 5 4 8 0 1 5 8 c31 7 0 2 9 0 注 p r 一一姥绞烷 p h 一一植烷 由图 1 9 图2 0 及表四分析结果可看出 作用前后 原油组分未发生明显变 化 说明降解酶的作用不显著 六 2 3 1 菌种其它性能评价结果 1 菌浓的测定结果 菌 种的 菌浓测定 一般要 求达到 1 x 1 0 个 m 1 13 1 1 该 菌 株菌 浓测定结果见 表 五 裹五不同稀释度下菌落个数 稀释度菌落个数 平行样品 1 0 5 1 0 6 1 0 1 1 0 8 太多无法计数 51 4 6 6 0 4 5 5 0 0 1 由 表五 再由 稀 释倍数换算得出2 3 1 在液 蜡培养基中的 菌 浓为4 4 x 1 0 8 个 mi 2 初始p h的适应范围 2 3 1 菌种对p h的 适应范围 越宽越好 不同p h条件下的o d 6 0 及表面张力 如图2 1 所示 7 0通 6 0毛 5 0 只 4 0 o d6 0 0 3 0耀 n 表 面 张 力 2 0 09876543210 11n曰八曰n曰 日 日八unccu 009口0 p h值 图2 1 不同p h 下2 3 1 菌种生长及表活情况 由 图2 1 可见 2 3 1 菌 种 最 适p h 在7 左 右 p h 5 1 0 范 围内 均 能 较好 生 长 3 不同矿化度的影响 采油微生物要求能适应较宽范围的盐浓度 2 3 1菌种随盐浓度的增大而代 谢逐渐缓慢 不同矿化度生长情况如图2 2 所示 od6 0 0 表面张力 日 zul 只米旧释 n a c l 浓度 月旧旧刀汤石 4沼忍注0 1八曰 日凸 门 n曰八曰n自0 00900 图2 2 不同盐浓度 2 3 1 菌种生长及表活情况 由图2 2 可见 2 3 1 的耐盐度为0 5 9 左右 随盐浓度的增加 表面张力逐 渐升高 表活产量逐渐下降 4 不同氮源中的生长情况 2 3 1菌种在不同氮源中生长情况不同 表面活性剂产量也不同 不同氮源 的生长情况见表六 表六不同氮源菌体生长及表面张力数据 氮源含量od 6 0 0 表面张力 m n m n a n 0 3 0 8 1 2 3 9 1 困h 2 2 c 0 0 4 0 95 0 5 nh 4 c 10 8 0 6 64 5 n h 4 2 s o 4 0 4 0 6 44 4 5 n h 4 2 h p 0 4 0 4 0 6 7 6 0 9 由表六可见 以 n a n 0 3 做氮源 菌体生长良好 表面活性剂产量最高 以 伽h 4 2 h p o 作氮源效果最差 结论 1 2 3 1 菌种对4 4 a 高粘油有明 显的分散效果 5 0c 6 5 0c 7 0 0c 高温培养对 4 4 高 粘油 有显 著的 降 粘效 果 且 有 较宽的p h生 长 范围 和 较高的 耐 盐 性 经 矿 一场 应用有显著增油效果 2 3 1 是高粘油微生物采油的优良 菌种 2 2 3 1 菌种以烃为碳源在生长过程中产酸 产气 产表面活性物质 经气 相色谱分析 产生的短链有机酸是乙 酸 产酸量0 0 1 5 m o 1 1 l 产生的气体是c h 4 和c 0 2 产气量2 经薄层层析 特异性显色 红外光谱分析 核磁共振图 谱 分析 气相色谱分析和高压液相色谱分析 产生的表面活性物质是糖脂 糖组分 为鼠 李糖 脂肪酸基本单位是十碳癸酸 3 2 3 1 菌种直 接作用于4 4 高 粘油 经气相 色谱分析 作用前后的 原油组 分 未发生明显变化 4 2 3 1 菌 种对4 4 高 粘油 之所以 有明 显的降 粘效果和显著的 增油 效果 是 产 生的乙酸 c q c h 和鼠李糖糖脂联合作用的结果 其中鼠李糖脂的乳化作用 可能起主要作用 致谢 本文是在导师刁虎欣教授的悉心指导下完成的 石油微生物刘汝林老师 张心平老师 梁凤来老师在论文完成期间给予了大力的指导 中心实验室吕宪禹 老师对本文工作也给予了具体 热情的帮助支持 实验过程中还得到了研究生张 翠竹 单金玉 管亚军的帮助以及本科生刘君 胡军的大力协助 在此 一并表 示诚挚的谢意 参考文献 1 b ry a n t r s e t a l r e v i e w o f m i c r o b i a l t e c h n o lo g y f o r i m p r o v i n g o i l r e c o v e ry s p e r e s e r v o i r e n g i n e e r i n g ma y 1 9 8 9 1 5 1 2 a j s h e e h y m i c r o b i a l p h y s i o l o g y a n d e n h a n c e d o i l l r e c o v e ry mi c r o b i a l e n h a n c e me n t o f o i l r e c o v e ry r e c e n t a d v a n c e s c h r l 1 9 9 0 3 1 e r i e c d o n a l d s o n m i c r o b i l a l e n h a n c e d o i l r e c o v e ry d e v e l o p m e n t s i n p e t r o l e u m s c i e n c e 2 2 4 t h o m a s r n e w s i g i f ic a n c e o f b a c t e r i a l s u r f a c e a c t i v e c o m p o u n d s i n i n t e r a c t i o n o f b a c t e r i a w i t h i n t e r f