（应用化学专业论文）微环境对PPL在SBA15上固定化及固定化酶性能的影响.pdf

摘要 微环境对p p l 在s b a 1 5 上固定化及固定化酶性能的影响 摘要 本文以s b a - 1 5 为固定化酶载体，利用较大孔径的s b a - 1 5 与酶 分子之间的较弱相互作用，实现了酶的固定化，考察了不同几何微环 境和化学徼环境s b a - 1 5 对猪胰脂肪酶( p p l ) 扩散吸附的影响，以 及化学微环境对固定化酶性能的影响。 利用水热合成法合成s b a - 1 5 ，除采用加入扩孔剂t m b 方法，又 提出了通过调变晶化温度来实现s b a 1 5 孔径的调变，在1 0 0 。c 1 4 0 c 晶化温度范围可以合成孔径为6 n m 至1 1 0 r i m 的s b a - 1 5 ，调变晶化温度 法合成的s b a 1 5 的有序度和均一度明显高于通过加入t m b 法合成的 s b a o l 5 。利用原位合成法将二甲基或二异丙基基团引入到介孔材料 的孔道中，产物s b a - 1 5 具有良好的介孔有序结构，表面含有烷基具 有疏水性质。 研究了以不同孔径和不同表面性质的s b a 1 5 载体上p p l 的扩散 吸附行为，并用三种常见的动力学模型：准一级、准二级和粒内扩 散模型对吸附动力学数据进行拟合，发现准一级动力学模型不符合， 粒内扩散模型部分符合，准二级动力学模型很符合s b a - 1 5 吸附p p l 过程，由二级动力学常数计算出的的吸附阶段的活化能表明p p l 在 s b a - 1 5 中扩散吸附过程属于物理吸附过程。进一步对p p l 在s b a - 1 5 孔道中扩散吸附过程进行研究，采用蛋白质在圆柱形孔道中的限制 北京化工大学硕士学位论文 性扩散方吸附方程对动力学数据进行拟合，得出p p l 在孔径较小或 者在烷基改性的s b a - 1 5 固定化过程主要由扩散控制，随着孔径的增 大扩散作用减弱，p p l 在s b a 1 5 内表面的吸附作用越来越明显。 改性后的s b a 1 5 与未改性的s b a 1 5 固定化酶进行对比，固定 化效率和催化性能更优。固定化酶与游离酶相比，固定化酶的最适温 度、p h 稳定性、热稳定性和储藏稳定性与载体的微环境有很大的关 系。 关键词：s b a 1 5 ，酶，表面性质，微环境，内扩散，稳定性 i l 摘要 i m m o b i l i z e dp r o c e s sa n ds t a b i l i t yo fp p l a s s e m b l e do ns b a 1 5m e s o p o r o u sm 睛t e r i a l s ： e f f e c t so fp h y s i c a la n dc h e m i c a l m i c r o e n v i r o n m e n t a b s t r a c t s b a o l 5 ，a st h eh i g hs u r f a c ea r e a , l a r g ep o r e sa n da b u n d a n th y d r o x y l g r o u p so nt h es u r f a c eo fm e s o p o r o u sm a t e r i a l ，i su s e da st h es u p p o r tf o r i m m o b i l i z a t i o no fp o r c i n ep a n c r e a t i c l i p a s e ( p p l ) t h i sd i s s e r t a t i o n f o c u s e so nt h ee f f e c to fm i c r o - e n v i r o n m e n to nt h ei m m o b i l i z i n gp r o c e s s a n ds t a b i l i t yo f p p la s s e m b l e do ns b a - 1 5m e s o p o r o u sm a t e r i a l h i 曲l y o r d e r e dh e x a g o n a lm e s o p o r o u sm a t e r i a ls b a - 1 5w i t h d i f f e r e n tp o r es i z e sw a sp r e p a r e dv i at w om e t h o d s ：u n d e rd i f f e r e n t c r y s t a l l i z a t i o nt e m p e r a t u r e ss y n t h e s i sa n db yt h ea d d i t i o no fc o = s o l v e n t o r g a n i cm o l e c u l e s1 ，3 ，5 - t r i m e t h y l b e n z e n e ( t m b ) ，u s i n gn o n i o n i c t r i b l o c kp 1 2 3a st e m p l a t e i tw a sf o u n dt h a ts b a 1 5h a dm o r eo r d e r e d h e x a g o n a lp o r e su n d e rd i f f e r e n tc r y s t a l l i z a t i o nt e m p e r a t u r et h a na d d i n g t m bt oe x p a n dt h ep o r es i z e so ft h es b a - 1 5 t w of u n c t i o n a l i z e d i l l 北京化工大学硕士学位论文 s b a - 1 5 - t y p em o l e c u l a rs i e v e sw i t hd i m e t h o x ys i l a n e ( d 峋，d i i s o p r o p y l d i m e t h o x ys i l a n e ( d i p ) ，r e s p e c t i v e l y , w e r ep r e p a r e db ys i l o x y p r o p a n e t e t h e r st ot h es i l i c e o u ss u r f a c eo fs b a - 1 5v i ai ns i t us y n t h e s i s ，w h i c ht h e s i l i c e o u ss u r f a c eo fs b a - 15h a v eb e e na l k y l i z e dw i t hd i f f e r e n td e g r e e h y d r o p h o b i c i t y p o r c i n ep a n c r e a t i cl i p a s e ( p p l ) h a sb e e ns u c c e s s f u l l yi m m o b i l i z e d i nt h em e s o p o r o u sc h a n n e l so fs b a - 1 5w i t hd i f f e r e n tp o r es i z ea n d d i f f e r e n ts u r f a c ec h a r a c t e r s 。t h r e ek i n e t i cm o d e l sv i z t h ep s e u d o f i r s t o r d e r , t h ep s e u d o s e c o n do r d e ra n dt h ei n t r a p a r t i c l ed i f f u s i o nm o d e l s w e r eu s e dt os i m u l a t et h ee x p e r i m e n t a ld a t a i tw a sf o u n dt h a tt h e p s e u d o - f i r s to r d e rk i n e t i cm o d e l c a nn o tb eu s e dt ot h ea d s o r p t i o np r o c e s s t h ep s e u d o s e c o n do r d e rk i n e t i cm o d e lc o u l db eu s e dt od e s c r i b et h e a d s o r p t i o np r o c e s s m o s ts a t i s f a c t o r i l y t h ei n t r a p a r t i cd i f f u s i o nw a s p r e s e n t ，b u tn o tt h eo n l yr a t e c o n t r o l l i n gs t e p i n o r d e rt os t u d yt h e h i n d e r e dd i f f u s i o n ，ac o n t i n u i t ye q u a t i o nf o rap r o t e i ni nc y l i n d r i c a lp o r e w a sa d o p t e d t h es m a l l e rp o r ed i a m e t e ro ra l k a n ef u n c t i o n a l i z e di n n e r s u r f a c eo f t h es b a 一1 5a sh o s t sf o re n z y m ei m m o b i l i z a t i o nh a ss i g n i f i c a n t e f f e c t so nt h ei n t e r n a ld i f l u s i o n d i f f u s i o nf u n c t i o nw e a k e n e dw h i l et h e a d s o r p t i o ne f f e c t so f p p l o ni n n e rs u r f a c eb e c a m e m o r ea n dm o r ed i s t i n c t c o m b i n e dw i t ht h ee n l a r g i n gp o r ed i a m e t e r s c o m p a r i n g w i t h p u r e l y s i l i c e o u ss b a 一15 ，t h ef u n c t i o n a l i z e d s b a - 1 5h a sm o r ee f f i c i e n c yi nt h ee n z y m ei m m o b i l i z a t i o n t h e i v 荷蔓 c h a r a c t e r so ft h ei m m o b i l i z e de n z y m ew e r ea l s os t u d i e da n dc o m p a r e d w i n l 丘e ee n z y m e t h er e s u l t ss h o wt h a tt h eo p t i m u m t e m p e r a t u r eo f p p l i si n c r e a s e da f t e ri m m o b i l i z a t i o n ；a n dt h es t a b i l i t i e so ft h ei m m o b i l i z e d 既z y i t l e o fp hv a l u ew e r el o w e rt h a nf r e ee r l z y n l e ，h o w e v e r , t h e t h e r m o s t a b i l i t ya n ds t o r e d s t a b i l i t yw e r eo b v i o u s l yh i g h e r k e y w o r d s ：s b a - 1 5 ，l i p a s e ，s u r f a c ep r o p e r t y ，m i c r o e n v i r o n m e n t , v 北京化工大学硕士学位论文 符号说明 p p l 初始浓度，m g l - 。 s b a 1 5 孔道中p p l 的浓度，m g l - 1 溶液中p p l 的平衡浓度，m g l - 1 f 时刻p p l 浓度，m g l - 1 p p l 在液相中的扩散系数，i n 2 f 1 有效传质系数，m 2 s - 1 活化能，k j m o t f r e u n d l i c h 常数 l a n g m u i r 吸附等温线常数，l m o t l p p l 分子半径，i l m 溶液体积，l 温度，k p p l 分子长轴长度，h i l l p p l 分子短轴长度，n l l l 准一级动力学常数，m i n - 1 准二级速率常数，g m g - 1 m i n - 1 吸附速率因子，l t o o l - 1 m i n - 1 玻尔兹曼常数，j k 1 脱附速率因子，m i n - 1 粒内扩散速率常数，n a g g - 1 m i n - o 5 f r e u n d l i c h 等温方程中非线性系数 s b a - 1 5 的用量，g s b a - 1 5 的平衡吸附量，m g g - 1 s b a 一1 5 的最大吸附量，n a g g - 1 t 时刻的吸附量，m g - g - 1 s b a 1 5 孔道长度，m p p l 溶液粘度，g - e r a - i , s - 1 p p l 分子直径与孔径之比 v i q c e q d乜e砟r矿r 口6皇如匕如k t 野 m 吼吼= 声z 北京化工大学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下， 独立进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本 论文不含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文 的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本 人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。 作者签名： 基塑 日期： 迎乙：! i 关于论文使用授权的说明 学位论文作者完全了解北京化工大学有关保留和使用学位论文 的规定，即：研究生在校攻读学位期间论文工作的知识产权单位属北 京化工大学。学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印 件和磁盘，允许学位论文被查阅和借阅；学校可以公布学位论文的全 部或部分内容，可以允许采用影印、缩印或其它复制手段保存、汇编 学位论文。 非保密论文注释：本学位论文不属于保密范围，适用本授权书。 作者签名：雌坦日期： 兰塑z ： ! f f 导师签名： 第一章绪论 1 1 酶的概述 第一章绪论 酶是生物为提高其生化反应效率而产生的生物催化剂，其化学本质为蛋白 质，少数酶同时含有少量的糖和脂肪。在生物体内，所有的反应均在酶的催化作 用下完成，几乎所有生物的生物现象都与酶的作用紧密联系 1 1 1 酶结构特点 酶蛋白是由2 0 种氨基酸残基组成的生物大分子【”。2 0 种氨基酸结构类似， 均为l 吨氨基酸，其中仅甘氨酸为非手性氨基酸。氨基酸间通过脱水形成酰胺键， 在蛋白质化学中又称肽键。肽键将氨基酸连接形成长链聚合物称为多肽链，链中 的氨基酸称为残基。酶蛋白可以是单链，也可以是由几条链组成的寡聚体。酶蛋 白一般为球状蛋白。 酶蛋白的一级结构：不同的蛋白质具有不同的氨基酸组成和排列顺序蛋白 质多肽链中氨基酸残基的组成和排列顺序称为蛋白质的一级结构。许多酶蛋白的 一级结构已经确定，组成酶蛋白的多肽链一般由1 0 0 8 0 0 个氨基酸残基构成。 酶蛋白的二级结构：酶的二级结构单位主要是a 螺旋、p 折迭片、p - 转角和 无规则卷曲四种。酶蛋白在一级结构的基础上进一步盘旋折迭，又以一定规则的 氢键形成甜螺旋、b 折迭层、p 转角和自由遇转等二级结构。氢键是维持二级结 构稳定的主要作用力。 酶蛋白的三级结构：这些二级结构单元迸一步盘曲折迭，形成球状分子，即 三级结构。稳定酶蛋白的三级结构的主要作用力有氢键、盐键、疏水键、二硫键 等，酶蛋白中每条完整的肽链被称为亚基。 酶蛋白的四级结构：如果酶蛋白有四级结构，则必具有二条或更多条肽链。 现有已知的酶，除少数单体酶外，大多数酶是由多个亚基组成的寡聚体球状分 子表面以疏水作用力、范德华力、盐键及氢键等非共价键互相联结起来，而成为 完整的酶分子。 酶的活性中心：酶的活性中心是指酶蛋白分子中与催化有关的特定区域，它 能与底物结合并发挥催化作用。酶的活性中心一般位于酶分子的表面，具有特定 的空间结构，其中包括底物结合部位和催化部位活性中心的空间结构是由整个 酶蛋白质结构所决定的，破坏了酶蛋白的整个结构，必然破坏酶的活性中心，从 而使酶丧失催化活性。因此酶蛋白活性中心以外的其余部分不仅有维持结构的作 北京化工大学硕士学位论文 用，同时还有保护微环境的作用。酶分子的亲水性强弱，整个分子的电性、电荷 分布，以及活性中心周围的环境都由整个酶蛋白的结构决定，这对于酶的催化特 性具有重要意义。酶活性中心的一些化学基团是酶发挥催化作用所必需的基团， 故称为必需基团。对于单体酶而言，一个分子中只有一个活性部位：含辅基的酶， 辅基分子常常结合在这一区域，参与构成活性部位的一部分。 酶构象的柔顺性：酶构象的柔顺性是指酶在溶液中具有较为柔顺的结构，能 以多种构象状态存在，在底物诱导下，构象改变为适宜于结合底物的状态。酶在 结晶状态时具有较大的刚性，但是有一些酶在晶状时也表现缓慢的催化活性。 1 1 2 酶催化特性 由于酶在常温常压的温和条件下具有高效的催化作用，并具有很高的专一 性，许多难以进行的有机化学反应在酶催化下都能顺利进行，且可以避免或减少 副反应，因而酶在工农业生产实践中蕴藏着巨大的潜力。世界范围内，每年食品、 去垢剂、精细化工和诊断用酶的销售额达七亿美元，以酶为催化剂的新工业过程 数量和酶的市场需求量将持续增加。 作为生物催化剂的酶，它具有与一般无机物或低分子有机催化剂的共性：降 低反应的活化能，加快反应速率，不改变反应的方向和化学平衡关系，反应结束 时本身不消耗。但除此之外，酶作为生物催化剂还具有以下特性 2 1 ：( 1 ) 有较高 的催化效率；( 2 ) 很强的催化专一性；( 3 ) 具有温和的反应条件；( 4 ) 酶催化是可 调控的：如抑制剂调节、共价修饰调节、回馈调节、酶原启动及激素控制等。 1 1 ，3 酶催化反应机制 酶催化反应的机制有两种学说口】，最早提出的是锁钥学说，在此基础上发展 了诱导学说。 ( 1 ) 锁钥学说：酶发生催化作用首先必须与底物接近，酶与底物形状互补， 然后通过两者间相互作用，形成各种非共价键或共价键，组成酶与底物的复合物。 酶和底物间的严格互补关系被比喻为锁与钥匙的关系，称为锁钥学说( 见图1 1 ) 。 但是还有一些问题是这些学说所不能解释的：如果酶的活性中心是“锁与钥匙学 说”中的锁，那么，这种结构不可能既适合于可逆反应的底物，又适合于可逆反 应的产物。丽且，也不能解释酶的专一性中的所有现象。 ( 2 ) 诱导学说：现代科学研究发现酶与底物结合时，伴随着酶分子构象的改 变，使酶分子中起催化作用的氨基酸残基处于适当的位置，同样底物分子的构象 也发生相应的变化。因此，k o s h l a n d 提出酶分子与底物分子结合时是一个动态的 诱导楔合过程，各自构象的改变有利于酶与底物的结合，有利于酶发生催化作用， 2 第一章绪论 这种学说被称为诱导学说( 见图1 - 2 ) 。事实上通过旋光测定，了解到许多酶在它 们的催化循环中确有构象的变化，特别是x 射线衍射分析发现未结合底物的自 由羧肽酶与结合了甘氨酰酪氨酸底物的羧肽酶，在构象上有很大的区别；溶菌酶 的x 射线衍射分析了也得到类似的结果，这些都是支持“诱导学说”假说的有力 证明。 图i - 1 酶与底物的“锁与钥匙关系” 学说示意圈 f i 驴他1 - 1s c h e m a t i ci l l u s c s t m f i o no f k e y - l o c k h y p o m 醯 1 1 4 脂肪酶概述 图i 2 酶与底物的“诱导楔合” 假说示意图 l 嗨u r e1 - 2s c h e m a t i ci l l u s e s w 商o no f i n d u c e d - w e d g eh y p o t h e s i s 酶的种类很多，根据酶催化的反应类型，1 9 6 1 年国际生物化学联合会酶学 委员会将酶分为六大类：氧化还原酶( o x i d o r e d u c t a s c , e c1 x 置x ) ，转移酶 ( u 锄s f e r a s e ，e c2 x x x ) ，水解酶( h y d r o l a s e ，e c3 x 蔗x ) ，裂合酶( 1 y a s e ，e c4 x x x ) ， 异构酶( i s o m 船a s e ，e c5 x 。【) 【) 和连接酶0 i g a s e ，e c6 x x a ) 在众多的酶中，氧化还原酶、水解酶在光学活性药物合成中的应用尤其突出。 脂肪酶是水解酶，在生物催化反应中，有3 0 以上的研究涉及到脂肪酶卜7 1 ，这 类酶在手性技术中正发挥着越来越重要的作用。由于酶催化反应的高效性、高立 体选择性及温和的反应条件使得酶催化拆分法可用于某些用一般方法难以拆分 的手性化合物。以脂肪酶为手性拆分催化剂，具有价格低廉、不需辅酶、拆分反 应操作简便、拆分效率和立体选择性高等特点，已成功地用于光学活性药物及其 合成子的制备。所以在本论文的研究中，首先选择了脂肪酶作为研究对象 1 1 4 1 脂肪酶结构特点 大多数脂肪酶是单体酶，它们通常由一条肽链组成，一般不需要辅因子尽 管各种不同来源的脂肪酶在结构上有不同特点，但基本结构及活性中心结构是相 似的嘲 3 p 穆 北京化工大学硕士学位论文 o 氨基酸 图1 3 氨基酸的结构 f i g u r e1 - 3c o n f i g u r a t i o no f a m i n oa c i d 不变部分 可变部分 组成脂肪酶的2 0 种基本氨基酸分别是甘氨酸( g l y c i n e ) 、丙氨酸( a l a n i n e ) 、 缬氨酸( i n e ) 、亮氨酸( l e u c i n e ) 、异亮氨酸( u e u c i n e ) 、脯氨酸( p r o l i n c ) 、 甲硫氨酸( m e t h i o n i n e ) 、半胱氨酸( c y s t e i n e ) 、苯丙氨酸( p h e n y l a l a n i n e ) 、酪 氨酸( t y r o s i n e ) 、色氨酸( t r y t o p h a n ) 、精氨酸( a r g i n i n e ) 、赖氨酸( l y s i n e ) 、 组氨酸( h i s t i d i n e ) 、天冬氨酸( a s p a r t a t e ) 、谷氨酸( g l u t a m a t e ) 、丝氨酸( s e r i n e ) 、 苏氨酸( t h r e o n i n e ) 、天冬酰胺 ( a s p a r a g i n e ) 、谷酰胺( g l u t a m i n e ) ，除甘氨 酸和脯氨酸外，其它均具有一样的结构通式( 图1 3 ) 。 1 1 4 2 脂肪酶界面活化原理 脂肪酶的特点是在不溶性的硫水底物反应中活性比较高，这一特点对发生在 含不溶性底物和水相界面上的反应机理具有至关重要的作用。脂肪酶被它的非极 性底物活化，这一现象称作脂肪酶的界面活化 9 - 。 脂肪酶的界面活化现象是1 9 3 6 年由h o l w e r d a 等最早观察到的，接着在1 9 4 5 年s c h o n j a e y d e r 和v o l q v a r t z 也发现了这一现象。多年来人们一直在讨论关于界面活 化的基本结构背景。d e s n u e l l e 等推测脂肪酶分子吸附在界面以后发生了构象变 化。b r o c k e r h o f 瘌j a n s c n 则提出了所谓的底物理论，这一理论强调了油水界面上 底物的状态和浓度的重要作用。1 9 9 0 年，两种脂肪酶的三维结构被首次描述，确 认了早期理论的合理性，从而解释了脂肪酶的界面活化现象。如人胰脂肪酶 ( 珏 l ) 的表面有一个螺旋结构，也就是通常所说的盖子覆盖了酶的活性中心， 使得活性中心无法暴露于溶剂中，而这个螺旋结构只有在油水界面才会发生构 象变化。后来脂肪酶结构的进一步研究发现，除了个别的几种脂肪酶，其它所有 为人知的脂肪酶都有一个螺旋结构的多肽区域覆盖在酶分子的活性中心。这个区 域被称为“盖子”( “l i d ) 。盖子上有一个色氨酸残基的侧链插入活性部位，此盖 子是双亲性的，内表面由于存在色氨酸而体现为疏水性，能和活性中心周围的疏 水性残基相互作用，盖子暴露在外的部分则是亲水性的，通过氢键与外面的一些 水分子发生作用。只有当脂肪酶接触到水油界面时，这个短的0 【螺旋片断( 盖 子) 才会折回，此盖子向后翻卷进入一个亲水性的沟，暴露出酶的活性中心和盖 子的疏水性表面，产生了一个大的疏水性区域，这时的酶处于活化状态，对底物 4 第一章绪论 进行催化反应。当缺少这样的界面时，酶的活性部位被盖子保护起来，阻止了底 物同酶催化活性中心的接触。因此对于脂肪酶的水解反应，水油界面的形成是 关键。g r o c h u l s k i 等发现c r u g o s a 脂肪酶在低的离子强度的溶剂中，酶分子的空 间构象以开放的形式存在。脂肪酶对水溶性的底物表现出比较低的酶活力，因为 这时盖子盖住了他们的活性中心。当水不溶性底物与脂肪酶分子接触时，酶分子 发生了构象变化，在这种作用的诱导下，盖子不再覆盖在活性中心处，脂肪酶呈 现一种半敞开的结构( o p e ns t a t u t e - e ) ，从而使得底物更易接近催化中心，发生 界面活化作用，酶活性提高 但自从发现假单胞菌脂肪酶( p s c u d o m o n a s a c r u g i n o s a ) 虽然有螺旋结构的盖 子，却不会发生界面活化，人们意识到赛面活化远比想象的复杂。此弗，葡萄状 球菌脂肪酶( s t a p h y l o c o c c u s 蛳c u s ) 也只对一部份不溶性底物活化。目前，关 于界面活化机理还在进一步研究中 图l 一4 脂肪酶的界面活化示意图 r i 弘r e1 - 4o p e na n dc l o s e d n f o r m a t i o n so f t h el i p m 1 1 4 3 脂肪酶的应用 脂肪酶原指甘油酯水解酶。以其来源广、催化功能多以及催化底物广泛( 酯、 酸、醇、酸酐、酰胺等都可以成为它的底物) 的优势使其成为生物技术及有机合 成方面应用最广泛的一类酶，广泛应用于油脂、食品、香料、化妆品、医药、农 药等有机合成领域中 ( 1 ) 水解反应【1 7 】 北京化工大学硕士学位论文 水解反应是指脂肪酶催化脂肪或酯水解为其组分脂肪酸和甘油或醇。利用脂 肪酶水解油脂的能力可获得重要的轻化工原料脂肪酸和甘油。用于这种目的的脂 肪酶包括来自c a n d i d am g o s a ，p s e u d o m o n a s hu o r e s c en 和蓖麻种子( c a s t o rb e a n ) 等的脂肪酶。水解的底物包括各种植物油如大豆油、蓖麻油、橄榄油等和动物油 如牛脂、羊脂和鱼油及其酯类。如由蓖麻油( c a s t o ro i l ) 水解生产蓖麻酸，由于脱 水、内酯化等副反应它不能用传统的蒸气裂解方法由蓖麻油生产，用来自蓖麻种 子的脂肪酶水解蓖麻油，则可避免这些弊端，该工艺已实现商业化生产。除墨组 分中加入2 0 0 u 的p s e u d o m o n 船脂肪酶可使油脂水解，纸的白度从5 6 提高到5 8 。 ( 2 ) 合成反应 目前，关于脂肪酶的催化合成反应方面的应用的注意力主要集中在不对称合 成和酯交换。 不对称合成是绿色化学的重要组成部分【博1 。目前，用于拆分外消旋化合物 的酶多数是水解酶，而且绝大多数为脂肪酶。手性化合物在人们生活中具有重要 作用，目前绝大多数化学合成药物都是以外消旋混合物形式生产销售。实际上， 其药物作用包括酶的抑制、膜的传递、受体结合等，均和药物的立体构型有关。 此外，只含单一对映体的各类手性物质势必极大地减少其对环境的污染，这也是 环保方面所提出的重要课题。因此，光学活性化合物的制备已成为众人注目的焦 点，世界各国许多著名大学和研究机构纷纷致力于该领域的研究。与传统的化学 方法相比，酶催化拆分外消旋化合物具有反应条件温和、节省能源、专一往强、 副反应少、产品纯度高、反应步骤简单、不需手性源、产品成本低等优点。与微 生物法相比，酶法反应时间短、条件易控制、产品纯度高。随着非水分质酶学的 发展，为解决外消旋化合物的拆分，特别是外消旋醇的拆分这一难题带来了希望。 o l i v e r 等用假丝酵母脂肪酶( c a n d i d a a n t a r c t i c a ) 手性合成了( s ) d a p o x e t i n e ，产率近 1 0 0 。 利用l ，3 一定向脂肪酶催化油脂进行定向酯交换的特性，有实际意义的应用是 利用廉价油脂经过改性而生产珍贵油脂，目前在油脂工业上研究最多也最有研究 价值的类可可脂和生物柴油的生产。近年来，随着石油资源的逐渐枯竭和公众环 保意识的增强，可再生的绿色环保型燃料一生物柴油，受到了许多国家的重视。 生物柴油，即动植物油脂与低碳醇进行醋交换反应所生成的脂肪酸低碳醇醋，具 有良好的燃料特性、含硫量低，可替代矿物柴油作为内燃机的燃料。生物柴油主 要是在催化剂作用下通过醋交换反应来制备。反应使用的催化剂可以是酸、碱或 酶。相较酸碱催化剂，酶法合成生物柴油具有反应条件温和、醇用量小、后处理 简单、无污染物排放等优点，而且原料油中的自由脂肪酸能完全转化成甲醋。尤 6 第一章绪论 其是采用固定化酶，反应结束后酶易回收，可多次循环利用，大大降低了生产成 本，显示出良好的应用前景n o u r e d d i n 等用溶胶凝胶固定化假单胞菌脂肪酶 ( p s c u d o m o n a sc , e p a e i a ) 将大豆油改性为生物柴油，l 小时可得6 7 的产率 1 1 5 酶制剂中存在的问题 酶的催化优点大大促进了人们对酶技术的研究和开发，使酶在各个领域中的 应用越来越广但是，由于酶是生物体根据自身需要而产生的，它们在实际应用 中还有很大限制。其原因有1 1 ，7 ：( 1 ) 由于有些酶的提取纯化繁琐，所以它们的价 格十分昂贵；( 2 ) 反应后的酶无法回收再利用，只能采取分批法生产手段，不能 实现连续化操作，且由于产物中酶的残留，造成提纯工艺复杂，降低了产品的性 能：( 3 ) 大量的氧化还原酶、转氨酶等需要等计量反应物的辅因子存在才能表现 催化活性，从而限制了它们在许多有机合成反应中的应用；( 4 ) 酶通常在水溶液 中实施其催化活性，对于大多数有机化学反应来说，使用的溶剂是非水溶性的有 机溶剂；( 5 ) 酶对环境极敏感，易变性与失活。体现在 缸在催化反应过程中，游离酶是水溶性的催化剂，容易发生微生物的降解 或聚集而失活； b 酶的稳定性一般较差，极端的p h 值、较高的温度和高盐浓度的反应体系 都可能使酶钝化，失去部分甚至大部分催化活性，有些酶即使在较合适 的条件下使用，也会很快失去活性； c 酶的化学本质是蛋白质，因而具有蛋白质的所有性质。其中容易变性的 性质，使得酶在应用时，常因变性而活力下降，甚至完全失去活力，即 失活。酶的变性多数为不可逆。引起交性的原因有物理因素及化学因素。 物理因素包括热、紫外线、x 射线、声波等；化学因素包括酸、碱、表 面活性剂、重金属盐等化学药品的影响。因而产生了诸如热变性、酸碱 变性、氧化变性等。引起酶的构象改变，而降低或失去活性。 所以目前尽管已发现了上千种酶，但真正在工业生产上能够得到实际应用的 不足1 0 0 种。 怎样才能获得理想的生物催化荆? 如果能设计一种方法，将酶束缚于特殊的 相，使它与整体相( 或整体液体) 分隔开，但仍能进行底物和效应物( 启动剂或 抑制剂) 的分子交换。这种固定化的酶可以像一般化学反应的固定化催化剂一样， 既具有酶的催化物性，又具有一般化学催化剂能回收、反复使用等优点，并且生 产工艺可以连续化、自动化。2 0 世纪5 0 年代发展起来的固定化技术正是基于这 一目的发展起来的。 7 北京化工大学硕士学位论文 1 2 固定化酶概述 酶作为一种生物催化剂，一经发现就被人们广泛应用于在酿造、食品、医药 等领域。由于酶可以在常温、常压等温和条件下高效地催化反应，一些难以进行 的化学反应在酶的催化下能顺利地完成。酶的开发利用在2 0 世纪初得到了巨大的 发展，但由于酶的稳定性低，使用后难以回收，在实际应用中也就带来了很多问 题，从而限制了酶制剂产品的使用和开发。1 9 1 6 年n e l s o n 和g r i f m 2 0 1 发现了酶的 固定化现象后，科学家就开始了固定化酶的研究工作。1 9 6 9 年【2 l 】日本一家制药 公司第一次将固定化的酞化氨基酸水解酶用来从混合氨基酸中生产l 一氨基酸，开 辟了固定化酶工业化应用的新纪元。 1 2 1 固定化酶概念 固定化酶最初是将水溶性酶与不溶性载体结合起来，成为不溶于水的酶的衍 生物，所以曾叫过“水不溶酶”( w a t e r i n s o l u b l ee n z y m e ) 和“固相酶”( s o l i d p h a s e e n z y i i l e ) 。但是后来发现，也可以将酶包埋在凝胶内或置于超滤装置中，高分子 底物与酶在超滤膜一边，而反应产物可以透过膜逸出，在这种情况下，酶本身仍 处于溶解状态，只不过被固定在一个有限的空间内不能自由流动。因此，用水不 溶酶或固相酶的名称就不恰当了。在1 9 7 1 年第一届国际酶工程会议上，正式建 议采用“固定化酶”( i m m o b i l i z e de n z y m e ) 的名称。它是通过物理或化学的方法 使溶液酶转变为在一定的空间内其运动受到完全约束、或受到局部约束的一种不 溶于水，但仍能进行其特有的催化反应、并可回收及重复使用的酶。它能以固相 状态作用于底物进行催化反应。 1 2 2 固定化酶的优点 固定化酶在保持其高效、专一及温和的酶催化反应特性的同时，具有以下优 点 2 2 1 ： ( 1 ) 在催化反应以后很容易从反应系统中分离出来，不仅固定化酶可以反复 使用，使酶的使用效率得到提高，使用成本降低，尤其适合于使用贵重酶。 ( 2 ) 固定化酶极易与反应体系分离，可获得不被酶污染的、纯度较高的产物， 简化了提纯工艺，提高了产量和产品质量。 ( 3 ) 在大多数情况下，酶在固定化后稳定性得到较大提高，可较长期地使用 或贮藏。 ( 4 ) 固定化酶有一定的形状和一定的机械强度，可以搅拌或装柱的方式作用 于底物溶液，使反应过程能够管道化、连续化和自动化。 8 第一章绪论 ( 5 ) 酶的催化反应过程更易控制如使用填充式反应器时，一旦底物不与酶 接触，即可使酶反应终止。 ( 6 ) 比可溶酶更适于多酶体系的使用，不仅可利用多酶体系中的协同效应使 酶催化反应速度大大提高，而且还可以控制反应按一定顺序进行 辅酶固定化和辅酶再生技术，使固定化酶和能量再生技术或氧化还原体 系合并使用，从而扩大其应用范围。 因此固定化酶在生产中的应用日渐增多，为酶催化的应用开辟了新的途径。 固定化酶在医药和食品等工业部门有着很大的实用价值。如用固定化氨基酸酰化 酶生产l 氨基酸、固定化青霉素酰胺酶水解青霉素g 生产6 - 氨基青霉烷酸、固 定化葡萄稽异构酶生产高果糖浆、固定化稽化酶生产葡萄糖等。 固定化酶的研究不仅具有重要的实际意义，而且还具有理论意义。酶促反应 机理的研究，是阐明生物体内各种复杂代谢过程及其调控的基础。研究固定化酶 有助于了解细胞的结构与功能。细胞内与呼吸链、蛋白质合成、主动运输及神经 传导等重要物理功能有关的酶都是天然的固定化酶，它们或者是在凝胶的环境 中、或者是吸附在界面上，或者是在线粒体一类的细胞器上发生作用。丽至今为 止的绝大多数的研究，都是将酶从天然支持物( 如膜) 上分离下来，使它处于一 种与天然细胞内不完全相同的状态下进行的，所以不易得到完全符合于机体的认 识理想的方法是将酶结合到细胞中的凝胶物质或天然酶等固相载体上。再来研 究细胞的多酶体系，固定化酶为之提供了一种良好的模型。 基于以上原因，固定化酶技术的研究颇受关注，其应用也日益广泛。 1 2 3 固定化酶的方法 根据专述和综述粗略统计，目前已经进行固定化的酶不下1 0 0 种，我国研究 者也对3 0 余种酶进行过固定化研究迄今为止，研究和应用的酶固定方法可归 纳为吸附法，共价偶联法，交联法，和包埋法四大类刚： 吸附法：这是通过载体表面和酶分子表面间的次级键相互作用而达到固定目 的的方法。根据吸附剂的特点又分为两种：物理吸附和离子交换吸附。 物理吸附是通过氢键、疏水键和舻电子亲和力等物理作用力将酶固定于不 溶性载体的方法。常用的载体有：高蛉土、皂土、硅胶、氧化铝、磷酸钙胶、微 孔玻璃等无机吸附剂，纤维素、胶原，赛珞以及火棉等有机吸附剂无机吸附剂 的吸附容量一般很低 离子交换吸附法是指在适宜的p h 值和离子强度条件下，利用酶的侧链解离 基团和离子交换基间的相互作用而达到酶固定化的方法。最常用的交换剂有c m - 纤维素、d e a e 纤维素、d e a e 葡聚糖凝胶等；其它离子交换剂还有各种合成的 9 北京化工大学硕士学位论文 树脂如d o w ex 5 0 、a m b e r l i t ex e 9 7 等。离子交换剂的吸附容量一般大于物理 吸附剂。 吸附法制备固定化酶的优点【2 4 】：( 1 ) 操作简单( 2 ) 可以充分选择不同电荷和 不同形状的载体( 3 ) 吸附过程可能同时达到纯化和固定化( 4 ) 这类固定化酶在 使用过程中逐渐失活后可以重新活化( 5 ) 固定化酶失活后，这类载体可以再生， 例如多孔硅胶可以用热处理或用强碱洗脱蛋白质，d e a e s e p h a d e x 可用n a o h 处理再生。 吸附法的不利之处：( 1 ) 最适酶量的选择是经验性的( 2 ) p h 值、离子强度、 温度和时间的选择对每一种酶和每一种载体也是个别决定的( 3 ) 吸附程度和固 定化酶的活力不一定是平行的( 4 ) 酶和载体之间结合力不强会导致催化活力的 丧失和沾污反应产物。因此对特定的酶和底物，要找到一种理想的吸附剂并不是 十分容易的。 共价偶联法：这是借助共价键将酶的活性非必需侧链基团和载体的功能基 团进行偶联制备固定化酶的方法。酶分子中的功能基团如n 端、赖氨酸- n h 2 、 一c o o h 、一s h 、一o h ( 包括酚羟基) 等都可能涉及到共价结合。多孔玻璃是常用 共价法的无机载体，其表面羟基通过硅烷基化连上功能基团氨基，然后用戊二醛 将酶分子与载体相连接。天然有机聚合物纤维素、琼脂糖、淀粉、甲壳等表面相 邻羟基可用溴化氰活化形成亚氨基碳酸酯，然后在p h 值7 8 的条件下亚氨基碳 酸酯与酶分子中氨基连接；载体表面羟基也可连接活化基团环氧基后再与酶连 接；若载体表面是羟基可以进行酰氯化，然后再与酶结合。 共价结合法是固定化酶研究中最活跃的一大类方法。共价法优点是酶与载体 之间的连接键很牢固，使用过程中不会发生酶的脱落，稳定性较好。缺点是载体 的活化或者固定化操作比较复杂，反应条件也比较剧烈。所以往往需要严格控制 条件才能获得活力较高的固定化酶。 交联法：即利用双功能或多功能试剂在酶分子间、酶分子与惰性蛋白间或 酶分子与载体间进行交联反应( c r o s s l i n k i n g ) ，以共价键制备固定化酶的方法。 常用的交联剂有戊二醛、已二酰亚氨酸二甲酯、辛二酰亚氨酸二甲酯、异硫氰酸 酯等。交联法操作简单，但交联反应往往比较激烈，许多酶易在固定化过程中失 效，酶回收率不高。但是这种方法的原理被用于交联酶晶体中，酶处于晶体状态 再交联将不会影响酶和活性，同时会增强酶的稳定性，并能提高其抵抗蛋白酶水 解的能力。 交联酶晶体1 1 1 ：( c r o s s - l i n k e de n z y m ec r y s t a l s ，c l e c ) 的报导给人们提供了一 种新的选择，交联酶晶体实际上是固定化酶的延续和发展。酶固定化制剂中酶含 量仅占5 ( 重量百分比) ，就相同的单位重量来说，c l e c 的酶活性比固定化酶 第一章绪论 的活性高得多目前，大约有1 5 种酶可制成c l e c 形式，其中5 种c l e c 催化 剂已进行商品化生产，并已达到公斤级生产规模。最近的研究工作表明交联酶晶 体催化剂能提高酶在有机溶剂中的稳定性、可耐受极端反应条件。c l e c 具有酶 催化的一般特性，又具有非均相化学催化剂的高稳定性和易回收的优点，交联酶 晶体催化剂在有机合成中有美好的应用前景 包埋法：这是将聚合物的单体和酶溶液混合后，再借助聚合促进剂( 包括交 联剂) 的作用进行聚合，将酶包埋于聚合物中以达到