（分析化学专业论文）食品中非蛋白质氨基酸和糖类测定的分析方法研究.pdf

桂林工学院硕士学位论文 摘要 本文分析的对象主要是存在于食品中被人体可直接吸食的非蛋白质氨基酸及 糖 由于不同的非蛋白质氨基酸和糖存在于不同的食品中 需要对不同的样品进行 不同的前处理 本文的研究内容主要围绕离子色谱分析技术展开 采用离子交换色 谱积分脉冲安培法技术对食品中各种样品进行测定 其内容包括三个方面 第一部分主要是综述了离子交换色谱积分脉冲安培检测法 h p i c i p a d 在氨基 酸和糖类化合物分析中的应用 通过这一部分的介绍 充分认识了h p i c i p a d 这种 方法在氨基酸和糖类化合物分析中重要性以及与其他分析方法相比较存在的优势 第二部分主要针对普遍存在于食品中 但较少被人们所关注的非蛋白质氨基酸 进行分析测定 本文主要采用h p i c i p a d 法对这些非蛋白质氨基酸进行分析研究 氨基酸无需进行衍生就能直接被检测 由于非蛋白质氨基酸大多是游离氨基酸 所 以在前处理时样品不需要进行水解 通过合适的水浴时间使其充分溶解在水溶液中 就能直接进样分析 本文采用n a o h 作淋洗液 不同的样品和分析对象选择不同浓 度的n a o h 或最佳的梯度淋洗条件 离子交换分离柱a m i n o p a c t mp a l 0 分离 积分 脉冲安培检测 工作电极为金电极 p h a g a g c l 电极为参比电极 第三部分主要针对食品调味剂中的五种糖类进行分析 分析方法为离子色谱脉 冲安培检测法 h p i c p a d 该方法分析糖类物质 糖不需要进行衍生 样品处理 简单 由于脂类对分析测定存在干扰 首先在样品中加入1 2 二氯乙烷 将样品中的 脂类物质萃取到l 2 二氯乙烷中 除去1 2 二氯乙烷 将样品溶于水溶液中 选择合 适的水浴温度和时间 使样品中的糖溶于水溶液中 然后直接分析测定 由于糖在 强碱介质中能完全离子化 该方法采用n a o h 梯度淋洗 在c a r b o p a c r m p a l 0 分析柱 上分离 工作电极为a u 电极 p h a g a g c l 电极为参比电极 脉冲安培检测器检测 检测限可低达p g l 关键词 食品 非蛋白质氨基酸 糖类化合物 离子色谱积分脉冲安培 桂林工学院硕士学位论文 a b s t r a c t o u ra n a l y t i c a lt a r g e ti sn o n p r o t e i na m i n oa c i d sa n dc a r b o h y d r a t e sw h i c hc a nb e e n t a k e di nd i r e c t l yb yp e o p l e b e c a u s ed i f f e r e n tn o n p r o t e i na m i n oa c i d sa n dc a r b o h y d r a t e s e x i s ti nd i f f e r e n tf o o d s t h e r e f o r e d i f f e r e n ts a m p l ep r e t r e a t m e n tt e c h n i q u e sw e r ea d o p t e d f o rd i f f e r e n ts a m p l e s i nt h i sp a p e r t h ea n a l y t s i so ft a r g e tc o m p o u n d sw a sm a i n l yc a r r i e d o u to na ni o ne x c h a n g ec h r o m a t o g r a p h y i c w ec h o o s eh i g hp c r f c l t m a n c ei o ne x c h a n g e c h r o m a t o g r a p h y h p i c c o u p l e dw i t hi n t e g r a t e dp u l s e da m p e r ed e t e c t i o n i p a d t o d e r t e m i n et h ed i f f e r e n ts a m p l e sa n df o o d s 1 1 1 em a i nc o n t e n t so ft h i sp a p e rw e r ec o m p o s e d o ft h r e ep a r t s t h ef i r s t p a r t r e v i e w e dt h e a p p l i c a t i o no fh p i c i p a d i na m i n oa c i d sa n d c a r b o h y d r a t e sa n a l y s i s w eh a v eac l e a ru n d e r s t a n d i n go ft h ei m p o r t a n c ea n da d v a n t a g e s o fh p i c i p a d m e t h o dc o m p a r e dw i t ho t h e rt e c h n i q u e s s e c o n d w ef o c u s e do nt h ed e t e r m i n a t i o no fn o n p r o t e i na m i n oa c i d sw h i c ha r ew i d e l y e x i s ti nf o o d sb u tl e s sc o n c e m e db yp e o p l e i nt h i sp a p e r w ec h o o s eh p i c i p a dm e t h o d o a n a l y s et h en o n p r o t e i na m i n oa c i d s a d o p t i n gt h i sm e t h o d n o n p r o t e i na m i n oa c i d sc a nb e d e t e c t e dd i r e c t l yw i t h o u tt h en e e do f c h e m i c a ld e r i v a t i o n b e c a u s em o s tn o n p r o t e i na m i n o a c i d sa r ed i s s o c i a t i v ea m i n oa c i d s n oh y d r o l y s i sp r o c e s sw a sn e e d e db e f o r ea n a l y s i s t h r o u g hc o n t r a l l i n gt h ep r o p e rd i s s o l v i n gt i m ea n dt e m p e r a t u r ei nw a t e r s a m p l e sc a nb e a n a l y z e dd i r e c t l y i nt h ep r e s e n tw o r k d i f f e r e n tc o n c e n t r a t i o n so fn a o ha q u e o u ss o l u t i o n s w e r eu s e da se l u e n t t h ea n a l y t i c a lc o l u m nw a sa ni o ne x c h a n g ec o l u m na m i n o p a c t m p al0 a n dt h ed e t e c t o rw a si p a dw i t hag o l d a nw o r k i n ge l e c t r o d ea n dp h a g a g c lw a s u s e da sr e f e r e n c ee l e c t r o d e 1 r 1 1 i i d w ec o n c e n t r a t e do nt h ea n a l y s i so ff i v ec a r b o h y d r a t e si nf o o ds p i c e s a n dt h e m e t h o dw ea d o p t e di sa l s ot h eh p i c i p a d w i t ht h i sm e t h o d c a r b o h y d r a t e sd on o tn e e d d e r i v a t i o nb e f o r ed e t e c t i o n a n dt h es a m p l ep r e p a r a t i o nw a sa l s ov e r ys i m p l e b e c a u s et h e g r e a s e c a ni n t e r f e r et h ed e t e r m i n a t i o no fc a r b o h y d r a t e s a na p p r o p r i a t ea m o u n to f 1 2 一d i c h l o r o m e t h a n ew a sa d d e di ns a m p l e st oe x t r a c tt h eg r e a s e a f t e rt h er e m o v a lo f 1 2 一d i c h l o r o m e t h a n e t h es a m p l ew a sp u ti n t oh o tw a t e rf o rp r o p e rt i m e t oe x t r a c t c a r b o h y d r a t e s a n dt h ee x t r a c tc a n b ea n a l y s e dd i r e c t l y s i n c ec a r b o h y d r a t e sc a l lb ei o n i z e d 桂林工学院硕士学位论文 c o m p l e t e l y i nt h i sw o r k a na n i o ne x c h a n g ec o l u m nc a r b o p a c r u p a10w a se n o u g h a n d d i f f e r e n tc o n c e n t r a t i o n so fn a o ha q u e o u ss o l u t i o n sw e r eu s e df o rg r a d i e n te l u t i o n t h e d e t e c t o rw a sap a dw i t ha g o l d a nw o r k i n ge l e c t r o d ea n da g a g c lr e f e r e n c e e l e c t r o d e d e t e c t i o nl i m i tr e a c h e dl o wp g ll e v e l k e y w o r d s f o o d s n o n p r o t e i na m i n oa c i d c a r b o h y d r a t e s h p i c i p a d i i i 桂林工学院硕士学位论文 研究生学位论文独创性声明和版权使用授权说明 独创性声明 本人声明 所呈交的论文是我个人在朱岩教授指导下进行的研究工作及取得 的研究成果 尽我所知 除了文中特别加以标注和致谢的地方外 论文中不包含 他人已经发表或撰写过的研究成果 也不包含为获得桂林工学院或其它教育机构 的学位或证书而使用过的材料 对论文的完成提供过帮助的有关人员已在论文中 作了明确的说明并致以了谢意 学位论文作者 签字 丝j 娶 签字日期 迦丕 孟 g 版权使用授权说明 本人完全了解桂林工学院关于收集 保存 使用学位论文的规定 即 按照 学校要求提交学位论文的印刷本和电子版本 学校有权保存学位论文的印刷本和 电子版 并提供目录检索与阅览服务 学校可以采用影印 缩印 数字化或其它 复制手段保存论文 在不以赢利为目的前提下 学校可以公布论文的部分或全部 内容 保密论文在解密后遵守此规定 学位论文作者 签字 盔血 指导教师签字 华衾 签字日期 狸曼 星 桂林工学院硕士学位论文 第1 章绪论 自然界中从细菌到人类的所有蛋白质主要都是由2 0 种氨基酸组成的 这2 0 种氨 基酸称为蛋白氨基酸 也称为基本氨基酸或标准氨基酸 非蛋白氨基酸是指除组成 蛋白质的2 0 种常见氨基酸以外的含有氨基和羧基的化合物 l 非蛋白氨基酸多为基本 氨基酸的类似物或取代衍生物 如甲基化 磷酸化 羟化 糖苷化 交联等等 除 此之外 还包括p 丫 6 氨基酸及l 一氨基酸和d 氨基酸 非蛋白氨基酸多以游离态或 小肽的形式存在于生物的各种细胞或组织 据统计 从动物 植物 海洋生物 微 生物体内分离得到的非蛋白氨基酸已达7 0 0 余种 其中已测定分子结构的有4 0 0 多种 在植物中发现的约2 4 0 多种 动物中发现5 0 多种 其余多存在于微生物中 2 1 非蛋白氨基酸种类繁多 结构也各不相同 相应的合成方法也很多 一般生物 合成的途径通过下列三种方式进行 1 基本氨基酸合成后的修饰 2 基本氨基酸代 谢产生的中间产物 3 l 氨基酸的消旋 事实上非蛋白氨基酸在生物体内合成的途 径十分复杂 有些合成机理尚不十分清楚 还需进一步研究 3 1 非蛋白氨基酸可以作为合成其它含氮物质的前身1 4 如激素 抗生素 生物碱 色素等 还可以作为组成细菌细胞壁的成分 非蛋白氨基酸还可参与储能 起到对 生物物种的保护作用 5 充当神经递质 6 同时非蛋白氨基酸还参与跨膜离子通道的 形成 非蛋白氨基酸生物功能的多样性也是与其繁多的种类一致的 非蛋白氨基酸 在抗癌 抗菌 抗结核 护肝 降血压 升血压等方面都发挥了极其重要的作用 非蛋白氨基酸可以说是对天然氨基酸的有益补充 与蛋白氨基酸相比 它们对 生命机体的生存和发育 自身代谢与结构功能方面有着蛋白氨基酸所不能起到的作 用 目前 人们对非蛋白氨基酸的研究主要集中在发现与合成上 对其功能与应用 的研究也逐渐深入 但对环境和食品中存在的各种非蛋白质氨基酸含量的测定则比 较少 应该说在这方面还有许多的工作可做 1 1 离子色谱安培检测法在氨基酸 糖类分析中的应用 i c 自1 9 7 5 年由h s m a l l 等人提出之后 7 1 就被广泛的应用于离子分析中 最初 i c 主要用于阴离子分析 随着i c 技术的不断发展 现在已成为在各种无机及有机阴 阳离子分析中起重要作用的分析技术 离子色谱中常用的检测方法主要有 抑制型和 桂林工学院硕士学位论文 非抑制型 电导检测 紫外可见光度检测 安培检测和荧光检测 安培检测是一种电化学检测技术 是用于测量电活性物质在工作电极表面发生 氧化或还原反应时产生电流变化的检测器 其主要优点是灵敏度高 选择性好 响 应范围宽及结构简单 安培检测器的检测池有3 种电极 它们分别是工作电极 参比 电极和对电极 电化学反应发生在工作电极上 但反应的前提是需要在工作电极与 参比电极之间施加一个适当的电位 电压 根据施加电位方式的不同 安培检测法可 分为恒电位安培检测法 脉冲安培检测法 p u l s e da m p e r o m e t r i cd e t e c t i o n p a d 和积 分脉冲安培检测法 i n t e g r a t e dp u l s e da m p e r o m e t r i cd e t e c t i o n i p a d 1 i 1 恒电位安培检测法 恒电位安培检测法作为离子色谱光度检测法和电导检测法的一种补充而被广泛 的采用 其原理是将一个恒定的直流电位连续地施加于检测池的电极上 当待测物 被氧化时 电子从待测物转移至电极 得到电流信号 在此过程中 电极本身为惰 性 不参与氧化反应 实验中 为了得到良好的信噪比 工作电位的设定至关重要 一般工作电位选 择在被测离子伏安图的平台区 一个简单的方法是在实验中对电极施加不同的电位 观察该电位下由相同进样量的被测离子标准溶液所得到的色谱峰的峰高 或峰面积 色谱峰高极大值与噪声之比的最大值所对应的电位就是最佳工作电位 同时分析多 个具有不同标准电位的离子时 工作电位必须足够大 以保证处于所有离子的伏安 图上的平台区 恒电位安培检测法具有较高的灵敏度 可以测定p m o l 级的无机和有机离子 如 与环境有关的阴离子 硫化物 氰化物 砷 卤素等 此方法在离子色谱中的应用 实例见表l 2 桂林工学院硕 士学位论文 岔 2 t q 心w l 3 a 岭o 0 一 t ot o 吨o n o 0 oc o n 0n o o 6 8 o v 一 v u 一 毛 6 v 一 毛 6 奇 苞 t i u n n o z 墨 zu 一u时乙 nou占z xz 蹦博1 嫡 匿区 甾旺 将幕 芷 芷 罄臀餐 一 v 谨臀铎 u nou薯日z noudz 缒 门 nou爿n no h鼍乙 一u矗z o hz o h 嗣oiio q nn 0 viuuiqnhou n 譬山口oh 蜀iitl一oo oo 壶山口 一i 苫 uh山墨 寸 uh山王 u碍duoh 寸 i山 l 警糅睁 警将 z u n o 乙 屯 c s 乏一n 勃 链 丰 一u叠d泛sjo苗 占 丑 懈州爨 一n d 餐是骤督蓬 鸯j旺 气 q叫 王o 卜 莲臀铎暴掣 一卜zd co n专n 占nbz 一 n 0j卜叫言小n 0 an口 oi崞叫 o 卜n o 卜口 i in 口n o 卜寸 o一 nn oi寸叫 寸 心n o o口 oin 言h n 0沾o o an c o i n 衄 蓦 o o nh oi一 嫠鲻牮 审 肇守世r r 删 螺帐ujoia蓉liolo 逍铤求o v h譬do口趸 一a g o岔 i c6 装o illi葛non口一 摹on 式 寸 一c g譬 9 铽 零oq摹 装 叮装nn li gn nn i 0n j旦日 装o 摹on 口一gon 0 一 摹oo h u一仁5 0一 更bn 世裂越嚣一 2qo io矗z co 一 苫nqo zo矗z v芑q三脚01 茁舄山昌一ii之 堪蹿求 u一昌价 zs 摹心l 鬟磊 口一巨n寸os 摹o 摹on c一暑 叶寸g 装也n 装寸n 口口lj口 日装nn 摹 口 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蹄磊稼扑辜粤on口丑 聚赠墨 椎击卓稍臀皿 价 曛魁霉 拐o 螺帐0101日矗coiq j i捌婪封 蜒赠 on譬 娶吾世一剞 稚磊掣扑s翟onq 嗽赵霉on山o 基整如降褪oo羚 soh 置置厂i置冷 o 蚓妪 p o n 延堪晕兽世卜州 椎鞋划臀缸 拐 pr 帮嚣掣扑睾掣onq田 熊赠魁 ons 聪毯暴on山o 警整脚即铤oo冷 so 嚣口oiq r斟塔隶o 互山譬doij售 口召寸 寸s 美o h ij一暑寸叶ns 装o 一il口工王n寸czvu摹 卜十 装口 一口一iil n 8 i u长 寸 装口h 量雹h 8一 摹峪n 言heqov 摹oh 二 3 对z q岂u三田 至uio价n一互 甜z一 王3三田甍一 ua譬函堪蜷求o 耍函u叠 口薯 卜心文 s 至uin 寸1 0s 主1 u o o n 1 0寸os 芝gooq 主1 l l o 口 o寸oc 苫暑oo寸 笺妄o 瓮 8一 艺llio口 0 一 9一 窆uio o c口 u o 窆uin 岁ruj 3 己乙一 甚011i耳 e q百z一 芑dfl一田掣塔求 一vd譬do口一口之 一口一gn心文s 摹口一 口暑iin寸o 装o 口一go寸葛一u装 寸 摹葛 u g 一式一一 装nn 一ij g乙 ov 装口一 一至i u rbz0芑u三叫一毫 n 0 o再z 琶 三 簧一 i iatii丑 丰 睾求o h v 13 oc一昌 u uin厶 寸s 更on 墨葛 口一旨寸寸ns 装o il重一寸高 u摹 卜 零心 ii g式一u摹 寸 装岭一 岳 基 1 v琴 寸 小on 口薯 一 乙v 摹葛 日摹on 口趸qo一 装 一 一至 一u吾z 0 l u q j 一叫 芝冷 o zo日z苗 口d三 矗苗亭一 甚u11一 塔求枯翅帮埘牾崩辐逛避 罂涎楼 桀杂划甾醐蜒r哩婪 求击章封蝤涮呈f 逛nn瀵搂警建暴 s 逼赠s 1 g o一忙舡已耧崾r再坎1鍪 煺捌姑划趟煺蜊黎哩g n冀 捌图矮难苌樊 嚣求 黑 啷峰 幂sp o 晨导肇璎堪 廿蜷璎鬲古按 托 甾簿 辖太婪崩障崾 煺 捌鳘煺捌裎噬g g rf瓮 0捌图 嬖崾睾on娶辱嗽漤终 嚣求 o n 0键肇卿峰赠渊丽嚣佥诎妙 等f 爨糕 卜耀求1ui n 最 哥舡穹超s g譬 巢娶辩髓纂g匿 啦 n o盛嚣器姑 罄冥澎醐 莓丑皿 澎墒 撅留舡 已姑烛迎七b淫 p寸蚶 餐煺星 熏姑肇 壤n矮煺窖链爆 器磷敞嫩 煺捌帮爆捌暑t1 n n o 氍鲻1 菩 捌赠 如鬻求很 1眦n妥十铤 求 1 2 的溶液中 伯胺和仲胺化合物能够 在金电极上被氧化 采用积分脉冲安培法检测 c h e n g 等t 8 9 使用一次性金电极分 析氨基酸 克服了金电极容易污染的缺点 1 2 6 其他分析方法 离子流动仪是一种根据各物质在电场的作用下具有的不同流动性分离化合 物的方法 a s b u r y 等 恻使用电喷雾离子化高分辨率离子流动仪测定2 0 种直接来 自于液体样品的单个氨基酸 由于它们在电场作用下在混合有甲醇和醋酸的水溶 液中具有不同的流动性 而漂移时间不同 到达检测器的时间不同 该方法采用 m s 作检测器 测定的检测限在低的p m o l 到高的f l m o l 之间 这种方法显示了分 1 9 桂林工学院硕士学位论文 离氨基酸的巨大潜力 这种方法的优点在于氨基酸不需衍生 在不到一秒的时间 内可完成分离 但目前还没有报道应用该方法于氨基酸混合样品的分离 1 3 糖类化合物分析技术及其进展 糖类在自然界中存在极广 种类有单糖 低聚糖 多糖 酸性糖 氨基糖 糖醇以及它们的异构体等 糖类化合物的分析国内外一直在进行研究和改进 早 期的方法有电泳法 光度法 容量分析法 斐林试剂热滴定法 s h s 碱性铜试剂 滴定法 9 1 t 9 2 1 但是这些方法选择性差 没有对分析体系中的糖类进行分离 得 到的是糖类总量的分析结果 而后又发展了色谱法 包括薄层色谱法 9 3 9 4 和气相 色谱法 但是由于糖类化合物沸点高 挥发性低 不易气化 必须经过一次或两 次的衍生反应 转变成易挥发 热稳定性好的物质后才能进行测定 给实际分析 工作带来较大的不便和误差 对于多糖 则需首先将其降解为结构简单的单糖或 寡糖 然后将其衍生成易挥发 热稳定的衍生物 通过对降解糖的衍生物的定性 定量测定 可得到多糖的基本结构 9 5 9 6 目前 对糖类进行测定的方法还有很多 目 效果更好 1 3 1 液相色谱法 液相色谱法对糖类的检测方法大致可以分为紫外可见检测 示差折光检测 荧光检测 蒸发光折射检测和电化学检测等几类方法 1 3 1 1 紫外 可见检测 部分糖类化合物在1 9 0 1 9 5r f f n 附近有紫外吸收 可以直接进行紫外检测 但 是 由于受低波长区域的限制 流动相只能使用水 除非是相当干净的试样 否 则在使用上很困难 大部分糖类没有紫外吸收 无法直接进行紫外检测 必须通 过衍生的方法 使这些糖类变成具有紫外吸收的物质 从而进行紫外检测 常用 的糖类紫外衍生化试剂有 2 4 二硝基苯 对甲氧基苯胺 2 氨基吡啶 6 氨基 喹啉 苯甲酸 对氨基苯甲酸乙酯 3 甲基 1 苯基 2 吡啶酮 p m p 苯甲酰氯等 其中伯氨基衍生化试剂是目前最常用的 但生成物希夫氏碱不稳定 须经8h 9 0 的还原反应才可生成稳定的可用于分析的叔胺衍生物 且伯氨基衍生化试剂不能 用于还原酮糖 9 7 9 9 1 1 3 1 2 示差折光检测 示差折光检测法是只要试样成分和流动相的折光率有差别就可以检测的通 用检测法 在糖类分析中被广泛使用 本法可以直接检测无需衍生反应 但是 2 0 桂林工学院硕士学位论文 与紫外或者荧光检测相比 示差折光检测灵敏度较低 选择性较差 易受温度和 流动相的影响 同时示差折光检测法不能使用梯度洗脱 在进行多组分分析时效 果不好 1 3 1 3 荧光检测 荧光检测在灵敏度和检测选择性方面都很优越 但是要求成分必须是具有荧 光吸收的物质 由于糖类不具有荧光性 因此需要通过柱前或者柱后荧光衍生法 使其具有荧光性 然后进行分析 柱前衍生法常用的衍生试剂是2 氨基吡啶 2 御 n n 二甲基氨基萘 5 磺酰肼 4 n n 二甲基氨基一4 偶氮苯磺酰肼 芴甲氧基羰基肼 9 f l u o r e n y l m e t h y l h y d r a z i n e f m o c 肼 2 氨基苯甲酸 2 氨 基苯甲酰胺等 柱后衍生法常用的衍生剂包括2 氰基乙酰胺 乙醇胺 乙二胺 二氨基丙腈等 1 0 0 1 0 2 1 使用柱前或柱后衍生化法可以使检测的灵敏度大大提高 如单糖与氨基吡啶反应生成具荧光的衍生物 然后于c 1 8 反相柱上层析 以乙腈 柠檬酸缓冲液作流动相 洗脱液即可用荧光检测 敏感度较示差折射检测提高2 倍 1 3 1 4 蒸发光散射检测 蒸发光散射检测器 e l s d 对所有不挥发溶质都有响应 是一种较理想的 通用检测器 其特点是灵敏度高 不受溶剂成分及温度波动的影响 亦可用于梯 度洗脱 应用范围很广 对于难挥发或非挥发的组分都能产生响应 尤其适合糖 类的分析 在对低聚糖的分析上效果极好 e l s d 作为一种新型的色谱检测器 尚存在一些不足之处 如灵敏度不及紫外检测器 不适用于低沸点物质的检测以 及价格较高等 旧3 1 1 3 1 5 电化学检测 电化学检测也是高灵敏度的检测方法 在用于糖类方面使用c u 或a u 电极的方 法 特别是a u 电极与脉冲方式相组合的方法 脉冲安培检测器 可检测p m o l 级的 糖 8 0 年代r o c k l i n 等在碱性条件下直接用阴离子交换树脂分离糖 并使用脉冲安 培法进行检测 现在通用的是高效阴离子交换 脉冲安培法检测 h p a e n 技 术 h p a e p a d 法与传统的糖类色谱法相比较有以下的优点 1 灵敏度高 可达 p m o l 水平 2 分析时间短 一般在1 5 3 0 m i n i 为即可完成 3 无需进行衍生化和 严格的样品处理 4 可以便用梯度洗脱 5 色谱柱的选择性及分辨率高 6 柱 及检测器的使用寿命长 这种方法也有其不足之处 如某些不稳定的基团在较强 碱性条件下可能会发生降解 柱的容量小 不适于制备性分离 不同的寡糖有不 同的响应因子 所以在定量的准确性和方便性上不如荧光法 如氨基吡啶衍生化 2 1 桂林工学院硕士学位论 文 法 1 0 4 1 0 6 d i o n e x 公司在此技术上一直处于领先的地位 继最初的d i o n e xh p i c a c 6 柱 之后 又先后开发了专门用于糖分析的三种分离柱 c a r b o p a c p a l c a r b o p a c m a l 和c a r b o p a c p a l 0 0 p a l 柱主要用来分离一些在p a l 柱上弱保留的单糖和双糖类 例如糖醇 p a l 0 0 柱则主要用来分离复杂的具有支链结构的寡糖 这些柱子的填 料物为薄壳型阴离子交换树脂 树脂基核为粒度较大的苯乙烯 二乙烯基聚合物 流动性好 反压小 最近一篇关于 离子色谱进展 的综述 1 0 7 中又介绍了分离柱 的新进展 新型的高聚物离子交换树脂材料除高效外 在p h 0 1 4 以及在与水互 溶的有机溶剂中稳定 可用强酸和强碱作流动相 也可在流动相中加入有机溶剂 调节和改善分离的选择性及色谱峰的对称性 缩短水性化合物的保留时间 用有 机溶剂清洗谱柱的污染物以及延长柱子的使用寿命 p a d 检测器也从最初的形式 经过p e d i i 发展到较新的e d 4 0 其灵敏度从最初的5 0n m o l 提高到l o 1 2m o l l i s aa k a i n e k a r e na w o l n i k t l 0 8 1 把高效阴离子交换色谱法一脉冲安培检 测应用在婴儿食品配方的检测标定上 用于检测牛奶型配方 蛋白质溶液配方的 糖类分布情况 t o m m a s o r 等f 1 0 9 佣阴离子交换色谱法一脉冲安培检测器检测了橄 榄类植物提取液中的糖类化合物 1 3 2 高效毛细管电泳分析 糖类化合物一直是分析化学界公认的难分离的一类物质1 11 0 1 高效毛细管电泳 h p c e 它虽然是一种新型的分离分析手段 但在糖类的分析上也存在着一 些难点 主要为多数糖类解离程度十分微弱 且具有较强的亲水性 致使利用样 品淌度差异的毛细管区带电泳和利用样品疏水性差异的胶束毛细管电动色谱都 难以直接解决糖的分离问题 其次多数糖类不具备很强的紫外和荧光生色团 使 分离后的检测有一定困难 1 1 1 这些技术难题 人们利用h p c e 的特点 开展了一些 研究 现介绍如下 1 3 2 1 柱前衍生 针对所面临的问题 1 9 8 9 年文献报道了还原糖的毛细管测定法 他们的工作 为这一领域的研究开辟了新的道路 他们巧妙地利用硼酸与糖类化合物反应 糖 中相邻的两个羟基与硼酸中的硼配位 失去两分子水 从而形成带电复合物 然 后用2 2 氨吡啶来衍生还原性糖 紫外检测 同时测定了1 2 种糖 检出限为1 0 p m o l 这就是柱前衍生的一种方法 这种方法的目的主要是通过化学反应使糖类化合物 带上固有电荷 以改善通常呈中性的糖类分子的电迁移性能 此外 由于具有同 一还原端的不同寡糖具有唯一的紫外或荧光响应值 从而给糖类的定量分析带来 桂林工学院硕士学位论文 方便叫j 除上述方法之外 还有许多衍生化反应可使糖带上合适的基团并提高其检出 限至f m o l a m o l 级 这些方法大都基于还原氨基化反应 也就是分子的还原端与 带电的发色或荧光基团的伯胺反应成为希夫氏碱 再利用硼氰氢化钠 n a b h 3 c n 还原成仲胺 比如a m a c 法 2 2 氨基卟丫啶酮法 对糖类物质进行a m a c 衍生化 使糖类成为可以用紫外检测的一类物质 单糖浓度和质量检测极限分别为0 6 m n o l l 和1 7f m o l 单糖的a m a c 化学衍生极限为1 0g m o l l 可见方法灵敏度的 决定因素是单糖的化学衍生极限 同时 由于糖的a m a c 衍生物电离能力也很弱 无法直接应用毛细管区带电泳 c z e 分离 所以选用硼酸或硼砂为电泳缓冲液 形成带负电络合物 达到分离目的 1 3 2 2 不经衍生的直接和间接紫外检测 在糖类物质的紫外检测中 除上述柱前衍生的方法之外 人们还找到了不经 衍生的直接检测和间接紫外检测的方法 考虑选用直接紫外检测的原因是由于 在单糖或寡糖的溶液中 加入硼酸盐不仅会生成络合阴离子 而且会导致1 9 5n l t l 处的吸光度增 j 1 2 2 0 倍 但这时 糖分子的吸光度还是很低 检出限只能限制 在n m o l 水平 因此 人们在不经衍生直接进行紫外检测方面也作了一些工作 比 如 许国旺等 1 1 3 在细胞中鸟苷二磷酸糖的毛细管电泳研究中 采用2 0m o l l 1 硼 酸盐 p h 9 作缓冲液 2 2k v 下 c z e 法1 5m i n 左右全分离了4 个关键u d p s u g a r s 采用紫外直接检测 其精度和检测限均符合细胞分析的要求 间接紫外检测 1 0 3 是一种用无紫外吸收的被分析物置换有紫外吸收的背景电解质 从而获得负峰的 检测方法 一般来说 它的灵敏度没有相应的直接检测高 但也是用h p c e 分析 糖类化合物工作中可以考虑的一种方法 尤其对于通常无法衍生化的非还原性寡 糖及醛糖酸的鉴定非常有用 1 3 2 3 荧光检测 想办法利用荧光对糖类化合物进行检测也是分析工作者考虑的一个方向 而 且荧光检测的灵敏度通常比紫外检测的高 通常 人们采用的是激光诱导荧光检 n l i f 熊少祥等 1 1 4 利用毛细管 激光诱导荧光 增强型电荷耦合器件系统 高灵 敏度地检测了痕量的氨基糖 他们以异硫氰酸荧光素 f i t c 为荧光衍生剂 氨基 葡萄糖 氨基半乳糖以及氨基葡萄糖酸为模型化合物 具体考察了缓冲液种类 浓度 p h 值等多种因素对荧光衍生反应和电泳分离的影响 分离并测定了痕量的 氨基糖 对氨基葡萄糖的质量检测限达n 1 7 0z m o l 1 3 2 4 电极脉冲安培检测 桂林工学 院硕士学位玲文 贵金属电极脉冲安培检测也是h p c e 在糖类化合物分析中的一种方式 这种 方法是利用一些基团 如醛基 醇基 氨基和含硫基团 的催化表面氧化来进行 检测 所以 糖类物质多羟基的特性 使其既不需衍生也不需与硼酸盐络合 就 可以直接在电极上发生氧化 还原反应 从而得到氧化电流 之后 在电化学检测 器上检测即可 近年来 有人将该技术用于烟草中糖类物质的测定 i j 取得了满 意的结果 对烟草中葡萄糖 1 果糖 蔗糖和麦芽糖的检测限均小于5 o 1 0 m o l l 1 1 3 3 色 质联用技术 质谱对糖类化合物的分析开始于6 0 年代 由于最初不能直接测定热不稳定 的 不易挥发和极性强的生物大分子 所以糖化合物须进行衍生化 l 1 6 1 17 1 例如 多糖样品全甲基化保护羟基 水解得到部分甲基化的单糖混合物后 用硼氢化钠 还原 再乙酰化得到部分甲基化链状多羟基醇的乙酰衍生物 应用g c m s 狈t j 定混 合物 可了解单糖组成及大致的分枝情况1 1 1 8 1 0 质谱法在一次分析中可提供丰富的结构信息 将分离技术与质谱法相结合是 分离科学方法中的一项突破性进展 用质谱法作为气相色谱 g c 的检测器已成为 一项标准化g c 技术被广泛使用 由于g c m s 不能分离不稳定和不挥发性物质 所以发展了液相色谱 l c 与质谱法的联用技术 l c m s 可以同时检测糖肽的位置 并且提供结构信息 例如c a r r 等 1 1 9 2 l 发展t l c m s 方法识别n o 连接糖蛋白 寡糖结构 s z p u n a r 等t 1 2 2 j 用分子排阻色谱与i c p m s 联用测定了水果和蔬菜中金属 和糖的络合物 该方法可以检测分子量大于5 0l u 的多糖 1 9 8 7 年首次报道了毛细管电泳 c e 与质谱的联用技术 1 2 3 1 随之该项技术就迅 速获得认可和欢迎 c e m s 在一次分析中可同时得到迁移时间 分子量和碎片信 息 因此它是l c m s 的补充 最早报道c e 与m s 联用是脱机方式 后来还有c e 与 等离子体质谱 m a l d i t o f m s 和e s i m s 联用 k e l l y 等t 1 2 4 用c e e s i m s m s m s 分离鉴定了摩拉克氏菌属细菌 m o r a x e l l a c a t 砌a l i s 的脂寡糖和多糖 y e u n g 等 1 2 5 j 用c e e s i m s 分析了高甘露糖的糖蛋白 该方法适用于中性高甘露糖的多糖 而 且不需要将释放或衍生寡糖 c e m s 作为常规方法尚存在以下缺点 浓度灵敏度低 不如l c m s 不是所 有的c e 分离模式都可方便地与m s 联用 m s 对c e 分离缓冲液的限制较多 因此需 进一步研究分离能力强的c e 技术与m s 相联用的可靠方法 研制新型的高效 c e m s 接口 使c e 的各种类型的缓冲液都适用 总之 随着质谱仪器的进一步完善 对机理进一步了解 谱图解析工作的进 一步深入 如建立较完整的谱库 色质联用技术的进一步发展 相信质谱技术将 成为糖分析的有力工具 完成糖的分子量 序列 组成及连接的测定 对目前正 桂林工学院硕士学位论文 在发展的糖生物学和糖基化工程将起到极大的推动作用 桂林工学院硕士学位论文 1 1 1 2 1 3 1 4 1 5 1 6 参考文献 闫爱新 田桂玲 叶蕴华 非蛋白氨基酸对生物活性多肽的修饰及其构效关系研究进展 有机化学 2 0 0 0 2 0 3 2 9 9 3 0 5 吴显荣 氨基酸杂志 非蛋白质氨基酸的结构与功能 1 9 8 9 3 2 5 2 7 曹稳根 李卫华 叶子坚 非蛋白氨基酸的生物合成及其生物学作用 氨基酸和生物资 源 1 9 9 5 1 7 2 4 7 4 9 范镇基 非蛋白质氨基酸的功能与应用 氨基酸杂志 1 9 9 0 1 2 5 3 4 华南农学院主编 植物化学保护 北京 农业出版社 1 9 8 3 l s t r y e r 生物化学 北京 北京大学出版社 1 9 9 2 hs m a l l tss t e v e n s wcb a u m a n n n o v e li o ne x c h a n g ec h r o m a t o g r a p h i cm e t h o du s i n g c o n d u c t i m e t r i cd e t e c t i o n a n a l y t i c a lc h e m i s t r y 1 9 7 5 4 7 1 8 0 1 1 8 0 9 r dr o c k l i n elj o h n s o n d e t e r m i n a t i o no f c y a n i d e s u l f i d e i o d i d e a n db r o m i d eb yi o n c h r o m a t o g r a p h yw i t he l e c t r o c h e m i c a ld e t e c t i o n a n a l y t i c a lc h e m i s t r y 19 8 3 5 5 4 7 袁丽霞 王慕华 杜欢永 等 离子色谱 d c 直流安培检测测定尿液中的2 4 和2 6 二异 氰酸甲苯酯 仪器仪表学报 2 0 0 1 2 2 3 增刊 to k u t a r t i ky a m a k a w a as a k u r a g a w a e ta l d e t e r m i n a t i o no fam i c r oa m o u n to fs u l f i d e b yi o nc h r o m a t o g r a p h yw i t ha m p e r o m e t r i cd e t e c t i o na f t e rc o p r e c i p i t a t i o nw i t hb a s i cz i n c c a r b o n a t e a n a l y t i c a ls c i e n c e 1 9 9 3 9 5 7 31 7 3 4 a h u lx u tl i e ta 1 e l e c t r o c a t a l y t i co x i d a t i o na n di o nc h r o m a t o g r a p h i cd e t e c t i o no f b r i s 0 3 2 2 0 3 2 一a n ds c n a tap l a t i n u mp a r t i c l e b a s e d 1 a s s yc a r b o nm o d i f i e d e l e c t r o d e j o u r n a lo fc h r o m a t o g r a p h ya 19 9 5 6 9 9 3 9 4 7 钱疆 余孔捷 杨方 液相色谱电化学安培检测乳粉中的脂溶性维生素a e 和d 3 分析 测试技术与仪器 2 0 0 6