（生物医学工程专业论文）纳米羟基磷灰石与血液中生物大分子及红细胞的相互作用.pdf

综上所述，h a p l ，h a p 2 ，h a p 4 ，h a p 5 与红细胞相互作用后均未导致细胞 破裂，其中以b s a 作为表面修饰剂的h a p 5 保持了诈常的红细胞形态和细胞悬 浮性，是一种血液相容性较为理想的材料。 关键词：羟基磷灰石纳米粒子，吸附，肝素，唾液酸，牛血清白蛋白，红细胞 a b s t r a c t a sah i 曲一q u a l i t ym e d i c a lb i o m a t e r i a l s ，h y d r o x y a p a t i t eh a v eb e e na p p l i c a t e do n a r t i f i c i a lb o n ea n di m p l a n td e n t e s n a n o h y d r o x y a p a t i t eb e c a m ei n v e s t i g a t i v ew a r m s p o t s i nb i o m e d i c i n ed o m a i ns u c ha s a r t i f i c i a l b o n e ，m e d i c i n ec a r r i e r a n d a n t i n e o p l a s t i ca c t i v i t y f o ri t sn a n o m e t e rs i z ee f f e c t i v e n e s sa n df i n e b i o c o m p a t i b i l i t y b u tt h es a f es t u d yo fn a n o h y d m x y a p a f i t ei nb l o o di st h ek e yl i n k t oc o m et r u ec l i n i c a la p p l i c a t i o nw h i c hi sr e p o r t e dl e s s e rc u r r e n t l y t h i sp a p e rh a v e a p p r o a c h e d i n t e r a c t i o nb e t w e e nn a n o h y d r o x y a p a f i t ea n ds o m eo fi m p o r t a n t b i o m o l e c u l e si nb l o o da n di t si n f l u e n c eo nm o r p h o u sa n df u n c t i o no fr e db l o o d c o r p u s c l e ( r b c ) u l t i m u m ，w eh o p et op r o v i d es o m ef o u n d a t i o n a lb a s eo nr e s h a p i n g o fm a t e r i a ls u r f a c ef o rr a i s i n gh a e m o c o m p a t i b i l i t y i nt h i ss t u d y ，d i f f e r e n tn a n o h y d r o x y a p a t i t ep a r t i c l e s ，h a p i ( 2 5 6 0 n m ) ，i - i a p 4 ( t h e a d d i t i v e si sh e p a r i n ，15 - 5 0 n m ) ，h a p s ( t h ea d d i t i v e si sb o v i n es e r u ma l b u m i nb s a ， 2 0 - 8 0 r i m ) w e r ep r e p a r e db yh o m o g e n e o u sp r e c i p i t a t i o na n du s e dh e a v y g a u g e h y d r o x y a p a t i t ea sc o m p a r i s o n ，w ed e t e r m i n e da m o u n to fh e p a r i n ，s i a l i ca c i d ，b s a a d s o r b e do nh a p l ，h a p 2 ，h a p 3b yc r y s t a lv i o l e ta s s a y , b i a l s c h em e t h o d b r a d f o r d m e t h o dr e s p e c t i v e l ya n da n a l y z e dt h eb i n d i n gm e c h a n i s m b yi n f r a r e ds p e c t r u m ；a f t e r t a k i n gh a p i ，h a p 2 ，h a p 4 ，h a p sa n dr b ct o c o c u l t u r ei nv i t r o ，w es t u d i e dr b c h e m o l y s i st e s ta n dd e t e c t e dr b ch e m a t o l y s i sr a t eb ye r y t h r o c y t eo s m o t i cf r a g i l i t y t e s t ；o b s e r v i n gt h ec h a n g e so fm o r p h o u sa n dl o c o m o t i o no fc e l la f t e rc o a c t i n g h a p i ，h a p 2 ，h a p 4 ，h a p 5a n dr b cb yl i g h tm i c r o s c o p ea n di n v e r t e dp h a s ec o n t r a s t m i c r o s c o p e ；o b s e r v i n gh a p i ，h a p 2 ，h a p 4 ，h a p 5e f f e c t i n go nu l t r a s t r u c t u r eo f r b c e v e n t u a l l y ，w e h a v et h ec o n c l u s i o n sb e l o w ：1 t h e r ea r ed i f f e r e n te x t e n t a b s o r p t i o nc h a r a c t e r i s t i c sb e t w e e nh a p i ，h a p 2 ，h a p 3a n dh e p a r i n ，s i a l i ca c i d ，b s a w h i l et h ea d s o r p t i o na m o u n to fh a p ih i g h e ra w a yt h a nh a p 2a n dh a p 3b e c a u s eo f d i s t i n c tn a n o m e t e rp o t e n c y f u r t h e r m o r e ，h a p la d s o r b e dh e p a r i nb y c a 2 + b i n d i n g 一o s 0 3 - ， c o o h 】b i n d i n g 【o h 】v i ah y d r o g e nb o n da n dm o l e c u l a rs t r u c t u r ec u r la n d o v e r l a p p i n go fh e p a r i n ；h a p la d s o r b e ds i a l i ca c i dc h i e fb y 【o i - i qc o m b i n i n g 时h 】 a n d c a ”】c o m b i n i n g 【c o o h 。 ；t h e mh a v e a l m o s tn od i f f e r e n c e o na d s o r p t i o n a m o u n to fs i a l i ca c i da d s o r b i n go n t oh a p lb e t w e e nh e p a r i n i z e da n du n h e p a r i n i z e d h a p i ；t h ea d s o r p t i o n a ls i t eo f h a p la n db s a a r ep r i m a r ya ta c i da m i d el ，a c i da m i d e i i i i i ， c o o g r o u po fb s aa n d c a 2 + h y d r o x y a p a t i t e 2 h a p t ，h a p 2 ，h a p 4 ，h a p 5 g r o u p ， o h g r o u p ， p c 4 3 _ 】g r o u p o f h a v en o tc a u s e dh e m a t o l y s i sa f t e rt h e y c o c u l t u r e dw i t hr b c ，b u th a p 【a n dh a p 4c a nl e a dt oe r y t h r o c y t ea g g r e g a t i o nw h i l e h a p 5c a nk e e pr b cf l o a t i n g 3 f r o mu l t r a s t r u c t u r eo fr b c w h i c hc o - c u l t u r e dw i t h h a p h h a p 4 h a p 5 w eh a v e o b s e r v e dt h a th a p ia n dh a p 4c a ni n d u c er b c m e m b r a n et od e f o r ma n dd e c r e a s es t a b i l i t yo fr b cm e m b r a n e ，s ot h ep a r t i c l e sc a l l e n t e ri n t r a m e m b r a n e ，a sar e s u l t ，i n t r a c e l l u l a rh y d r o x y a p a t i t en a n o p a r t i c l e sm a y h e i g h t e n t h ec o n c e n t r a t i o no fc 扩a n de f f e c ts t r u c t u r eo f , m e m b r a n ep r o t e i n m e m b r a n el i p i da n dh e m o g l o b i n ，s u b s e q u e n t l y ，t h ed e f o r m a b i l i t yo fr b cd e c r e a s e d a l lt h eb e t t e ra n dl e a d e dt o e r y t h r o c y t ea g g r e g a t i o n h o w e v e r ，h a p su n i f o r m l y d i s p e r s e da r o u n dc e l la n dd i d n ta d h e r et oi t ，a l s o ，e y t o m o r p h o s i sc a n n o tb ef o u n d i ns h o r t ，h a p l ，h a p 2 ，h a p 4 ，h a p 5d i d n 5 tl e a dt op l a s m a t o r r h e x i sa f t e rt h e y i n t e r a c t e dw i t hr b c ，f u r t h e r ，h a p sw i t hb s ao s t e n s i b l em o d i f i e ri si d e a l h a e m o c o m p a t i b i l i t ym a t e r i a l sb e c a u s ei tc a nm a i n t a i nr b c sn o r m a lm o r p h o u sa n d f l o a t yn a t u r e k e y w o r d s ：h y d r o x y a p a t i t en a n o p a r t i c l e s ，a d s o r p t i o n ，h e p a r i n ，s i a l i ca c i d ，b s a ，r b c v 武汉理i ：火学硕十学位论文 第一章前言 纳米( n a n o m e t e r ，n m ) 是一种度量单位，l n m 为1 1 0 0 万m m ( & p1 0 “m ) 。纳 米结构是指尺寸在1 0 0 n m 以下的微小结构，在这水平上( 0 1 1 0 0 n m ) 研究原子、 分子的结构及相互作用并加以应用的技术称为纳米技术。纳米技术涉及的范围 广，其中纳米材料是纳米技术发展的基础。所有的纳米材料具有三个共同的结 构特点：( 1 ) 纳米尺度的结构单元或特征维度尺寸在纳米数量级( 1 1 0 0 n m ) ：( 2 ) 存 在大量的界面或自由表面：( 3 ) 各纳米单元之间存在着或强或弱的相互作用。由 于这种结构上的特殊性，使纳米材料具有一些独特的效应，主要包括小尺寸效 应和表面或界面效应，因而表现出许多优异的性能和全新的功能。羟基磷灰石 c a l o ( p 0 4 ) 6 ( o h ) 2 】简称h a p ，是动物与人体骨骼的主要无机成分，具有良好的生 物活性、生物相容性及吸附性，是一种广泛用于人工骨、种植牙等方面的优质 医用生物材料。而纳米级的h a p 兼具了纳米小尺寸效应和生物相容性好的特点， 有很强的吸附性和生物活性，在生物医学领域成为研究热点，而其在生物体内 的安全性将越来越受到关注，本文将重点研究纳米h a p 的生物安全性方面的基 础工作。 1 1 纳米羟基磷灰石在生物医学领域中的应用 当前，对纳米h a p 的应用，主要集中在人工骨，药物载体及抗肿瘤活性等 几方面，下面主要介绍这几个方面的应用研究。 1 1 1 人工骨 羟基磷灰石作为人工骨材料具有天然的优越性，且取材简单造价相对较低， 其与自然骨相似的晶体结构和元素组成，可以满足植入体的生物活性与生物相 容性，能与自然骨形成牢固的骨性结合，具有骨传导作用，可以避免类似金属 或高分子材料等植入体植入人体后出现的排斥与致敏性，不过羟基磷狄石缺乏 骨诱导能力，一定程度上影响了它用于修复大范围骨缺损的效果。为了提高人 工骨的力学性能加快新骨的形成速度以及实现药物缓释和治疗癌症等特异功 能，常常引入其他物质，利用开趋成熟的纳米、生物、组织工程和信息等技术 来改善其微观结构与性能，如此形成多种多样的羟基磷狄石基人工骨。相关科 研工作者的终极目标是模拟出经历数亿万年之久生物进化所形成的精致的骨的 结构，人工制各出和自然骨结构、组成、成份分布、性能一致的完美骨替代物。 武汉理r 人学硕十学位论文 目前，对于使用羟基磷灰石作为基材的人工骨，根据人工骨制备的工艺不同可 以分为生物陶瓷型和生物水泥型。生物陶瓷型羟基磷灰石人工骨的优点在于生 理力学性能较好， 缺点在于成型较为困难：生物水泥型羟基磷灰石类人工骨材 料是由磷酸钙粉末与固化液( 重蒸水) 组成，二者调和后，在室温或体内环境下自 行固化转变成含微孔的h a p 晶体。与h a p 陶瓷相比，它除具有引导成骨和骨性 结合的特点外，更具有制备简便、塑形容易和缓慢降解等优点，适合于非负重 或低负重部位骨缺损的修复。 纳米人工骨是一种全新的骨置换材料，其几乎与自然骨特性相似的品质为 临床上对大范围骨缺损的医治提供了新的活力。纳米材料的独特性在于它的小 尺寸效应与界面效应以及纳米结构单元之间的交互作用。由纳米尺度级别的羟 基磷灰石构成的人工骨可以根据不同部位骨生长的需要制成不同的硬度，具有 与骨生长相匹配的降解速率，且具有和天然骨类似的多孔结构，与人体不会产 生排异反应。它与原有传统骨材料的最大区别在于修复后的骨和人体骨完全一 样，不会在体内留下植入物。由于长骨结构、功能、营养、代谢以及生物力学 的特殊性，要求人工骨替代材料不仅具有良好的生物力学性能与受体骨有良 好的生物相容性，还要求材料可梯度降解，可快速血管化等。目前的人工骨替 代材料还不能满足i 临床要求，天然骨本身内部就是一个比较疏松的复杂结构。 其骨的径组织从外到内逐渐由致密到半致密网状的疏松结构。结构内部具有很 多组织。如毛细血管、晗佛氏管和各种的成骨、破骨细胞等附着在其中，与骨 无机质相互影响，形成整个的新陈代谢系统。天然生物材料在分子水平上达到 自组装，因此，利用纳米技术可以仿天然生物材料的结构和特点，合成和制备 纳米仿尘人工骨。崔福斋将采用仿生沉淀法制得的纳米h a p 胶原骨修复材料 植入新西兰大耳白兔骨髓腔中后发现：植入体的界面层可发生溶解沉积的动态 快速更新过程，巨噬细胞可在种植体表面或深入种植体内通过吞噬和胞外降解 吸收种植体材料，种植体表面及内部被吸收后伴随有新骨的沉积，种植体与骨 组织可形成化学键合。d u 等| 2 i 将一定比例的胶原与纳米级h a p 混合成具有三维 空间结构的复合材料，体外试验发现成骨细胞可以贴附生长。动物试验证实， 植入髓腔的材料能够与骨质形成直接紧密结合。胶原成分首先形成降解，材料 表面和内部出现降解孔隙，被新生骨质填充，其后出现体液和细胞引导的h a p 降解反应，钙磷含量自材料与新生骨之间逐渐降低。成骨细胞呈立体状分前i 于 新生骨陷窝中。材料强度与自然骨强度相当，降解速度与新生骨生成保持一致， 能够在植入早期和后期起到有效的支撑作用。李玉宝等 l 用共沉淀法、常压共溶 法制备了高纳米h a p 含量和分散均匀的纳米h a 聚酰胺复合材料。在复合材料的 武汉理一r 大学硕士学位论文 两相界面间形成了化学键。此种复合材料的性能，特别是抗压，抗弯强度和弹 性模量与人体皮质骨近似。动物实验结果表明：磷灰石聚酰胺复合材料具有优 异的生物活性和力学性能，与自然骨能形成牢固的生物性的骨键合。在狗的软 组织中还发现该种材料有诱导软骨的特性，是一种较为理想的新型骨修复材料。 1 1 2 药物载体 纳米材料作为药物载体具有如下独特的性能：( 1 ) 载药纳米粒作为异物可被 巨噬细胞吞噬到达网状内皮系统分布集中的肝、脾、肺、骨髓、淋巴等连接有 配基、抗体、酶底物所在靶向部位：( 2 ) n 达靶向部位的载药纳米粒随载体材料 的种类或配比的不同而具有不同的释药速率。即通过调整载体材料的种类或配 比，可调整药物的释放速度，制备出具有缓释特点的载药纳米微粒；( 3 ) 出于载 药纳米粒具有粘附性，粒径小，因此，可以延长药物在局部组织或部位的滞留 时间，增加药物的接触面积，提高药物的吸收和生物利用度：( 4 ) 通过包膜可实 现药物可控释放，如使药在胃的酸性条件下水解，弗能大大降低药物与胃蛋白 酶等消化酶的接触机会，从而提高药物在胃肠道中的稳定性；( 5 ) 载药纳米粒可 以改变膜的转运机制，提高药物在生物膜中的透过性，有利于药物透皮吸收并 发挥在细胞内的药效。在药物传输系统领域一般将纳米粒的尺寸界定在 1 - 1 0 0 0 n r n i “。 羟基磷灰石作为药物载体具有许多优点，第一，纳米羟基磷狄石具有很大 的比表面，因而有很强的吸附和承载能力。第二，纳米羟基磷灰石作为药物载 体十分安全，因为其与人或动物的骨骼、牙齿成分相同，且不为胃肠液所溶解， 在释放药物后可降解吸收或全部随粪便摊t i l t 。第三，纳米羟基磷灰石在生成过 程中很方便引入放射性3 2 p 和4 1 c a ，可用于癌细胞的灭活。a o k i ! “t 将羟基磷灰石 纳米微晶用作药物载体，对其吸附和释放药物的性能进行了细致的研究。体外 动物细胞培养实验证明，粒子大小为4 0 n m i 5 r i m 1 0 n m 的纳米羟基磷狄石溶液 对阿霉素的最大吸附量为o 2 l m g ：阿霉索和阿霉素羟基磷灰石对癌细胞均有 抑制作用，但阿霉素羟基磷灰石的抑制作用明显强于阿霉素。同时，羟基磷扶 石的化学稳定性很好，对许多药物都不起化学反应，可以作为多种药物的缓释 剂。加纳诚介等人通过羟基磷狄石纳米微晶对各种营化抗生素类药物的吸附和 脱附性能的研究，发现羟基磷狄石纳米微晶具有较理想的药物吸附一脱附性能， 可有效地控制药物的释放速率，且对药效无明显影响。i j n t e m a 等1 采用共沉淀 法将蛋白类药物b s a 包裹于纳米h a p 品粒中获得了具有缓释功能的药物释放体 系。体外缓释实验结果表明：药物的释放速率由h a p 的溶解过程控制。 武汉理i ：人学硕士学位论文 1 1 - 3 抗肿瘤活性 h a p 纳米粒子具有广谱抑癌作用，对正常细胞无影响。a o k i 等”发现h a p 纳米粒子能作为一种载体吸附多柔比星( a d m ) 、丝裂霉素c 、氟尿嘧啶等抗肿 瘤药物，在体外c a 一9 细胞和h s c 3 细胞培养中，这种载有a d m 的h a p 与单用 a d m 或h a p 的对照组有着更显著的生长抑制作用，提示能增强对肿瘤细胞增 殖的抑制。h a p 纳米粒子对急性白血病患者的体外白血病细胞生长具有明显抑 制作用。透射电镜( t e m ) 还揭示了h a p 纳米粒予能够进入c a 9 细胞的胞质内。 李世普等报道了h a p 纳米粒子对骨癌、肝癌、鼻咽癌、食管癌及喉癌等多种癌 细胞具有抑制和杀灭作用一。“”；，h a p 纳米粒子可以通过细胞膜和核膜，导致 d n a 损伤，对细胞周期有阻断， 同时上调抑癌基因p 5 3 署n 下调癌基因c m y c 的 表达，另外还可以抑制端粒酶的活性。夏清华等| | ”研究也表明，经羟基磷狄石 处理的w 2 5 6 癌肉瘤细胞。其形态和结构也发生了明显的变化。羟基磷灰石微晶 对w 一2 5 6 癌肉瘤细胞f l , d n a 含量及细胞周期有一定的影响，对g 1 期和s 期的细胞 最具杀伤力，同时羟基磷灰石微晶还可以阻止癌细胞的增殖分化，使g 2 期细胞 积累，阻止g 2 - m 期的进程。唐胜利等“q 研究结果表明，羟基磷灰石纳米粒子 既能够抑制人肝癌b e l - 7 4 0 2 细胞增殖，又诱导其凋亡，显示出较强的细胞毒性。 1 2 生物材料的皿液相容性研究现状 1 2 1 生物材料的血液相容性的评价标准 医用生物材料与血液间接或直接接触， 将对血液中血小板、红细胞、白细 胞及血浆蛋白等成分发生作用， 相互作用的结果会导致血栓形成、溶血、补体 系统激活及血液中有形成分改变等。材料的血液不相容性会严重地将危害人体 生命过程。近1 0 年来与血液相互作用的医疗器械发展迅速，目前广泛应用的 与血液直接接触或间接接触的生物材料品已达数百种之多，在临床使用中的安 全性问题越来越受到各国政府和学术界的重视。国际标准化组织( i s o ) 在1 9 8 4 年 i s o t r 关于牙科材料的生物学评价技术报告中提出了进行溶血试验的要求， 在1 9 9 2 年正式颁布的国际标准 s o1 0 9 9 3 一l 、i s o1 0 9 9 3 4 标准中详细地规定 了不同用途的医疗器械的血液相容性评价选择试验内容和方法。我国卫生部在 1 9 8 7 年颁布的医用热硫化甲基乙烯基硅橡胶标准( ws 5 1 8 7 ) 中要求对与血 液接触的甲基乙烯基硅橡胶制成的医疗器械、进行血液相容性评价试验， 1 9 9 7 年底我国颁布了医疗器械生物学评价系列标准g b t 1 6 8 8 6 i s o1 0 9 9 3 ) ) 国家标 准， 该标准明确规定了医用材料和医疗器械的血液相容性评价试验，保证与 武汉理工人学硕十学位论文 血液接触的医疗器械在临床使用中的安全性。 根据( ( i s o1 0 9 9 3 1 、i s o1 0 9 9 3 4 标准中的评价血液相容性试验方法，按 其主要过程或被测体系可分为五类： 1 血栓形成试验内容包括：光学显微镜观察血栓( 附着的血小板、白血球、 聚集物、红血球、纤维蛋白等) 、血栓重量分析( 血栓重量) 、扫描电镜观察材料 表面的血小板附着和聚集、血小板和白血球的形态、纤维蛋白、血管被血栓堵 塞的百分率及血流降低等。可选择的试验有( 1 ) 体外动态血栓形成试验：( 2 ) 体 内末梢静脉血栓形成试验。 2 凝血试验内容包括：部分凝血酶原激酶时间( p t t ) 、特异凝血因子评价 ( f d a ，d d i m e r ，f i + 2 ，p a c 1 ， s 1 2 ， t a t ) ；凝血酶原时间( p t ) ；凝血 酶时间( t t ) ：血浆纤维蛋白原观察：纤维蛋白纤维蛋白原降解产物( f d p ) 的测 定。可选择的试验有( 1 ) 动态凝血时间试验；( 2 ) 血浆复钙时闯试验；( 3 ) 凝血酶原 时间试验：( 4 ) 白蛋白吸附试验：( 5 ) 纤维蛋白原粘附试验。 3 血小板和血小板机能试验内容包括：血小板计数；血小板聚集测定； 模板流血时间；血小板因子4 ( p f 4 ) ；b 血栓球蛋白( 0 t g ) ：凝血恶烷b 2 ；同位 索标记的血小板伽马成像；”1 铟标记血小板存活等。可选择的试验有( 1 ) 体外血 小板粘附试验；( 2 ) 半体内血小扳粘附试验：( 3 ) 单克隆抗体s z 2 2 1 测定血小板 粘附试验；( 4 ) 血栓球蛋白( b 2 t g ) 含量测定试验。 4 血液学试验内容包括：白血球分类计数；溶血( 血浆血红蛋白测定) ；网 织红血球计数等。可选择的试验有( 1 ) 溶血试验；( 2 ) 血液保存时间试验：( 3 ) 白细 胞计数和分类；( 4 ) 网织红细胞计数。 5 免疫学免疫学试验内容包括：补体c 3 和c 5 的裂解产物c 3 a 、c ，。：第二 通路补体激活产物b b 、c 4 。；中央c 补体激活产物i c 3 b ；末端通路补体激活产物 s c 5 b 9 ；末端补体复合物t c c 等测定。可选择的试验有( 1 ) 补体激活试验：( 2 ) 复 合补体c 、c 3 。、c s 。( 人血) 试验。 由于血液成分的功能及其作用机理比较复杂，涉及的内容比较多，并且 生物材料的组成成分千差万别，而医用材料与血液相互作用的血液相容性经典 的试验方法比较少，除溶血试验外， 其他涉及凝血、血栓形成、血小板功能 改变、血浆蛋白粘附、补体免疫系统功能改变等诸多方面的血液相容性试验方 法对医用生物材料进行定量化的评价尚有一定的难度， 到目前为止还不能建立 一套相关的评价标准。在i s o1 0 9 9 3 一l 、i s o1 0 9 9 3 4 标准中也只能提出一个 评价方向的基本要求，具体评价方法和指标都未统一，更没有标准化。 武汉理j j 人学硕十学位论文 1 2 2 生物材料血液相容性的研究方法 现有生物材料血液相容性的研究方法基本上有三大类方法，即体外法 ( i n v i t r o ) 、半体内法( e x v i v o ) 币l 体内法( i n v i v o ) ，这三种方法各有其优势和不足。 体外法是将离体的人血或动物血与受检的生物材料接触，观察血液成分( 血 浆蛋白、血小板、自细胞、红细胞等) 变化或测定材料表面与血液成分的反应程 度，达到初筛目的。体外法具有方便、快捷、敏感的特点，且试验费用远低于 体内试验，较为经济，但体外法易受环境的影响。由于测试环境与体内环境有 较大差距，因此测试结果的准确性较差，往往用于新材料的初筛。平行板流动 室系统是目前最有效的体外模型，近来j a a nh o n g f i b t j 成的腔模型可对全血进行分 子水平上的观察，两个聚甲基丙烯酸甲酯环固定于玻片上，倒人血液_ 哿一块涂 有材料的玻片置于其上，使血液志材料接触_ 每模型放在盘上，可以模拟体内血 流环境，分析全血各成分的变化。 体内法般是直接将材料植入动物体内，在接近使用状态的条件下，练合评 价材料和机体两方面的变化程度。观察材料表面的血栓形成状况、材料的变化 以及在体内各部位产生的微小血栓；另外机体方面，观察血液成分的损伤。体 内法使材料处于真实的生理环境，其测试结果可信度高，但试验周期较长，手 术复杂，费用高昂；而且，由于试验动物种系不同及个体差异，试验结果也常 出现矛盾。最为广泛使用的动物是狗，其血小板常作为人的血小板模型，较好 反映了人体内血小板反应的情况。 半体内法是从活体动物的体外血液循环中设罱试验腔。观察试验材料表面血 浆蛋白、血小板、自细胞、红细胞的数量、形态结构的变化及血栓形态等。测 定材料表面与血液的反应性，尤其是血栓本身的生成情况。半体内试验法兼顾 了体外法的方便快捷及体内法的较为接近真实环境的优点，因此被许多研究者 采用。 自第一代血液相容性材料问世以来，已经历了半个多世纪的历程但迄今为 止，真正符合临床需求的仍然很少。由于对生物血栓形成机制和血液相容性的 研究还主要局限于一般生理和病理学水平，对于血液在分子水平上与生物材料 是如何作用的，仍然所知甚少。这种研究模式大大限制了材料相容性的研究进 展，也阻碍了血液相容性材料的开发进程。因此，我们必须突破传统的研究方 法，用分子生物学的技术研究材料对基因结构转录和翻译机制的影响，从基因 分子生物水平上研究材料与血液的相互作用，建立评价生物材料血液相容性的 标准，并在分子和原子水平上设计出新型生物材料，使血液相容性的研究和生 物材料的开发应用取得突破性的进展。 6 武汉理i ：火学硕十学位论文 1 3 本论文的研究目的、意义 纳米h a p 在药物载体、抗肿瘤和人工骨方面已经有了广泛的研究，因此， 其生物安全性必将引起重视，生物安全性是评价羟基磷灰石纳米粒子能否进入 临床的重要标准。传统的羟基磷灰石具有良好的生物相容性和生物活性，但当 粒径达到纳米的时候，粒子自身的理化性质将发生突变，同时影响到材料的生 物医学特性，如生物活性过高，可能激发普通粒子不能激发的细胞产生响应而 诱发肿瘤组织的形成甚至癌细胞的产生；粒子过小，可能游走于普通粒子不能 进入的区域而导致某些新型病变，因此关于这方面的研究具有实际意义。 可以看到，无论将纳米羟基磷狄石作为药物载体还是单体的抗癌药物，静 脉应用将是一种重要的、高效的给药途径，而且，近来应用纳米技术制造的纳 米晶羟基磷灰骨修复材料作为人工骨治疗骨缺损，在填充缺损部位时将接触大 量的来自髓腔的血液，有学者作了纳米h a p 、静脉应用安全性的初步研究卜“， 并发现在体外实验中纳米羟基磷狄石会引起红细胞聚集的现象i “i ，但对这些现 象的机理研究却较少涉及，当纳米羟基磷灰石粒子在进入血液后，可以通过与 血液中各种细胞的表面识别分子、血浆蛋白相互作用，进而对细胞的形态、运 动和生理功能产生影响，因此本文将重点讨论纳米羟基磷坎石粒子与这些生物 大分子和红细胞的相互作用的机理，从而为米羟基磷灰石粒子的表面改性，提 高其血液相容性提供生物学依据，使h a p 纳米粒子早同实现临床应用。 武汉理1 人学硕十学1 ：i ) ：论文 第二章本实验用h a p 粒子的特性 自从2 0 世纪7 0 年代，日本学者a o k i | l 叫和美国学者e ”l 相继合成羟基磷扶石后， 各国都对羟基磷狄石材料进行了大量的基础研究和l i 每床应用研究。8 0 年代后期 开始研究纳米羟基磷灰石，合成了柱状和针状的纳米羟基磷荻石粉体和微晶。 h a p 纳米粒子的合成方法通常可以分成两大类：高温固相合成法( 即干法) 与液相 合成法( 即湿法) 。高温固相合成法是使原料在高温下通入水蒸汽，通过扩散传质 机制的固相反应制得。由于干法合成难以达到分子尺度的混合，烧结温度较高， 研磨过程耗能大，所得粒子尺寸很大程度上取决于机械设备的性能，常规的研 磨法难以得到平均粒径小于1 0 0 r i m 的超细颗粒。故一般不用干法合成纳米h a p 。 而液相法由于制备形式的多样性，操作简便，粒度可控等优点而倍受人们重视。近 年来，液相法制备纳米颗粒的新方法不断涌现，包括水热合成法、溶胶凝胶法、沉 淀法、微乳液法、超声波合成法、酸碱反应法、气溶胶分解法等等。 沉淀法制备h a p 纳米粒子主要分为直接沉淀法、共沉淀法、均相沉淀法、 化合物沉淀法、水解沉淀法等多种。其原理通常是在溶液状态下将不同化学成 分的物质混合，在混合溶液中加入适当的沉淀剂制备纳米粒子的前驱体沉淀物， 再将此沉淀物进行干燥或煅烧，从而制得相应的纳米粒子。均相沉淀法是在综 合各种液相法的基础上新近发展的一种制各纳米微粒的技术，其基本原理是： 一般的沉淀过程是不平衡的，如果通过迅速改变溶液的酸度、温度控制溶液中 的沉淀剂浓度使之缓慢地增加，使溶液中的沉淀处于平衡状态，沉淀能在整个 溶液中均匀地出现，本方法通过溶液中的化学反应使沉淀剂缓慢生成，从而克 服了由外部向溶液中加沉淀剂造成沉淀剂的局部不均匀，沉淀不能在整个溶液 中均匀出现的缺点，并可以借助表面活性剂防止颗粒团聚，从而获得均匀分散的 纳米颗粒。总的来讲，该方法具有工艺简单、成本低、容易推广等优点，合成 的纳米羟基磷次石颗粒的形态接近人体骨的纳米结晶，具有广泛的应用6 口景， 虽然制各的粉体有可能发生团聚，但控制工艺条件，还是能够制备出理想的纳 米h a p 材料。 本文制备了五种不同粒径的h a p 粒子，分别是平均粒径1 0 0 纳米以下的 h a p l 、h a p 4 、h a p 5 ，l u m 粒径的h a p 2 以及2 u m 粒径的h a p 3 ，其中h a p 4 s d h a p 5 中加有同的添加剂，以探讨纳米h a p 和普通h a p 之间以及不同添加剂的纳米 h a p 之间，材料与血液中的成分相互作用的机理。 武汉理”r 火学硕士学位论文 2 1 本实验用h a p 粒子的制备 2 1 1 试剂及仪器 1 试剂 肝素 牛血清白蛋白 c a ( o h ) 2 磷酸 c a ( n 0 3 ) 2 4 h 2 0 r n h 4 ) 2 h p 0 4 柠檬酸 2 仪器 磁力搅拌器7 9 2 上海伯奥生物科技有限公司 武汉凌飞公司 分析纯天津市化学试剂三厂 分析纯武汉化学试剂厂 分析纯广东汕头西陇化工厂 分析纯汕头视光华化学厂 分析纯中国医药( 集团) 上海化学试剂公司 超声乳化强化处理机8 8 1 超纯水机s z g 3 0 3 a 电子分析天平a x 2 0 0 精密酸度计p h s 一4 c t 超声波清洗器k q 2 5 0 激光粒度仪z e t a s i z e r3 0 0 0 h s 傅立叶红外光谱仪n i c o l e t6 0 s x b 透射电子显微镜h 6 0 0t f m e d xp v 9 1 0 0 2 1 2h a p 粒子的制备 常卅i 国华电器有限公司 中国科学院声学研究所 艾柯成都康宁科技发展公司 常州国华电器有限公司 上海大普仪器有限公司 昆山市淀山湖检测仪器厂 英国m a l v e m 公司 美国尼商力公司 同本h i t a c h i 公司 1 ，h a p l 制备方法：首先将c a ( h 2 p 0 4 ) 2 h 2 0 溶于蒸馏水中，加热至6 0 8 04 c ， 然后按照c a p 摩尔比约为1 6 7 加入一定量的c a ( o h h 饱和溶液，快速搅拌， 放嚣2 4 小时，倒去上清，将沉淀物进行冷冻干燥得到粉体备用，材料标记为 h a p i 。 2 h a p 2 制备方法：按照c a p 摩尔比为1 6 7 称取定量的c a ( n 0 3 ) 2 4h 2 0 、 ( n h 4 ) 2 h p 0 4 和与c a 离子等摩尔量的柠檬酸，分别用蒸馏水溶解，配成溶液， 混合，调节其p h 值在3 左右，7 0 8 0 。c ：! j h 热蒸发得一透明溶胶，1 2 04 c 干燥 得到干凝胶，最后在7 5 0 焙烧得到粉体，材料标记为h a p 2 。 3 h a p 3 制备方法：按照c a p 摩尔比为1 6 7 称取一定量的c a ( n 0 3 ) 2 4h 2 0 和 ( n h 4 ) z h p 0 4 ，分别用蒸馏水溶解，配成溶液，然后混合搅拌，放置2 4 小时， 武汉理。j ：人学硕十学位论文 倒去上清，将沉淀物放入烘箱中进行干燥得到粉体，最后在9 0 0 。c 焙烧得到 粉体，材料标记为1 4 _ a p 3 。 4 h a p 4 制备方法：首先将c a ( h 2 p 0 4 ) 2 h 2 0 溶于蒸馏水中，然后按照c a p 摩 尔比约为1 6 7 加入一定量的c a ( o h ) 2 饱和溶液，快速搅拌，加入添加剂肝素 超声处理，直至溶胶稳定，然后进行冷冻干燥得到粉体备用，材料标记为 h a p 4 。 5 h a p 5 制备方法：首先将c a ( h 2 p 0 4 ) 2 h 2 0 溶于蒸馏水中，然后按照c a p 摩 尔比约为1 6 7 加入一定量的c a ( o h ) 2 饱和溶液，快速搅拌，加入添加剂血清 白蛋白超声处理。至溶胶稳定，然后进行冷冻干燥得到粉体备用，材料标汜 为h a p s 。 2 2 材料的性能测试 将合成的h a p l 、h a p 2 、h a p 3 、h a p 4 、h a p 5 等样品经相应的处理后用激 光粒度仪检测其平均粒径及分布；n 2 法测定比表面积；红外光谱分析其组成成 分；并选取h a p i 、h a p 2 、h a p 4 、h a p 5 用透射电镜观察形貌。 2 2 1 样品的平均粒径及分布趋势 由于未加添加剂的h a p t 团聚严重，无法用激光粒度仪检测，本实验将用透 射电子显微镜观察其形貌。图2 1 ，2 2 ，2 3 ，2 - 4 显示的是动态激光散射测试的 h a p 2 ，h a p 3 ，h a t 4 ，h a p 5 的粒径及其分布的分析结果，图中对应的曲线是光 强度统计分布。h a p 2 ，h a p 3 ，h a p 4 ，h a p 5 四种h a p 粒子，由光强度统计的 平均粒径分别为7 5 6 5 n m ，1 9 0 6 6 n m ，8 7 3 n m ，1 0 5 5 n m ，h a p 2 分布在 1 0 1 5 r m a 4 6 2 7 6 n m 之间，主要集中在3 9 0 8 n m 9 6 0 0 n m ( f i g 2 1 ) ；h a p 3 分布在 1 7 1 0 r i m 1 5 7 1 9 2 n m ，主要集中在8 4 3 2 n m 2 4 4 3 o n m 之间( f i g 2 2 ) ；h a p 4 分布 在1 6 5 n m - 4 0 7 2 r m a 之间，以5 1 2n i n 1 0 8 1 n m 为主( f i g 2 3 ) ：h a p 5 的分布在 3 2 3 n m 1 6 2 3 n m ，以6 4 6 n m 一1 6 2 3 n m 为主( f i g 2 4 ) 。从统计的数据看，从h a p 2 、 h a p 3 样品大颗粒所占的比例明显高于h a p 4 、h a p 5 ，致使粒子的粒径集中分却 区域也向大粒径方向偏移。体积统计的平均粒径分别是3 9 6 5 9 9 1 4 3 8 0 6 0 n r n ， 1 8 6 1 4 7 1 8 5 8 n m ，4 1 8 r i m ，6 8 3 n m 。h a p 2 样品出现了三个平均粒径，其中平均 粒径为3 9 6 5 n m 的颗粒占2 7 3 ，平均粒径为9 9 1 4 n m 的颗粒占6 9 9 ，平均粒 径为3 8 0 6 0 n m 的颗粒占2 8 ；h a p 3 样品出现了两个平均粒径，其中平均粒径 为1 8 6 1 4 n m 的颗粒占2 0 4 ，平均粒径为7 1 8 5 8 n m 的颗粒占7 9 6 ，这是由于 大颗粒数量增多造成的。数量统计的平均粒径分别为1 0 3 7 4 6 1 7 n m ， 武汉理上人学硕十学位论文 1 1 8 4 6 3 0 1 n m ，1 9 7 n m 4 6 2 n m ，测试结果显示 n p 2 分为两个平均粒径：1 0 3 7 r m a 的颗粒占6 3 o ，4 6 1 7 n m 的颗粒占3 7 0 ；h a p 3 也出现两个平均粒径：1 1 8 4 1 矾 的颗粒占3 2 3 ，6 3 0 1 n m 的颗粒占6 7 o 。这也说明h a p 2 和h a p 3 的大颗粒数 量明显多于h a p 4 和h a p 5 。 铲 主 1 0 5 镕1 6 口 。 掌 1 0 5 s i z ed i s t b u t i o n ( s ) 八 | f 夕 r 5 0 1 0 8 5 0 0 1