（有机化学专业论文）电喷雾质谱在药物分析和反应机理研究中的应用.pdf

中罔科学技术人学硕f 学位沦文 摘要 1 硫普罗宁是重要的巯基类化合物 主要用来治疗肝炎疾病 由于含有活性巯 基 硫普罗宁在生物样品中容易反应生成二硫代化合物 因此在定量分析硫普罗 宁时 应该首先稳定巯基 我们建立了一种高灵敏度 高选择性的液相色谱串联 质谱方法测量血清中硫普罗宁含量 选用福多斯坦作为内标 在血清样品中加入 抗氧剂l 半胱氨酸和强还原剂1 4 二硫代苏糖醇 把硫普罗宁从硫化物形式还原 并且稳定下来 盐酸酸化 乙酸乙酯萃取后进入液相色谱质谱联用仪进行定量分 析 流动相为甲醇 0 2 甲酸水溶液 0 0 5 三羟甲基氨基甲烷 v 4 0 v 6 0 该方法 稳定 可靠 用于2 4 名志愿者服用2 0 0m g 硫普罗宁片后的药代动力学研究 2 矗脯氨酸足b 种小分子催化剂 可以用来催化羟醛缩合反应 羟醛缩合是合成 新的碳碳键的强有力工具 对于l 脯氨酸催化羟醛缩合反应 目前普遍接受的反 应机理足烯胺中问体机理 l 脯氨酸和丙酮亲核加成失去一分子水形成烯胺 电 喷雾电离由于采用软电离技术 溶液中的离子可以直接气化进入电喷雾质谱 很 少得到碎片离子 因此电喷雾质谱可以用来捕获反应中间体 并且进行结构验证 通过电喷雾质谱极其串联技术 研究l 脯氨酸催化羟醛缩合反应机理 证实了先 日 f 接受的烯胺中问体机理 关键词 硫普罗宁 高效液相色谱 l 脯氨酸 羟醛缩合反应 电喷雾质谱 中冈科学技术人学硕l 学位论文 a b s t r a c t 1 t i o p r o n i ni sa ni m p o r t a n tt h i o lc o m p o u n d a n di sm a i n l yu s e dt or e m e d yh e p a t i t i s t h e t h i o lc o m p o u n d sc a ne a s i l yg e n e r a t ed i s u l f i d e se i t h e ra sad i m m e ro rm i x e df o r m sw i t h e n d o g e n o u st h i o l si nt h eb i o l o g i c a lm a t r i c e s f o rt h i sr e a s o n u n l e s st h et h i o lg r o u pc a n b es t a b i l i z e di nt h eb i o l o g i c a ls a m p l e q u a n t i t a t i v ea n a l y s i so ft h et i o p r o n i nc a nb ev e r y p r o b l e m a t i c ah i g h l ys e l e c t i v ea n ds e n s i t i v el c m s m sm e t h o dw a sd e v e l o p e da n d v a l i d a t e dt oq u a n t if yt i o p r o n i ni nh u m a ns e r u m u s i n gf u d o s t e i n ea st h ei n t e r n a ls t a n d a r d l c y s t e i n ea n d1 4 d i t h i o t h r e i t o lw e r eu s e da st h er e d u c e ra n dt h es t a b i l i z e rt or e l e a s e a n ds t a b i l i f yt i o p r o n i nf r o mad i m m e ra n dm i xf o r m sw i t he n d o g e n o u st h i o l si nt h e t r e a t m e n t o f s e r u ms a m p l e s a f t e ras i m p l el i q u i d l i q u i de x t r a c t i o nw i t he t h y la c e t a t ei n a c i d i cc o n d i t i o n t h ep o s t t r e a t m e n ts a m p l e sw e r ea n a l y z e do nac isc o l u m ni n t e r f a c e d w i t hat r i p e q u a d r u p l et a n d e mm a s ss p e c t r o m e t e ru s i n gn e g a t i v ee l e c t r o s p r a yi o n i z a t i o n m e t h a n o la n dw a t e r 4 0 6 0 v v w e r eu s e da st h ei s o c r a t i cm o b i l ep h a s e w i t h0 2 f o r m i ca c i da n d1 0m m t r i s h y d r o x y m e t h y l a m i n o m e t h a n e i nw a t e r t h em e t h o dw a s v a l i d a t e dt od e m o n s t r a t et h es p e c i f i c i t y l o w e rl i m i to fq u a n t i f i c a t i o n a c c u r a c ya n d p r e c i s i o no fm e a s u r e m e n t s t h e m e t h o dw a se m p l o y e di nap h a r m a c o k i n e t i cs t u d ya f t e r o r a la d m i n i s t r a t i o no f2 0 0m g t i o p r o n i nt a b l e t s t o2 4h e a l t h yv o l u n t e e r s 2 l p r o l i n ew h i c hi sas m a l lm o l e c u l a rc a t a l y s ti su s e dt oc a t a l y z ea l d 0 1 r e a c t i o n t h e a l d o lr e a c t i o ni s r e c o g n i z e d a sap o w e r f u lt o o lf o rt h ec o n s t r u c t i o no fn e w c a r b o n c a r b o nb o n d s t h ec a t a l y t i cc y c l ec u r r e n t l ya c c e p t e df o rt h i sr e a c t i o nh a sb e e n p r o p o s e dt op r o c e e dv i at h ef o r m a t i o no fa na d d u c ti n t e r m e d i a t eb e t w e e nt h el p r o l i n e a n dt h ea c e t o n ep r o d u c i n ga ne n a m i n ei n t e r m e d i a t eb ye l i m i n a t i o no fw a t e r e s i m si s at e c h n i q u et h a ta l l o w st h ei o n sp r e s e n t si ns o l u t i o nt ob et r a n s f e r r e di n t ot h eg a sp h a s e w h e r et h e yc a nb ea n a l y z e da n de v e n t u a l l yc h a r a c t e r i z e d w i t hm i n i m a lf r a g m e n t a t i o n e s i m sh a sb e e nu s e da sa ne f f e c t i v em e t h o df o rt h ec h a r a c t e r i s t i co fo r g a n i c i n t e r m e d i a t e s t h u sp r o v i d i n gd i r e c te v i d e n tf o rt h em e c h a n i s mo fo r g a n i cr e a c t i o n s t h ea l d o lr e a c t i o nc a t a l y z e db yl p r o l i n eh a sb e e nm o n i t o r e da n dt h ea c c e p t e d 中围科学技术久学硕i 学位论j m e c h a n i s mc o n f i r m e d b yi n t e r c e p t i n g a n d c h a r a c t e r i z i n g a l l t h e p r o p o s e d i n t e r m e d i a t e sb ye s i m s m s k e y w o r d s t i o p r o n i n h p l c l p r o l i n e a l d o lr e a c t i o n e s i m s 中国科学技术大学学位论文原创性声明 本人声明所呈交的学位论文 是本人在导师指导下进行研究工作所取得的成 果 除已特别加以标注和致谢的地方外 论文中不包含任何他人已经发表或撰写 过的研究成果 与我一同工作的同志对本研究所做的贡献均已在论文中作了明确 的说明 作者签名 干啦签字日期 q j 盈二玉习l 一 中国科学技术大学学位论文授权使用声明 作为申请学位的条件之一 学位论文著作权拥有者授权中国科学技术大学拥 有学位论文的部分使用权 即 学校有权按有关规定向国家有关部门或机构送交 论文的复印件和电子版 允许论文被查阅和借阅 可以将学位论文编入 中国学 位论文全文数据库 等有关数据库进行检索 可以采用影印 缩印或扫描等复制 手段保存 汇编学位论文 本人提交的电子文档的内容和纸质论文的内容相一致 保密的学位论文在解密后也遵守此规定 口公开口保密 年 作者签名 签字日期 卓雏 一 j 啦4 导师签名 签字日期 尘阻上卜 中困科学技术人学硕一l 学位论文 第一章文献综述 1 质谱技术 质谱 m a s ss p e c t r o m e t r y m s 技术自1 9 1 2 年诞生以来已经历了近百年的时 间 1 9 2 0 年 a s t o n 1 1 首先引入质谱这一术语 1 9 4 2 年出现第一台商用质谱仪 2 1 早在1 9 世纪末 1 8 8 6 年 g o l d s t e i n t 3 在低压放电试验中观察到正电荷粒子 随 后w i e n l 4 发现正电荷粒子束在磁场中发生偏转 这些物理学知识的发现为质谱 的诞生提供了理论基础 被誉为现在质谱学之父的英国学者t h o m s o n 对正电荷 粒子束的物理学进行研究 他利用低压放电源所产生的具有高速度的诈离子束 通过一组电场和磁场 这时不同质核比的正电荷离子能够按照不同能量而发生曲 率不同的抛物线运动达到检测器 这就是质淆最基本的原理 质谱仪主要由真空 系统 进样系统 离子源 分析器 检测器和数据分析系统组成 习 离子源是质谱仪的核心部分之一 根据电离方式的不同 将获得不同结果的 质谱图 用于质潜离子化的方式主要有电子轰击电离 e l e c t r o ni m p a c ti o n i z a t i o n e i 化学电离 c h e m i c a li o n i z a t i o n c i 快原子轰击 f a s ta t o mi o n i z a t i o n f a b 基质辅助激光解析电离 m a t r i x a s s i s t e dl a s e rd e s o r p t i o ni o n i z a t i o n m a l d i 电 喷雾电离源 e l e c t r o s p r a yi o n i z a t i o n e s i 和大气压化学电离 a t m o s p h e r i cp r e s s u r e c h e m i c a li o n i z a t i o n a p c i 等1 6 j 电子轰击电离 7 1 是使用具有一定能量的电子直接作用于样品分子 电子在电 离电压加速下进入电离区 样品进入电离区后在电子作用下获得能量丢失一个电 子形成正离子 在质谱图上形成分子离子峰 有机化合物电离能一般在1 0e v 左 右 e i 离子化采用的电离能通常在7 0e v 因此样品分子在成为分子离子的同时 还可以进一步裂解为不同离子的碎片 在质谱图既存在分子离子峰也有丰富的碎 片离子峰 m u n s o n 和f i e l d 8 1 1 9 6 6 年正式提出化学电离技术 化学电离在结构上和e i 源没有太大区别 化学电离通过引入大量的试剂气 使样品分子与电离电子不直 接作用 试剂气体在高能电子束的轰击下产生初级离子 初级离子与样品分子发 生分子一离子反应 生产质子化分子 m h 或者产生消质子化离子 m h 中国科学技术人学颂 学位论文 快原子轰击是1 9 8 1 年由英国学者b a r b e r l 9 1 发现的一种新的软电离技术 惰 性气体a r 首先被电离成a r 然后在电场作用下加速 使之具有较大的动能 a r 进入充满中性氩气的碰撞室 二者碰撞进行电荷交换 高动能的中性氩气原 子流轰击样品分子使之电离 基质辅助激光解析电离 l o l 是将样品溶液和基质溶液充分混合 溶剂蒸发后 使其成为半晶体或者晶体状态 当用一定波长的脉冲激光进行照射时 基质有效 地吸收激光的能量使基质离子化 离子化基质于和样品分子发生碰撞 使样品分 子电离 大气压电离源包括电喷雾电离源和大气压化学电离两种 二者之中电喷雾离 子源应用最为广泛 电喷雾电离 e l e c t r o s p r a yi o n i z a t i o n 是一种使用强静电场的电 离技术 f e n n 将电喷雾技术 t a n a k a 贝j j 将基质辅助激光解析电离技术应用于生物 大分子研究 两人因此同时获得2 0 0 2 年诺贝尔化学奖 电喷雾电离的原理如图1 1 所示 1 1 12 1 电喷雾 c 二二卫 喷嘴 分析物 带电雾滴 持 一持 去溶 离子化 带电残基 图1 1电喷雾离子化原理示意图 内衬弹性石英管的不锈钢毛细管被施加3 5k v 的正电压 与相距l c m 接地 的负电极形成强静电场 被分析的样品溶液从毛细管流出时在电场作用下和从雾 化器喷管出的雾化气作用下形成高度荷电的雾状小液滴 在向质量分析器移动过 程中 液滴因为溶剂的挥发逐渐缩小 其表面上的电荷密度不断增大 当电荷之 间的排斥力足以克服表面张力的时候 液滴发生裂解 经过这样反复的溶剂挥发 液滴裂解过程 最后形成单个带电离子 l 弘1 5 e s i 产生的离子可能带单电荷或者 2 中固科学拙术大学日 学位论土 带多电荷 由于多电荷的存在使质量分析器检测范围扩大几十倍 从电喷雾离子 源原理可知电喷雾电离技术是很软的电离方法 它通常没有碎片离子峰 只有样 品分子或者准分子离子峰 适合活性反应叶 间体 蛋白质 核酸和多聚物检测 e s i 所能够承受的液体流量通常为1 2 0p l m i n 当向喷雾区引入一股逆向的 氨气流可以促进雾状液滴的脱溶剂过程 而同时在内衬弹性石英管的不锈钢毛细 管与金属毛细管之间增加一股同轴的雾化气流可以使液体的流量提高到2 m l m i n 由于液体流量的提高到高散液相色谱 h p l c 流动相流速 这使质谱和 高效液相色谱联用串联使用成为可能 这一技术被称为离子雾化 j n s p r a y 1 1 6 1 电喷雾通常要选择台适的溶剂 除了考虑对样品的溶解能力外 溶剂的极性 也需考虑 一般来说 极性溶剂 如甲醇 己腈 丙酮等 更适合于电喷雾 大气 压化学电离是由e s i 源衍生出来的 它是在常压f 电晕放电产生反虎离子 这砦 离子再与样品分子发生离子 分子反鹿 产生分了离了 基奉原理见图1 2 t 9 a p c 卜一般比较适台于中性的又容易气化的溶液 但是 它只能使被分析的分子 带上单电荷 因此 在分析 l 物大分子方面 它的应用受到r 一定的限制 朴充 三三 f 些 洲1 j 攀 1 i 竺竺i 雾化8 矗枷 口 幕气进 图1 2 大气压化学电离原理示意图 质量分析器是质谱中另外一个核心部分 在h p l c m s 联用技术中最常用的 质量分析器主要有四极质量分析器和离子阱 四檄质量分析器是目前最为常用的质量分析器之 具有体积小 质量轻 兰一 纱治黟鱼 中困科学技术人学硕 17 学位论文 性能好等方面的优点 四极杆质量分析器又称为四极杆滤质器 是由四根平行的 棒状电极组成的 理想的电极截面是两组对称的双曲线 其结构如图1 3 所示 1 7 一1 8 1 o 图1 3四极质量分析器示意图 在四个电极杆的x 和y 方向分别施加直流电压和射频交变电压 离子将围绕 z 轴进行有限振幅的运动而沿着z 方向前进 质荷比不符合条件的离子将因振幅 增大而碰到x 或y 方向电极而被过滤掉 最后被真空泵抽走 由此可以看出四极 质量分析器实际上是过滤型质量分析器 四极质量分析器可以自身串联 可以构 成三重四极质量分析器构成串联质谱仪 从原理讲离子阱和四极质量分析器类似 离子阱有一对上下的端电极和一环 电极组成 上下端电极面为双曲线的旋转对称面 环形电极内表面也为双曲线的 旋转对称面 环电极和上下端电极之间加上直流电压和射频交变电压 控制电压 就可以将特定质荷比的离子捕获在阱内稳定区域振荡 而不符合条件的离子因振 幅过大 撞击到电极而消失 离子阱扫描方式同四极质量分析相似 即通过电压 扫描或射频扫描 检测到各种离子的m z 值 图1 4 是离子阱原理图 i9 1 4 中国科学技术大学硕f 学位论文 图1 4 离子阱质量分析器示意图 2h p l c m s 在药物分析和药代动力学研究的应用 高效液相色谱 质谱 h p l c m s 联用技术自从2 0 世纪7 0 年代问世以来 经过 快速持续发展 已经成为一种成熟的分离分析方法 与传统的气相色谱质谱联用 技术 g c m s n 比较 h p l c m s 联用技术分析前样品预处理简单 可以直接用 于药物及其代诩 物的同时分离和鉴定1 2 0 2 1 h p l c m s 将液相色谱的高分离能力 和质谱的高度灵敏和高度专属性结合为一体 灵敏度比液相色谱配紫外检测器高 1 2 数量级 可用于不挥发性化合物 极性化合物 热不稳定化合物和大分子量 化合物 蛋白质 多肽 多糖和多聚物等 的分析 药物代谢过程包括药物通过各种途径进入体内后的吸收 分布 代谢和排泄 a d m e 这些因素决定了药物能否以适当浓度到达目标部位 并停留一定时间 从而使药物的疗效得到发挥 a d m e 过程存在 量时 变化或 血药浓度经时 变化 对这一动态变化过程规律进行定量描述即为药代动力学的基本任务 h p l c m s 的成功联用 显著地扩展了质谱在药物代谢和药代动力学中的应用范 围 由于电喷雾技术发展 h p l c m s 在药物代谢和药代动力学研究中的应用得 n t 爆炸式的发展 1 9 8 2 年 p e r c h a l s k i 等1 2 2 1 提出代谢产物往往保持着原药的母 核结构 因此原药与其代谢产物具有相似的离子裂解过程和特征碎片离子 所以 可以此来推断代谢物的结构 19 9 7 年k e m s 等 2 3 按照这一理论 用l c m s m s 5 z l 中国科学技术大学硕 学位论文 方法研究了丁螺酮的代谢产物 1 9 9 6 年l o k i e c 等 2 4 j 用l c m s 和l c m s m s 研 究了2 0 s 喜树碱的半合成衍生物c p t 1 l 在临床阶段的代谢途径 发现了 c p t 1 l 在体内的代谢的3 个主要反应 1 内脂位置的脱羧 2 7 乙基位置的氧 化 3 哌啶侧链的多级氧化 c w i k 等 2 5 j 建立了用l c m s 法检测狗血和小鼠 血清中葡糖萝卜硫素的浓度 评价其药代动力学参数 随着液相色谱技术的发展 出现了超高速液柏色谱 u p l c 2 0 0 8 年q i n 等 2 6 1 采用u p l c m s 串联方法检测 了人体血清中尼莫地平含量 单个样品分析只有2m i n 大大节约了测量时间 z h o n g 等f 2 7 1 也建立了h p l c m s m s 测定人体血清中尼莫地平含量 评价了药代 动力学相关数据 l e e 等1 2 8 1 测定盐酸地尔硫唑中合成试剂n n 氯化二甲胺乙酯 d m c 的l c m s 法 用e s i 正离子所测得的检测限低 方法直接 简单 适于 常规应用 m a d a n i 等用l c e s i m s 还测定了组胺l h 1 受体阻断剂特非那定及 其两种主要代谢物乙醇特非那定 t o h 和阿扎环醇 a z a c y c l o n o l a z 的浓度 2 9 1 a r a v a g i r i 纠3 0 用l c e s i m s m s 法同时测定人或大鼠血清中利哌酮 r s d 及其 主要循环代谢物9 o h r s d 的水平 该法简单 灵敏 快速 精确且选择性强 可用于精神分裂症患者r s d 治疗时进行药物监测以及研究r s d 及9 o h r s d 在 大鼠体内的药动学和组织分布等 随着h p l c m s 联用技术的普及 h p l c m s 极其串联技术广泛应用于药物分析和药代动力学研究 我们实验室在生物等效性 和药代动力学方面也取得不小的成绩 基于h p l c m s m s 方法建立对多种药物 血清浓度测量 研究了各种药物的其药代动力学参划3 卜3 4 1 3e s i m s 在有机反应中间体研究中的应用 e s i m s 在高静电梯度下 使样品溶液发生静电喷雾 在于燥气流中 形成 带电雾滴 随着溶剂的蒸发 通过离子蒸发等机制 生成气念离子 以进行质谱 分析的过程 e s i 是一种离子化技术 e s i 将溶液中的离子转变成气相离子 直 接进入e s l 分析 e s i 在相对较低温度下 逐步去溶剂化 因而是迄今最软的质 谱离子化技术 有机化学反应活性中间体的研究能够为化学反应进程的跟踪和反应机理的 推断提供直接准确实验数据 对于有机反应机理研究来洗 能检测到活性中间体 存在是机理研究中最有说服力的证据 但是反应中间体通常都是不稳定的 很难 6 中国科学技术人学硕一l 二学位论文 捕获 对于反应机理研究 般采用动力学研究的方法 对于非动力学研究方法主 要集中两种方法 一种是捕获活性中间后 例如苯炔中间体可以被蒽截获 自由 基反应中间体可以被碘捕获 第二种是利用反应中间体某些特殊的物理性质用仪 器进行检测 例如紫外拉曼 核磁共振 原位红外f 3 5 3 7 等 由于e s i 采用软电离技术 因此在e s i 中离子可以维持相对较弱的共价键或 者非共价键 不引起裂解反应 在质谱信号中得到分子离子峰 基本不会得到碎 片离子峰 同时e s i m s 能够迅速检测溶液中离子物种 e s i m s 技术具有将溶 液相离子完整转化为气相离子的能力 而且检测灵敏度高 特别适合捕获瞬问存 在的活性中间体 3 3 9 1 这些都为研究有机反应活性中间体提供可能 在检测活性 中间体过程中 e s i m s 方法检能提供待测离子质荷比和同位素分布情况 同时 串联质谱 m s 技术能对检测到的前级离子进行裂解分析 伴随中性碎片的丢失 可以为研究活性中间体提供相关信息 这些都为有机反应机理的研究提供了一条 崭新的途径 目前 电喷雾质谱及其串联技术在捕捉 表征反应活性中间体验证 反应机理方面取得突破性进展 4 0 4 4 1 早在1 9 9 3 年 w i l s o n l 4 5 1 等用一系列有机膦 反应来验证e s i m s 法能否用于反应活性中间体的捕捉 实验结果证明所有的离 子化合物和中性化合物的质子化离子都可以被检测到 这说明e s i m s 方法研究 反应活性中问体的可行性 近来国外m e t z g e r 研究小组和国内上海有机化学研究 所郭寅龙组在e s i m s 研究反应中间体领域作出了不少原创性工作 e s i m s 检 测表征反应中间体主要集中在以下两个领域内 一是离子型中问体的研究 另外 是对中性中问体的研究 3 1e s i m s 检测表征有机反应离子型中间体 在e s i 条件下 溶液中的离子型化合物可以被直接转化为气相进入e s i 被检 测 从而为e s i m s e s i m s 检测反应瞬问活性中问体开辟良好的研究途径 通 过活性中问体的分析 我们可以跟踪反应进程 推测可能的反应机理 金属型离 子化合物因为具有特殊同位素团簇峰 一直以来就是质谱学家研究的热点 例如 金属钯元素相关中间体 1 9 9 9 年i s o b e 4 6 等成功地应用e s i m s 方法直接捕捉到 溶液中 c p 宰r h 2 m 0 60 2 0 o m e 2 2 形成的关键中间体 c p 木r h m 0 3 0 s o m e 2 的单 电荷离子 金属催化偶联反应是一类重要的形成新的c c 的反应 偶联反应机 中固科学技术人学硕 学位论文 理的探讨对于反应进程的跟踪及其反应催化剂的设计都有重要的意义 r o g l a n s 47 等对钯催化偶联h e c h 反应机理进行深入研究 验证了氧化加成和还原 消除机理 e r b e r l i n t 4 8 j 等成功应用e s i m s 捕捉并且表征了h e c k 反应主要活性中 间体 从机理研究发现真正起催化作用是p d o 推断了催化循环过程 催化循 环过程见s c h e m e1 1 中国科学院上海有机化学研究所郭寅龙组 4 9 与麻生明组 合作 在无水无氧条件下 直接利用e s i m s 方法进行了p d o 催化三组分串联 双加成环化反应研究 通过降低反应速度 快速冷却e s i 检测方式捕获一系列脱 碘负离子钯活性中间体 相关钯活性中间体见s c h e m e1 2 h 3 0 l 2 p d 2 d b a 3 j b a s e h h 3 眈争 少l 一 厄d u c a l l p o d n c h 3 c n n c h 3 c p d d b a 如3 8 2 d b a m z5 5 8 8 h c o 3 n 南 c h 2 c n 0 9 9 定量下限为o 0 7 8p g m l 信噪i i s n 1 0 同马建立的还原方法相比较 我们的定量下限更低 他的结果是 o 1 0 7p g m l 显然我们的方法提高了检测下限 3 6 3 精密度与准确度 从硫普罗宁浓度为5 0 t g m l 1 2 5l a g m l o 7 8i t g m l 的储备液中各取1 0 雎l 加入不同的样品管中 再分别向其中j j h x 1 0p l 1 0 0p g m l 的福多斯坦内标溶液 然后加入1 0 0p l 空白血清 按 血清样品处理 项下操作 每一浓度进行5 样本 分析 制备出低 中 高三个浓度为0 0 7 8 1 2 5 5p g m l 的质控样品 根据当 日的标准曲线 计算质控样品的浓度 连续测定三天 根据质控样品结果计算本 法的精密度与准确度 包括同间精密度 准确度和f 1 内精密度 准确度 质控样 品结果见表2 1 准确度是用线性计算浓度与实际浓度比较得到 结果表明 日内 日间相对标准差 r s d 冬1 0 4 9 h 内 闩间相对误差 r e 0 9 9 定量下限为0 0 7 8g g m l s n 三1 0 回收率为8 8 9 1 日内 日间r s d 均不大 于1 5 日内 日间r e 在 1 5 之内 并且考察了硫普罗宁在不同处理条件下 的稳定性 证明了还原剂d t t 起到还原作用 该方法符合检测准确度 精密度 要求 单个样品检测时问只有4m i n 满足生物样品检测和高通量的要求 该方法灵敏 准确 快速 已成功的应用于2 4 个健康志愿者i s lj 艮2 0 0m g 硫普罗 宁的药代动力学研究 中国科学技术人学硕 学位论文 参考文献 1 f e r r s c c i o l i gf p e r i f n e r v e t t i a m e r c a d a n t i m c a v a l i e r i f d a l l a g l i o p p s a v i m f e r r a r i c c l i n e x p r h e u m a t 0 1 19 8 6 4 9 2 l i n d e l l a d e n n e b e r g t h e l l g r e n e j e p p s s o n j o t i s e l i u s h gu r 0 1 r e s 1 9 9 5 2 3 1 1 3 i c h i d a f s h i b a s a k i k t a k i n o t 一i n t m e d r e s 19 8 2 1 0 3 2 5 4 i c h i k a w a h i m a i z u m i k t a z a w a yo p h t h a l m o l o g i c a 19 8 0 1 8 0 2 9 3 5 a m o r b m e r y c d e g e r y a a r t h r i t i s r h e u m 19 8 2 2 5 6 9 6 赵e i j 秦玉花 高恩民 乒厦势雾2 0 0 7 1 0 11 8 3 7 张晓景 乒同继2 0 0 5 1 4 9 1 8 8z h a o yn b a e y e n s w r g z h a n g x r c a l o k e r i n o s a c n a k a s h i m a k v a n d e r w e k e n g v a n o v e r b e k e a c h r o m a t o g r a p h i c 19 9 7 4 4 31 9 m a t s u u r a k t a k a s h i n a h c h r o m a t o g r 1 9 9 3 6 1 6 2 2 9 1 0 s i a n g p r o h w w a n g f u e n g k a n a g u l n c h a i l a p a k u l o a n a l c h i m a c t a 2 0 0 3 4 9 9 1 0 1 11 h u a n g t m d e n g c h y u yj z h e n g x w d u a n gl j c h r o m a t o g r b 2 0 0 6 6 3 5 5 1 12 k u s r n i e r e k k b a l d e a n a l c h i m a c t a 2 0 0 6 5 9 0 13 2 13 l i u j f w u h h h o u y n zc h r o m a t o g r a 2 0 0 6 8 4 4 1 5 3 1 4 m a t s u u r a k m u r a i k f u k a n o y t a k a s h i n a h 一p h a r m b i o m e d a n a l 2 0 0 0 2 2 1 0 1 15 l i l c h e n x j w a n g gj w a n g j p d a v e y a k j c h r o m a t o g r 2 0 0 6 6 4 6 5 5 1 6 m a j y g u yl c h e n b y a o s z c h e n z e c h r o m a t o g r a 2 0 0 6 1 1 1 3 5 5 3 7 中围科学技术人学颀 学位论文 第三章e s i m s 研究l 脯氨酸催化a l d o l 缩合反应机理 1 引言 1 1l 脯氨酸催化不对称有机反应研究进展 近年来不对称有机合成得到长足发展 在不对称合成中手性催化剂起到重要 作用 近年来有机化学家合成很多结构复杂的手性催化剂 但这些手性催化剂结 构复杂 不易制备 因此寻找具有高效不对称催化效率 结构简单的小分子催化 剂成为有机化学家的目标 l 脯氨酸作为一种天然氨基酸 结构简单 环境友好 1 1 可以催化羟醛缩合反应 m a n n i c h 反应 共轭加成反应等 2 1 2 0 0 0 年 l i s t t 3 等首次报道了l 脯氨酸催化的丙酮与不同醛之间的不对称 直接羟醛缩合反应 并考查了一系列氨基酸的催化活性 研究发现l 脯氨酸具有 比其它大多数氨基酸更高的催化活性 l 脯氨酸催化丙酮和醛的反应具有较好的 底物适应范围 甚至对一些脂肪醛 如异丁醛也能得出较好的结果 产率在8 1 e e 值高达9 9 具体见s c h e m e3 1 1 4 1 人 h 儿r 面而丽蒜e 从r c o m pa b c 1 i de f g h r 仑 电心b r 屯m 丫火 y i e l d 6 8 6 2 7 4 9 45 5 9 7 8 1 6 3 e e 7 6 6 06 5 6 9 7 79 6 9 98 4 s c h e m e3 1 m a c m i l l a n t 5 1 首次实现l 脯氨酸催化的醛与醛之间的直接不对称a l d o l 反应 为了避免醛醛自身缩合 m a c m i l l a n 选择了0 位具有较大取代基的醛作受体 产 物的e e 大多大于9 9 产率在7 5 8 8 之间 反应结果见s c h e m e3 2 3 8 中国科学技术大学颀f 学位论上 八o h 八or 警eh v 0 o h r r 吱 y i e l d7 5 8 8 e e 9 1 9 9 r m e b u r l e t i b u i p r c 6 h ll p h s o l v e n t c 6 h 6 c h c l 3 e t o a c t h f d i o x a e m e c n d m s o n m p s c h e m e3 2 l i s t t 6 1 等人首先报道了l 脯氨酸催化的直接三组分m a n n i c h 反应 这是对三 组分反应的首次运用 反应方程式见s c h e m e3 3 v 渊9 2 2 n q 3 5m 0 1 l p r o l o n e s c h e m e3 3 n 0 2 o m e s t e p h e n 7 1 发现硝基烷烃和环状共轭烯酮在l 脯氨酸催化下 反式2 5 二甲基 哌嗪作为添加剂时 生成不对称1 4 迈克尔加成产物 其中环己烯酮的e e 值最 好 反应方程式见s c h e m e3 4 o r l r n 0 2 3 7 m 0 1 l p r o l i n e 2 5 d i m e t h y p r i p e r i a x i n e s c h e m e3 4 3 9 o r 七 n 0 2 r l 中固科学技术人学硕i j 学位论文 1 2l 脯氨酸催化直接不对称a l d o i 反应 2 0 0 0 年 b a r b a s l 3 研究小组发现以l 脯氨酸为催化剂 d m s o 为溶剂 多种 芳香醛和a 位有取代基的脂肪醛可与过量的丙酮或0 羟基丙酮在室温下反应 得 到具有光学活性的a l d o l 产物 产物的收率和e e 值的高低取决于醛组分的结构 对一般的芳香醛 收率中等 e e 值在7 0 左右 脂肪醛中异丁醛与丙酮反应的 产率和e e 值最高 可分别达到9 7 和9 6 在a l d o l 反应的机理研究中 a g a m i l 剐 等早期提出两分子参与过渡态形成过程 指出第一分子l 脯氨酸与酮形成烯胺 然后第二分子参与质子转移过程 l i s t 2 3 1 等后来根据动力学 立体化学和溶液 稀释等实验室证据提出单一分子l 脯氨酸参与过渡态形成的烯胺历程 提出详细 的机理 认为l 脯氨酸提供亲核性氨基和酸碱共催化作用 先与丙酮形成烯胺 再作为亲电试剂进攻醛 形成三元环中间体 l 脯氨酸烯胺对醛优先在r e 面加成 并且指出三元中的氢键结构控制了反应的对腆冼择性 1 3 研究l 脯氨酸催化直接不对称a l d o l 反应机理 电喷雾质谱法 e s i m s 由于采用软电离技术 可以维持相对较弱的共价键或 者非共价键 e s i 技术具有将溶液相离子完整转化为气相离子的能力而且检测灵 敏度高 同时e s i m s 能够迅速检测离子化合物 这些都为研究有机反应活性中 间体提供可能 在表征有机反应活性离子中问体过程中 e s i m s 方法检测到的 离子质荷比和同位素分布情况可以用来推断反应中问体结构 同时串联质谱 m s i l l 对检测到的前提离子进行裂解分析 伴随中性碎片的丢失 可以为离子 稳定性 活性以及结构提供相关信息 这些都为有机反应机理的研究提供了一条 崭新的途径 电喷雾技术与串联质谱 m s n 技术的联用可以提供一种更直接 高 效的方法研究有机反应活性中间体 目前 电喷雾质谱及其串联技术在捕捉 表 征反应的活性中间体验证其机理方面取得突破性进展1 9 以5 1 m e t z g e r 1 6 在2 0 0 6 年首先利用在线电喷雾质谱检测技术 结合e s i m s m s 裂解技术捕捉到l 脯氨酸催化直接不对称a l d o l 反应关键活性中间体烯胺 验证 了l i s t 等人提出的烯胺中间体机理 而且对所有关键中间体5 6 7 8 进行结构 确证 具体催循环过程见s c h e m e3 5 实验m e t z g e r 仅在正离子检测模式下捕获 到相关中间体 而且仅对相关中间体进行二级裂解分析 中国科学技术人学硕 学位论文 v y h 形h 删粤紫丫 h o 心4h 0 心 喇蠢r0 r h o o c 也叫亍勺 氆叫 2 活性中间体捕捉实验 s c h e m e3 5 2 1 实验仪器装置 t s qq u a n t u mu l t r aa m 型液相色谱一质谱联用仪 美国t h e r m of i n n i g a n 公 司 l c qa d v a n t a g em a x 质谱仪 美国t h e r m of i n n i g a n 公司 保定兰格系列注 射泵 流速0 1g l m i n 10 m l m i n 采用在线连续进样模式 通过一个注射泵注入反应液到三通管中 另外一个 4 1 十圜科 拉术 m n 硷 注射泵注入稀释液体到三通管中 二者在三通管内混合后 混合液连续直接进入 e s i 离子源进行e s i m s 和e s i m s 质谱分析 实验在线榆测反应简化装置如下 s c h e m e3 6 所示 三通直接通过毛细管与e s i 离子源直接相连 2 2h p l c m s m s 优化条件 2 2 1 质谱优化条件 离子源 e s i 离子源 s c h e m e3 6 离子极性 j f 离子 检测模式 选择反应监测 s r m 电喷雾 乜压 4 6k v 鞘气压力 4 5a r b i t r a r y 辅助气压力 毛细管温度 碰撞气压力 检测离子 m z 15 6 1 1 0 碰撞能4 0 扫描宽度 n d z0 2 扫描时叫 o5s w m篇 中围科学技术人学硕l 学位沦文 2 2 2 色谱优化条件 流动相 甲醇 水 v 5 0 v 5 0 洗脱模式 非梯度洗脱 流动相流速 0 2m l m i m 柱温箱温度 2 5 2 3 中间体捕获实验步骤 2 3 1l 脯氨酸e s i m s 分析 1 1 5m gl 脯氨酸溶解于1 0m l 甲醇溶液 l 脯氨酸浓度为0 0 1m 所得溶 液用甲醇稀释1 0 0 倍 注射泵5g l m i n 注入l c q 离子阱质谱进行质谱分析 质 谱正负离子模式扫描分析 连续扫描3 0m i n 同时在正离子扫描模式下进行 e s i m s m s 裂解分析 2 3 2 中间体5 6e s i m s 分析 离线分析 1 1 5m gl 脯氨酸溶解于1 0m l 丙酮 甲醇混合溶液 1 4 v v 室温下反应1 0m i n 混合溶液用注射泵流速以5 l m l 注入三通管内 另外一 个注射泵以1 0 0g l m i n 流速注入甲醇稀释液到三通管中 在三通管内甲醇稀释 混合液后直接进入e s i 离子源进行质谱分析 质谱在正离子模式扫描分析 同时 对l 脯氨酸和丙酮反应产生活性中间体离子进行e s i m s m s 裂解分析 在负离 子扫描模式下对反应产物也进行检测 在线分析 1 l 5m gl 脯氨酸溶解于1 0m l 甲醇溶液中 混合溶液在注射泵 流速5g l m l 注入三通管内 另外一个注射泵内注入丙酮 以流速5 0 l m l 注 入三通管内 l 脯氨酸和丙酮溶液在三通管内混合后直接进入e s i 离子源进行质 谱分析 质谱正离子模式扫描分析 同时对l 脯氨酸和丙酮反应产生活性中间 体离子进行e s i m s m s 裂解分析 在负离子扫描模式下对反应活性中间体也进 行检测 2 3 3 中间体7 8e s i m s 分析 1 1 5m gl 脯氨酸溶解于1 0m l 无水丙酮 甲亚砜混合溶液 1 4 v v 混 4 3 中冈科学