（药物化学专业论文）重组人干扰素的基因表达以及peg修饰.pdf

中文摘要 重组干扰素口是一种具有抗病毒、抗繁殖和免疫调节等特性的药物蛋白， 多次用于临床治疗疾病和癌症。然而，它在人体内半衰期非常短，使它不能大规 模应用于临床。因此，本文通过聚乙二醇与蛋白质的化学耦合来延长干扰素口的 半衰期。利用基因定点突变在蛋白质非活性位点引进半胱氨酸残基，通过这个半 胱氨酸残基将蛋白质和聚乙二醇( 末端含有与半胱氨酸反应的活性基团) 进行共 价连接，这种方法的优点是能产生高生物活性，单一位点耦合物。 由b o l d e rb i o t e c h n o l o g y ，n c 生物技术公司构建的含有干扰素一口基因的质粒 转化进大肠杆菌w 3 1 1 0 ，i p t g 诱导后经s d s p a g e 分析，表达产物的分子量为 l9 k d 左右，并且蛋白以不溶性的包涵体形式存在。w e s t e m b l o t 印迹分析证实表 达产物具有良好的免疫学活性。同时优化了蛋白表达条件，结果为：温度3 7 ( 2 ， 环境p h 7 0 ，i p t g 浓度0 5 m m ，诱导时间l6 小时。包涵体蛋白经过盐酸胍变性 后稀释复性，然后利用阳离子交换色谱层析( i e c ) 分离得到目标蛋白，其纯度 达到9 8 以上。同时，也对层析条件进行了优化，并最终从l l 细菌培养基中得 到2 2 m g 目的蛋白。最后干扰素口与马来酰亚胺p e g 反应得到位点特异、单一 的p e g 化蛋白。 关键词：干扰素；聚乙二醇；基因定点突变；位点特异 a b s t r a c t r e c o m b i n a n ti n t e r f e r o n - 口i su s e dc l i n i c a l l yt ot r e a tav a r i e t yo fd i s e a s e sa n d c a n c e r sb e c a u s eo fi t sa n t i v i r a l ，a n t i p r o l i f e r a t i v ea n di m m u n o r e g u l a t o r yp r o p e r t i e s h o w e v e r ，t h ed i s a d v a n t a g eo fs h o r tc i r c u l a t i n gh a l f - l i f eo fi f n 一口i nv i v om a k e si t n o tw e l c o m e db ym o s tp a t i e n t s t h e r e f o r e ，t h ec h e m i c a lc o n j u g a t i o no fp o l y e t h y l e n e g l y c o l ( p e g ) a n dt h ep r o t e i ni nt h i ss t u d yi su s e dt oo v e r c o m et h i sp r o b l e m t h ef r e e e y s t e i n er e s i d u ew h i c hi si n t r o d u c e db yu s i n gs i t e d i r e c t e dm u t a g e n e s i ss e l v e sa st h e a t t a c h m e n tp o i n tf o rc o v a l e n tm o d i f i c a t i o no ft h ep r o t e i nw i t hac y s t e i n e r e a c t i v e p e gm o l e c u l e ，r e s u l t i n gi nah o m o g e n e o u sp r o d u c tw i t hah i g hb i o l o g i c a la c t i v i t yw e e x p e c t t h ep l a s m i dc o n t a i n i n gi f n 口g e n ew a sc o n s t r u c t e db yb o l d e rb i o t e c h n o l o g y 。 a n di tw a si d e n t i f i e db ye n z y m ed i g e s t i o na n dd n as e q u e n c i n g t h ep l a s m i dw a s t r a n s f o r m a t e dt oe c o l iw 3110 ，a n dd a t ao fs d s p a g ea n dw e s t e r n b l o ti n d i c a t e d t h a ta19 k dp r o t e i nw a se x p r e s s e di nt h ef o r mo fi n c l u s i o nb o d i e sw i t hg o o d i m m u n i t y m e a n w h i l e ，t h ee x p r e s s i o nc o n d i t i o n sw e r ea l s oo p t i m i z a t e da n d t h er e s u l t w a st h a tt e m p e r a t u r ew a s3 7 ( 2 ，p ho fm e d i aw a s7 0 ，c o n c e n t r a t i o no fi p t gw a s 0 5 m m ，i n d u c t i o nt i m ew a sl6 h a f t e rd e n a t u r a t i o na n dr e n a t u r a t i o no fi n c l u s i o n b o d i e s t h et a r g e tp r o t e i n i n t e r f e r o n - 口w a so b t a i n e du t i l i z i n gi o ne x c h a n g e c h r o m a t o g r a p h y ( i e c ) a n dt h ep u r i t yw a sa b o v e9 8 w ec a ng e ta b o u t2 2 m gp r o t e i n f r o m1l m e d i a f i n a l l y , i f n - 口r e a c t sw i t hm a l e i m i d e p e gt op r o d u c es i t e s p e c i f i c ， m o n o p e g y l a t e dp r o t e i n s k e y w o r d s ：i n t e r f e r o n ；p e g ；s i t e - d i r e c t e dm u t a g e n e s i s ；s i t e s p e c i f i c 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作和取得的 研究成果，除了文中特别加以标注和致谢之处外，论文中不包含其他人已经发表 或撰写过的研究成果，也不包含为获得苤鲞盘堂或其他教育机构的学位或证 书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均己在论文中 作了明确的说明并表示了谢意。 学位论文作者签名：嘻南 签字日期：堋年 月岁日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解墨鲞苤堂 有关保留、使用学位论文的规定。 特授权墨壅盘堂可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检 索，并采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编以供查阅和借阅。同意学校 向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权说明) 学位论文作者签名： 袁矗 导师签名： 签字日期：搿年 月岁日 签字日期：乞6 d p 年 月5 日 第一章文献综述 第一章文献综述 当前，肝炎问题成为全球公共卫生的重要话题之一，全球几乎有三分之一的 人患有肝炎，它也成为人口死亡原因最高的疾病之一。而干扰素作为一种高活性， 多功能的细胞因子，具有广谱抗病毒繁殖，抗细菌增殖和激活机体免疫系统免疫 调节活性，在控制肝炎疾病的过程中发挥着重要作用。 1 1 干扰素的研究背景 1 1 1 干扰素的发现 上世纪3 0 年代，许多病毒学家在研究两种病毒感染同一宿主细胞时，发现普 遍存在两种病毒相互拮抗的现象，由此产生了病毒间干扰现象( i n t e r f e r e n c e ) 的概 念。1 9 5 7 年，i s a a c s 和l i n d e n m a n n 在研究流感病毒时，先把流感病毒加温灭活， 然后与鸡胚绒毛尿囊膜块一起培养，把没有吸附到细胞的灭活病毒彻底洗去，在 3 7 。c 条件下几小时之后去掉膜块，另外加入新鲜的鸡胚绒毛尿囊膜块，3 7 培养 过夜后用活病毒进行攻击，结果发现流感病毒的繁殖明显的被抑制了，这清楚地 说明，灭活的流感病毒作用于细胞后，细胞产生了一种可溶性物质干扰了病毒的 繁殖i lj 。因而他们把这种物质命名为干扰素( i n t e r f e r o n ) 。根据对干扰素基因核酸 序列分析结果表明，它于5 亿1 0 亿年前即于生物细胞中存在，是生物体内一类古 老的保护因子。1 9 8 0 年国际干扰素命名委员会正式将干扰素定义为：一类在同种 细胞上具有广谱抗病毒活性的蛋白质，其活性的发挥又受基因的调节与控制，即 干扰素是一类能诱导人及动物细胞产生多种广谱抗病毒蛋白的类激素蛋白，具有 抗病毒，抗肿瘤及免疫调节等生物活性。 1 1 2 干扰素的产生及其结构特点 干扰素( i n t e r f e r o n ，i f n ) 是一种诱生蛋白，是在干扰素诱生剂( 如病毒，细菌及 其产物等) 进入机体后，诱导宿主细胞产生的一类功能调节蛋白，主要是糖蛋白， 其具有抑制病毒复制、抑制细胞分裂及免疫调节等功能【2 】。正常细胞一般不自发 产生干扰素，只存在合成干扰素的潜能，干扰素的基因处于被抑制的静止状态。 在诱发剂的条件下，干扰素基因去抑制而获得表达。 干扰素口由干扰素口l 和干扰素口2 个亚族组成，其中干扰素口l 至少由2 0 第一章文献综述 个有功能的基因组成，彼此间有9 0 左右的同源性。干扰素口2 亚族有5 6 个基因 成员，只发现1 个有功能的基因，其余是假基因。干扰素口不同亚型有1 6 6 1 7 2 个氨基酸组成，无糖基，含有5 个口螺旋，分子量约为1 9k d 左右。干扰素一口分 子含有4 个c y s 残基，c y s l 9 8 与c y s 2 9 1 3 8 之间形成两个分子内二硫键。干扰素分 子中二硫键形成的意义有三个方面：首先，在c y s 2 9 与c y s l 3 8 ( 1 3 9 ) 之间的二硫键 对抗病毒活性是重要的，如果缺失，可使其在人细胞上的抗病毒活性下降2 0 倍。 而c y s l 与c y s 9 8 之间的则不重要。第二，c y s 2 9 与c y s l 3 8 之间的二硫键对维持 i f n 口的天然结构和对热的稳定性起关键性作用，而c y s l 与c y s 9 8 之间的二硫键 对结构的稳定性起的作用较小。第三，i f n 口中某些c y s 可形成多聚物，这些多 聚物中有些具有与单体相似的免疫化学性质与抗病毒性质【3 ，4 5 1 。但人i f n 口的二 聚物仅具有2 0 的活性。 干扰素是一种糖蛋白，分子量为2 0 10 0 k d ，一般在5 6 ，3 0 分钟不被灭活， 2 0 可长期保存。在p h 稳定性方面，干扰素口耐酸，在p h 2 0 1 0 0 中很稳定。 干扰素一般由1 5 0 1 6 0 个氨基酸组成，含1 7 种以上的氨基酸，其中天冬氨酸、谷 氨酸和亮氨酸的含量较高，不含核酸，所以不被d n a 酶或r n a 酶破坏，但易被 碘蛋白酶、乙醚、氯仿和酮基等破坏。 1 1 3 干扰素的治病原理 干扰素是一种具有广谱抗病毒特性的蛋白，其抗病毒、抗肿瘤以及免疫调节 的特性有赖于以下三个方面的作用1 2 纠： ( 1 ) 抗病毒作用 抑制病毒的繁殖和生长是干扰素的基本功能之一，也是其得以发现和研究的 原因。干扰素对高等生物的生存至关重要，因为它们为抗御病毒的侵害提供了第 一道防线，比免疫反应要早几小时甚至几天的时间。干扰素的作用是通过与细胞 膜上的特异性受体结合，引发级联性的信号放大过程。将信号最后传递到细胞核 内，对一系列基因的表达进行调控，并引发各种生理生化反应。i f n 本身并非直 接抗病毒物质，病毒感染导致i f n 的产生与释放，同时病毒感染细胞导致被感染 细胞死亡，崩解，i f n 也随之释出向附近扩散，并随血循环至全身。干扰素与周 围同种靶细胞膜的特异性受体结合，被运送到细胞内，起着第一信号的作用，活 化细胞膜腺苷酸环化酶，促使c a m p 形成。c a m p 作为第二信使，从而激活细胞 内抗病毒作用机制，使得干扰素激活基因( i s g ) 表达，产生一组抗病毒物质。同 时机体内存在着合成抗病毒蛋仨 a v p 基因可抑制病毒m r n a 信息的传递，从而阻 止病毒在宿主细胞内繁殖，但由于体内存在抗病毒蛋白密码抑制物，故在正常状 态下，不能合成a v p 。i f n 与细胞膜上i f n 受体结合，细胞内产生的特殊因子与 2 第一章文献综述 a v p 密码抑制物结合，使a v p 基因脱抑制，按i f n 遗传信息转录成特定的 a v p m r n a ，再转译成a v p 。也就是说，干扰素并非直接作为反式作用因子对 其效应分子的基因组进行调控，而是借助受体介导的信号转录系统引发系列的 生化反应达到调控效应分子的目的。 干扰素对病毒的防御反应主要是通过以上的方式，导致一系列受干扰素调控 基因表达，生成多种直接作用于入侵病毒的酶和蛋白质，保护机体免受感染，其 中j a k s t a t 通路是干扰素介导的信号转导和转录激活的主要方式。j a k 为j a n u s 家族的蛋白酪氨酸激酶，包括j a k 一1 ，j a k 2 ，j a k 3 ，t y k 2 ，s t a t ( s i g n a l t r a n s d u c e ra n da c t i v a t o ro f t r a n s c r i p t i o n ) i i p 细胞转导与转录激活因子( 包括s t a t 1 ， s t a t 一2 ，s t a t - 3 ，s t a t - 4 ，s t a t 一5 a ，s t a t - 5 b ，s t a t 一6 ) ，其中j a k l ，j a k - 2 ， t y k 2 与s t a t 1 ，s t a t 2 直接参与了干扰素介导的j a k s t a t 信号转导通路。 j a k ( j a n u sk i n a s e ) 为一种存在于胞浆中的蛋白酪氨酸激酶，它活化后可使干扰素 受体磷酸化。s t a t ( s i g n a lt r a n s d u c e ra n da c t i v a t o ro ft r a n s c r i p t i o n ) 可以通过其 s h 2 结构域识别磷酸化的受体并与之结合。然后s t a t 分子亦发生酪氨酸的磷酸 化，酪氨酸磷酸化的s t a t 进入胞核形成有活性的转录因子，影响基因的表达。 t u - l n i “i | j - x i i i f n - , t , m a l n l 脚麓j l 图1 - 1i f na l p h a 信号通路 i f n 一口受体由i f n a r l 和i f n a r 2 构成，前者与酪氨酸f f i i t y k 2 结合，后者与 j a k l 结合。r a c k i ( 活化的激酶c 1 受体) 进一步地作为接合器分子，与s t a t - 1 ( 信 号换能器和转录活化剂1 ) 和i f n a r 2 会合，暗示着r a c k l 和i f n a r 2 ，j a k l ，t y k 2 ， s t a t l 形成复合体。i f n 与受体结合时，受体自身的磷酸化经酪氨酸激酶的磷酸 化( 活性化) ，之后发生s t a t 2 ( t y r 6 9 0 ) ，s t a t ( t y r 7 0 1 ) 的磷酸化，磷酸化了的s t a t 第一章文献综述 形成二聚体( s t a t l s t a t 2 ) 之后，进一步与i r f 9 会合，形成转录活性化因子 i s g f 3 ，这个i s g f 3 与存在于i f n 诱导性基因( i s g ) 的启动子区域的 i s r e ( i f n s t i m u l a t e dr e s p o n s ee l e m e n 0 序列结合，促进转录。这时，为了得到更 好的转录效率，s t a t i 的丝氨酸残基( s e r 7 27 ) 需要磷酸化。i f n 的信号通路见图1 1 。 ( 2 ) 免疫调节作用 干扰素有利于巨噬细胞对抗原的吞噬，n k 细胞对靶细胞的杀伤以及t 、b 淋 巴细胞的激活，增强机体免疫应答能力。i 型干扰素可增1 j 口m h c 1 分子的表达， 从而增强了细胞毒性t 细胞对类靶细胞的杀伤效应，同时增加n k 细胞裂解潜能， 使机体有效地抗病毒感染和抗肿瘤免疫。i i 型干扰素可增加细胞表面m h c i i 类分 子的表达，调节巨嗜细胞、t 细胞、b 细胞之间的关系，增强免疫应答能力。 ( 3 ) 抗肿瘤作用 研究表明m h c 在肿瘤免疫方面起着重要作用，恶性肿瘤细胞常有m h c 表达 降低或丢失的现象。肿瘤细胞m h c 抗原的丢失是肿瘤细胞逃避机体免疫监视的 原因之一。而近来研究i f n 能诱导细胞m h ci ，i i 类抗原的表达，并能使i v l h c 表 达降低或丢失的恶性肿瘤细胞m h c 表达增强，也可使m h c 表达无降低或丢失的 恶性肿瘤细胞的m h c 表达进一步增强，从而增强肿瘤免疫源性及t 细胞对肿瘤细 胞的识别能力，增强对肿瘤抗原的递呈作用，激活机体免疫杀伤肿瘤细胞。i f n 这一作用具有重要的基础和临床意义。 i f n 调节m h c 的表达主要是通过加速细胞m h c 转录过程，增强其表达。i f n 发挥作用时，首先与细胞表面的i f n 受体结合，激活细胞内信号传导途径，加速 m h c 的转录过程，引起m h c 表达增高。但i ，i i 型i f n 受体不同，且其对m h c 启 动子的要求也不同，因此两型i f n 对m h c 诱导表达的作用强弱也有所不同。在单 核细胞，b 淋巴细胞，巨嗜细胞内发现i f n 储导h l a d r 表达的细胞内途径有： 蛋白激酶a ，钙离子和蛋白激酶c 途径，但在人正常甲状腺细胞，i f n 1 ，激活蛋白 激酶c 途径抑制h l a d r 的表达。许多研究发现i f n 调节m h c 表达主要作用于转 录水平。k e m 通过检测去除i f n 作用后转录下降速率，稳定状态m r n a 水平及细 胞膜表面蛋白表达水平的高低，发现i f n 。丫诱导m h ci 类抗原表达主要作用于转 录水平，而不是转录后水平。v e g h 应用i f n 丫作用许多细胞系和人外周血淋巴细 胞，发现i f n 丫开始时是先作用于转录后水平，加速细胞内原有的游离i 类抗原的 轻链和重链合成i 类抗原分子- ，在8 2 4 d , 时启动m h c 基因，加速其转录，在转录 水平调节m h c 的表达。 i f n 介导的m h c i 类基因转录效率的提高和三个与启动子相关的序列关：i f n 应答序列( i r s ) ，增强子a ( 也被称为i 类基因调节元件) 和增强子b ，前两者在m h c i 类基因的调控中起重要作用。i r s 与增强子a 有部分交叉重叠，位于一1 6 5 和一1 3 7 4 第一章文献综述 之间( 相对5 端转录起始点而言) ，可与i f n 诱导产生的核因子i r f s ，i s g f ，i b p i 和i c s b p 等结合对m h c 发生正调节。增强子a 位于1 9 3 至1 5 8 之间，可与核因子 k b f i ，k bf 2 ，h 2 一t f l ，n f k b ，c f o s ，c i u ，a p2 结合发生正调节作用。而 m h c 基因a 和b 位点上的i r s 在一1 7 6 和1 7 5 点的两个核苷酸不同，使i f n 受体结合 后产生的核因子与i r s 结合产生的作用也不同，因此，i f n 诱导a ，b 位点表达的强 弱不同。 m h ci i 类抗原位于b 淋巴细胞、巨嗜细胞和巨嗜细胞表面，这种正常表达称 为组成型表达，而非造血系统来源的细胞不表达m h c i i 类抗原，但这些细胞可被 i f n 等细胞因子作用后表达，这种表达称诱导性表达。i f n 介导的m h c i i 类抗原 的表达调节发生于转录水平，其是5 端顺式作用调节元件和反式作用因子相互作 用的结果。在组成性m h c i i 类抗原表达的b 细胞中，受到发育中的具有激活功能 的调节反式作用因子的控制，它使免疫反应激活因子基因编码组成性凡事作用激 活因子，后者与i i 类基因的组成性调节区域的d n a 结合起正调控作用，引起m h c i i 类基因的转录。而在诱导性m h c i i 类抗原表达中，i f n 激活诱导性反式作用激 活因子，与i l 类抗原诱导行调节区域结合起正调控作用而加速转录过程。由于 m h c 基因的复杂性和其调控区的多态性，不同细胞系之间，i f n 的诱导m h c 表 达的能力也不同。 干扰素口的诸多特性只能为其作为治疗药物提供一种可能，但是，和大多 蛋白或多肽类物质一样，它在临床应用上有诸多缺点。其中最主要的缺点是在人 体内的循环半衰期非常短，只有几分钟。因为干扰素的分子量只有1 9 k d ，特别 小，在人体循环至肾小球时大部分都被渗透滤过，造成血药浓度的降低。而如果 加大剂量多次服用，势必会带来大量副作用。同时，蛋白酶的水解也会降低蛋白 的血药浓度，使蛋白的生物利用度低。因此，如果要使干扰素得到好的疗效，需 对干扰素口进行一定的修饰，以延长半衰期。而我们选择聚乙二醇( p o l y e t h y l e n e g l y c o l ，p e g ) 作为这种修饰剂。 1 2 蛋白质的聚乙二醇修饰 蛋白质和肽类分子的化学修饰已经成为生物技术与生物医学领域的研究热 点，而聚乙二醇( p e g ) 则是应用最为广泛的大分子修饰剂之一。p e g 化学修饰实 际上就是在生物活性分子表面共价连接上亲水性p e g 长链。蛋白质或肽类分子 p e g 化后，其主要的生物学和生理学功能保持不变，而可同时获得一些非常期 望的性质。 第一章文献综述 1 2 1 聚乙二醇的性质 聚乙二醇( p o l y e t h y l e n eg l y c o l ，p e g ) 是一种线形或带分支的中性聚合物，通 常呈电中性，易溶于水和许多有机溶剂如乙醇、丙酮等。p e g 分子量的选择余 地较大，从几百到几万。当分子量小于1k d 时，p e g 是无色的粘性液体，高分 子量的p e g 是蜡状的白色固体。通常用于生物技术及生化应用的分子量从1 k d 到数万不等。 在水溶液中，p e g 为高度水合的聚合物，每个乙氧基单元可以结合2 3 个分 子水，由于骨架的灵活性以及与水分子的结合，p e g 分子水力学半径较大，其表 观体积为相近分子量的水溶性蛋白质分子体积的5 到1 0 倍左右【7 1 。当被连接到分 子上时，聚乙二醇对这些分子的化学性质几乎没有大的影响，但却控制他们的溶 解度并使其分子增大。p e g 的分子化学通式为： h o - ( c h 2 c h 2 0 ) 。- c h 2 c h 2 0 h 为避免在修饰过程中发生交联和团聚，通常采用一端进行钝化处理的甲氧基聚乙 二醇( m p e g ) 作为修饰剂的合成原料，其化学通式为： c h 3 0 - ( c h 2 c h 2 0 ) n - c h 2 c h 2 0 h 1 2 2p e g 修饰蛋白的应用原理 很多蛋白质多肽药物在体内半衰期很短，并且容易引起免疫反应。为了解决 这些问题，1 9 7 7 年d a v i s 首次采用聚乙二醇修饰牛血清白蛋白【8 】。此后，p e g 修饰 药物技术( p e g y l a t i o n ) 迅速发展，并广泛应用于多种蛋白类药物和非蛋白类药物 的修饰。 p e g 化学修饰实际上就是在生物活性分子表面共价连接上亲水性p e g 分 子。经过二十多年的发展，p e g 修饰药物技术已经进入了实用期，迄今，已有6 个药物通过f d a 批准进入市场，还有更多药物处于临床和实验室研究阶段。一 般认为，经p e g 修饰后的药物，主要有以下方面的优点【9 , 1 0 ： ( 1 ) 稳定性和延长血浆半衰期 一些以注射方式使用的药用蛋白，由于在血液中存留的时间过短，在很大程 度上限制了其正常药效的发挥，通i 主p e g 修饰则可以有效延长蛋白在循环系统内 的保留时间。聚乙二醇修饰能够延长蛋白质的体内半衰期的机制至今仍未明确， 主要是多种因素共同作用的结果，包括1 ) 由于p e g 大分子的共价偶联，蛋白质 分子量增加，使其不易被。肾脏代谢，因而在血液的停留时间延长，消除减慢。聚 乙二醇修饰增加了蛋白质的有效分子量，肾消除速率减小，半衰期延长【1 1 1 ；2 ) p e g 线性长链的屏蔽作用，使蛋白质不易受蛋白酶的降解，从而延长其体内作用 第一章文献综述 时间；3 ) p e g 蛋白的免疫原性大大降低，难以激发抗体的产生，从而不会通过免 疫反应消除。 ( 2 ) 降低抗原性和免疫原性 通过p e g 修饰可以来消除免疫反应活性，将异源蛋白转化为非免疫原性的药 用蛋白。p e g 之所以能降低蛋白质免疫原性在于：p e g 是一种无免疫原性、不带 电荷的线性、柔性的长链大分子，当p e g 链与蛋白质非活性部位的氨基酸残基结 合偶联时，在蛋白表面形成一道屏障，挡住蛋白质的抗原决定簇，使蛋白质不被 当作异源物质识别，避免了抗体的产生，或阻止抗原与抗体的结合，抑制抗原抗 体的中和反应1 1 2 j 。 ( 3 ) 降低毒副作用 由于一些通过基因重组技术获得的蛋白的血浆半衰期很短，为达到显著的临 床治疗效果不得不加大使用剂量，这就常常引起严重的毒副作用。近年来发现， 利用p e g 修饰技术对这些蛋白进行处理后，能够大大增加其血浆稳定性，降低使 用剂量【1 0 1 ；小分子蛋白质，易经肾小球滤过，相对分子量在1 5 0 0 0 7 0 0 0 0 d 的范 围内，肾脏清除小分子蛋白质的速率与其相对分子量的大小呈负相关。应用线形 的大分子p e g 与蛋白质的非必需基团共价结合，其相对分子量大大提高，不易被 肾小球滤过。p e g 无毒性，是f d a 批准的可用于人体聚合物，在体内不会进行生 物降解产生有毒性的衍生物，相对分子量小的( 5 0 0 0 0 ) p e g 可由肾小球直接排出 体外。 1 2 3 聚乙二醇的活化 目前，p e g 修饰普遍采用的是单甲氧基聚乙二醇( m p e g ) ，末端的羟基是其 化学反应的功能基团，但必须在较激烈的条件下才能与其它基团发生反应。为使 蛋白质能在温和条件下，以较高的速率与p e g 偶联，须先对p e g 进行活化。在p e g 修饰药物尤其是蛋白大分子的过程中，端基起着至关重要的作用，不同端基的聚 乙二醇具有不同的反应活性，能够与不同的基团进行反应，p e g 化学( p e g y l a t i o n ) 的核心之一就是研究更适合修饰药物的p e g 修饰剂，蛋白质分子上与p e g 进行偶 联的基团主要是氨基、巯基和羧基，因此，针对于这些基团的p e g 活化，有机化 学家们已合成出一系列化合物连在p e g 上，例如p e g 琥珀酰亚胺酯( s c p e g ) ， p e g 一琥珀酸琥珀酰亚胺酯( s s p e g ) 等用于对氨基的修饰，而p e g 马来酰亚胺 ( p e g m a l e i m i d e ) 、p e g 乙烯基砜( p e g v i n y l s u l f o n e ) 等用于对巯基的修饰i 7 j 。 经过2 0 多年的发展，p e g 修饰药物技术取得了长足的进步。p e g 修饰的药 物范围从蛋白扩展到小分子药物、脂质体等。p e g 分子量也从几千扩展到几万 乃至更高；与药物的连接方式也不再局限于永久性连接，而出现了可释放性连接， 第一章文献综述 甚至永久性连接和可释性连接共存的“p e g 一杂合物”( p e g h y b r i d s ) ；p e g 的活化 方法也日益多样；p e g 结构也从链形扩展到树形、叉形等：修饰方式也逐渐从 随机修饰逐渐向定向、定量修饰方向发展。有理由相信，将来还会有更多的p e g 修饰药物进入市场。 1 3 干扰素dp e g 修饰的研究进展 干扰素一般由1 5 0 一1 6 0 个氨基酸组成，含1 7 种以上的氨基酸，这为其p e g 化 提供了多种耦合模式，以下几种p e g 化产物就是通过不同的连接方法而得的。 1 3 1p e g - 干扰素- 口2 a ( p e g a s y s ) 干扰素一口2 a ( p e g a s y s ) 是由h o f f m a n n - r o c h e 公司于2 0 0 3 年研制上市的，治疗 慢性乙肝有很好的疗效。如图1 2 所示，p e g ，小m s 为活化后的蛋白质修饰剂， 含有两条单甲氧基p e g 链，每条链的分子量均为2 0k d a ，通过两个氨基甲酸酯 键连接在赖氨酸( 1 y s i n e ) 上。p e g ：- n h s 与干扰素的反应是醇与氨基的交换反应， 也就是将羧酸酯键变成肽键【1 4 】。 参 佣舭h m 2 c p e g h2 ( ( 2 0 0 c k d a h ：c ) h 2 叫一3 n h h ：1 y s i n 。 m p e g ( 2 0 k d a )工uv s i n e i ( c h 2 ) 3 c h ，。c h 2 c h ：( 。c h 2 ch 2 ) 。一o ! ! 一哥3 i h c m p e g ( 2 0 k d a ) 厂 i c h 3 0 h 2 c h2 ( o c h2 c h 2 ) n o c 一叩 m p e g ( 2 0 k d a )6 i ，c ：。：c 。一o ! ! 一h n ! o + o 图l - 2p e g2 - n h s 与i f n 一口耦合的反应机理 0他 s n h 町 喇 也 r n n一。lr 啪u kma 干扰素- 口上的氨基除了n - 末端氨基外，还有赖氢酸上的氨基，而在干扰素 中存在9 个赖氨酸残基( 图1 3 ) ，所以p e g ，- n h s 理论上可能与上面十个氨基发 生反应，而且也有可能生成单取代，双取代和多取代的混合物。虽然晟后的实验 结果表明反应主要发生在k 3 i 、k 7 0 、k 一1 3 4 、k 1 3 1 、k 1 2 1 和k 1 6 4 上”51 6 ) ， 但是位点异构体还是存在而且是大量存在，更重要的是这种方法产生出p e g 蛋白质耦合物大多数没有生物活性，即使有活性的耦合物相对于干扰素一d 本身 生物内在活性也下降了1 0 - 1 0 0 倍。 簟 渤 诵争爰遵察。 图1 - 3 干扰素- 口的l y s 位点 因此，p e g a s y s 相对于干扰素的治疗功效有了很大的进步，但是其诸多缺点 限制了其进一步的发展，药物学家们又开始把目光移向另一种方法。 3 2p e g - 干扰素口2 b ( p e g - i n t r o n ) 在上述p e g a s y s 的修饰中，p e g y l a t i o n 化学的设计是使p e g 与蛋白质之间形成 稳定的连接键，以利于偶联物的纯化和长期保存，但有时p e g 会占据或屏蔽蛋白 质的活性位点而降低其活性，p e g 干扰素口2 a 产物中的活性丧失就是因为这个 原因。在此种情况下，一种新的p e g i f n 偶联物p e g i n t r o n 诞生，它由s c h e d n g 公司生产，用于乙肝和丙肝的治疗i ”。其具体原理是：用蛋白质和p e g 之间可降 解的化学键改进药物动力学的半衰期，通过释放天然的干扰素口2 b 来减少活性 丧失。 p e g 的分子量越高，所形成蛋白质耦合物的半衰期越长，而其生物活性却越 低。p e g - i n t r o n 为了得到较好的生物活性，使用的是分子量为1 2k d a 的p e g 。在 干扰素一口中，有三个组氨酸残基，h i s 一7 、h i s 5 7 和h i s 一3 4 ，但其耦台点主要是 h i s 一3 4 i l 。p e g i n t r o n 耦台物是p e g s c 和干扰素一口2 b 在酸性条件下偶合得到 的。这样偶合可以使大量的p e g 聚集到组氨酸h i s 3 4 上( 如图i 4 ) 。在此情况下， 第一章文献综述 p e g 偶合到组氨酸的咪唑环上含双键n 的位置上，形成氨基甲酸酯。一段时间后， p e g 会从蛋白质上释放出来。 o c h 3 0 c h 2 c h 2 ( o c h 2 c h 2 ) n o c o s c p e g o o o h i s 3 4 c h 3 0 c h 2 c h 2 o c h 2 c h 2 n o c nv nh h i s 3 4o fp e g i 刚 图1 - 4p e g - i n t r o n 合成的反应机理 + + h i s 3 4 n v 旧 h i s 3 4o fi f l n 虽然p e g i n t r o n 的位点异构体与p e g 干扰素口2 a 相比较少，但是还是存 在一定程度的异构体，也给药用带来很多不便。如何研制出一种只含有单一产物 的p e g 耦合方式就成为了下一个热点课题。 1 3 3p e g - 干扰素一口( 位点特异的p e g 化) 干扰素口有四个半胱氨酸( c y s ) 残基，c y s l 9 8 与c y s 2 9 1 3 8 之间形成两个分 子内二硫键，没有游离状态的巯基，似乎对c y s 进行修饰没有可能。但是随着分子 生物学的发展，在不影响活性位点的情况下，应用基因工程技术或者化学手段引 入游离的巯基，再进行p e g 修饰，这就为干扰素的p e g 化开辟了一条新的方向一 位点特异p e g 化。 采用基因定点突变( s i t e d i r e c t e dm u t a g e n e s i s ) 的手段把巯基引人到蛋白质中 的特定位点后【l 引，就可以用对巯基呈现一定反应活性的p e g 修饰剂对该蛋白质 进行高选择性修饰。由于蛋白质表面半胱氨酸残基数比赖氨酸残基数要少得多， 因此半胱氨酸是一个很好的靶位，可以实现特异性修饰，不会象前面的两种一样 产生位点异构体，只有一种p e g 修饰产物，提高了其生物活性【2 0 1 ，同时为下一 步的提纯带来了方便。此外，巯基的反应活性非常高，有利于反应得顺利进行。 为半胱氨酸p e g 化而研制的p e g 衍生物有许多，但一般使用p e g 马来酰 亚胺1 20 | 。p e g 马来酰亚胺在酸性条件下易与巯基反应，但在水溶液中不稳定， l o 第一章文献综述 可发生开环或加成反应，但通过调节p h 值抑制其水解。p e g 马来酰亚胺与干 扰素的反应式如下： o 图1 5 位点特异p e g 化的反应机理 。 这种方法有很多优点，但是潜在缺点也存在。通过基因位点突变而产生的人 为的游离半胱氨酸会增加形成不正确二硫化物和蛋白质二聚的几率，造成生物活 性的损失。但是瑕不掩瑜，这种位点特异的p e g 化必将为干扰素的广泛使用带 来新的前景。本课题就是通过这种位点特异的p e g 化，将p e g 耦合到干扰素上， 进行p e g 修饰。 如图1 - 6 所示，i f n - 口的p e g 化经过了十几年的发展，主要经历了这三个 过程，但前面的路还很长，出现的问题还很多，正等待着人类一个一个去解决。 多结合位点 多异柯体 低活性 少结台位点 少异构体 活性中等 图1 - 6i f n 口p e g 化的发展 一个结合位点 单一产物 高活性 第二章干扰素一a 的基因表达 第二章干扰素一q 的基因表达 干扰素基因工程主要包括基因克隆和基因表达两个主要阶段：用诱生剂诱导 细胞后，提取干扰素的m r n a 反转录成cd n a ，再与质粒d n a 重组，转化受体菌 株，通过复制重组d n a ，干扰素基因的转录、翻译而使干扰素得到表达。 本次实验所使用的质粒是由b o l d e rb i o t e c h n o l o g y ，i n c 公司生产的，故基因 克隆部分就不用做，仅仅做后面的表达部分。如图2 1 所示，其质粒含有干扰素 a 的基因，同时还包含一个四环素抗性基因，以方便阳性克隆的筛选。 p 姐 图2 1 含有目的基因的质粒图谱 2 1 大肠杆菌感受态细胞的制备和转化 打曲咖 c o u l ) h 转化( t r a n s f o r m a t i o n ) 是将外源d n a 分子引入受体细胞，使之获得新的遗传 性状的一种手段，它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验 技术。转化过程所用的受体细胞一般是限制修饰系统缺陷的变异株，即不含限制 性内切酶和甲基化酶的突变体，它可以容忍外源d n a 分子进入体内并稳定地遗 传给后代。受体细胞经过一些特殊方法( 如电击法，c a c l 2 等化学试剂法) 的处理后， 细胞膜的通透性发生了暂时性的改变，成为能允许外源d n a 分子进入的感受态 第二章干扰素一a 的基因表达 细胞( c o m p e n e n tc e l l s ) 。 相对于传统的c a c h 溶液转化法，本实验采用的t s b g 法有着更高的转化效 率，而且方法也简便易行。其原理同c a c h 溶液转化法一样，也是通过金属离子 试剂对细胞膜通透性的作用，允许外源d n a 分子进入细胞，从而制备出感受态 细胞。 2 1 1 试剂 质粒d n a ( 含有干扰素基因) 大肠杆菌w 3 1 1 0 胰蛋白胨( t r y p t o n e ) 酵母菌提取物( y e a s te x t r a c t i o n ) 四环素盐酸盐( t e t r a c y c l i nh c i ) 琼脂粉 部分试剂配方： 5 k c m ( 见表2 1 ) t s b ( 见表2 表2 15 k c m b o l d e rb i o t e c h n o l o g y , i n c 0 x o i d o x o i d 联星生物 天津迪博化工有限公司 加入l b 液体培养基( p h6 1 ) t s b g ：t s b + g l u c o s e ( 1ms t o c k ) t om a k e 2 0m mt s b g 溶液指含2 0m mg l u c o s e 的t s b 溶液。 制备0 8m lt s b g ：1 6 u l1 mg l u c o s e + 7 8 4u lt s b 。 l b 液体培养基( 1o om l ) ：1gt r y p t o n e + 0 5gy e a s te x t r a c t i o n + 1gn a c i 第二章干扰素一a 的基因表达 l b 固体培养基：1 0 0m l 液体培养基+ 1 2g 琼脂粉 2 1 2 仪器 x w - - 8 0 a 微型涡旋振荡器上海沪青仪器厂 g i l s o n 牌微量可调移液器 法国吉尔森公司 e p p e n d o r f 台式离心机 上海安亭科学仪器厂 立式压力蒸汽灭菌器 上海博迅实业有限公司 h p s 一16 0 型生化培养箱 哈尔滨使东明医疗仪器厂 7 5 2 型分光光度计 上海科学精密仪器有限公司 s h b i i - - 3 6 0 电热恒温培养箱 天津市天宇实验仪器有限公司 b c n 一1 3 6 0 型生物洁净工作台 哈尔滨市东联电子技术开发有限公司 h z q q 型全温振荡器 哈尔滨市东联电子技术开发有限公司 其余试剂和仪器均来自于天津大学科威公司 2 1 3 操作步骤 1 受体菌的培养 ( 1 ) 茵体活化：挑e c o l iw 3 11 0 单菌落接种到l b 平板，过夜培养。继续挑取 单菌落至l b 平板，过夜培养； ( 2 ) 摇菌：挑e c o l iw 3 11 0 单茵落，接种于5m l 液体l b 培养基中，3 7 c 振 荡过夜培养1 2h ； ( 3 ) 将过夜振荡培养物5 0u l ( 按1 比例) 接种到新的5 0m l 液体l b 培养基 中，继续振荡培养至o d 6 0 0 = 0 4 0 5 ； 2 感受态细胞的制备 ( 1 ) 将液体培养物定量转移到无菌的5 0m l 离心管中，3 0 0 0r p m 离心1 0 分钟， 沉降菌体，弃上清； ( 2 ) 用lm l 冰t s b 轻轻