制药复习题.doc

1、 生物技术包含哪些方面的内容？答：基因工程（核心和关键，主导技术）、细胞工程（基础）、酶工程（条件）、发酵工程（获得产品的手段）及生化工程2、 生物技术药物有哪些特点？答：分子结构复杂具有种属特异性治疗针对性强、疗效高稳定性差基因稳定性免疫原性体内的半衰期短受体效应多效性和网络性效应检验的特殊性3、 基因工程技术的概念及基因工程药物生产的过程？答：基因工程技术是将重组对象的目的基因插入载体，拼接后转入新的宿主细胞，构建成工程菌，实现遗传物质的重新组合，并使目的基因在工程菌内进行复制和表达的技术。一般程序：获得目的基因组建重组质粒构建基因工程菌（或细菌）培养工程菌除菌过滤半成品检定包装4、 目的基因获得的方法有哪些？答：一、逆转录法：mRNA的纯化cDNA第一链的合成cDNA第二链的合成cDNA克隆将重组体导入宿主细胞cDNA文库的鉴定目的cDNA克隆的分离和鉴定二、反转录-聚合酶链反应法：该方法是mRNA经反应转录合成cDNA第一链，不需要再合成cDNA第二链，而是在特异引物协助下，用PCR法进行扩增，特异性地合成目的cDNA链，用于重组、克隆。三、化学法：较小的蛋白质和多肽的编码基因可以用人工化学合成法获得。合成目的基因DNA不同部位的两条链的寡核苷酸短片段，再退火成为两端形成粘性末端的DNA双链片段，然后将这些双链片段按正确的次序进行退火连接成较长的DNA片段，再用连接酶连接成完整的基因。5、反转录法、反转录PCR、反转录法操作流程 答：反转录法：为了克隆编码某种特异蛋白质多肽的DNA序列，可以从生产该蛋白的真核细胞中提取mRNA，以其为模板，在反转录酶的作用下，反转录合成该蛋白质mRNA互补DNA（cDNA第一链），再以cDNA第一链为模板，在反转录酶或DNA聚合酶作用下，最终合成编码该多肽的双链DNA序列。反转录-聚合酶链反应法：该方法是mRNA经反应转录合成cDNA第一链，不需要再合成cDNA第二链，而是在特异引物协助下，用PCR法进行扩增，特异性地合成目的cDNA链，用于重组、克隆。逆转录法：mRNA的纯化cDNA第一链的合成cDNA第二链的合成cDNA克隆将重组体导入宿主细胞cDNA文库的鉴定目的cDNA克隆的分离和鉴定6、宿主菌选择的依据，常用的宿主菌有哪些？答： 容易获得较高浓度的细胞； 能利用易得廉价原料 不致病、不产生内毒素 发热量低，需氧低，适当的发酵温度和细胞形态 容易进行代谢调控 容易进行DNA技术操作 产物的产量、产率高，且易提取纯化。菌种：原核细胞：大肠杆菌、枯草芽孢杆菌，链霉菌；真核细胞：酵母、丝状真菌7、基因工程菌的不稳定性表现在哪些地方？提高的方法有哪些？答：基因工程菌的遗传不稳定性主要表现在重组质粒的不稳定性，这种不稳定性具有下列两种表现形式： 结构不稳定性：重组DNA分子上某一区域发生缺失、重排、修饰，导致其表观生物学功能的丧失。 分裂不稳定性：整个重组DNA分子从受体细胞中逃逸提高方法：1、选择合适的宿主菌；2、选择合适的载体；3、选择压力；4、分阶段控制培养；5、控制培养条件；6、固定化8、基因工程药物的分离纯化的基本过程，细胞破碎的方法有哪些？ 答：细胞破碎、固液分离、浓缩与初步纯化、高度纯化直至得到纯化以及成品加工细胞破碎方法：物理破碎法：（1）高压匀浆法（2）高速珠磨法（3）超声波破碎法（4）高压挤压法；化学破碎法：（1）渗透冲击（2）增容法（3）脂容法；生物破碎法：生物酶消化溶解细胞壁和细胞膜的方法。9、蛋白质分离纯化的基本方法及其基本原理 答：分离原理分离方法分子大小凝胶过程电荷离子交换等电点色谱聚焦疏水特性疏水作用反相生物亲和性亲和10、产品的保存方法答：1、液态保存：（1）低温保存（2）在稳定PH条件下保存（3）高浓度保存（4）加保护剂保存2、固态保存：制成干粉或结晶，冷冻干燥11、离体培养的细胞分类答：贴壁依赖型（贴壁细胞）和贴壁非依赖型（悬浮细胞）12、接触抑制、细胞工程答：接触抑制：当细胞在基质上分裂增殖，逐渐会合成片时，即每个细胞与其周期的细胞相互接触时。细胞就停止繁殖。此时若能保持充足的营养，细胞仍可存活相当一段时间。但细胞密度密度不再增加，所以该现象称之为接触抑制或密度依赖抑制现象。细胞工程：以细胞为单位，按人们的意志，应用细胞生物学、分子生物学等理论和技术，有目的地进行精心设计，精心操作，使细胞的某些遗传特性发生改变，从而达到改良或生产新品种的目的，以及使细胞增加或重新获得产生某种特定功能产物的能力，从而在离体条件下进行大量培养、增值，并提取出对人类有用的产品。13、生产用动物细胞有哪几类，基本概念答：1、原代细胞：原代细胞是直接取自动物组织、器官，经过粉碎、消化而获得的细胞悬液。2、二倍体细胞系：原代细胞经过传代、筛选、克隆，从而从多种细胞成分的组织中挑选并纯化某种具有一定特性的细胞株。3、转化细胞系：这类细胞是通过某个转化过程形成的，他常常由于染色体的断裂变成了异倍体，从而失去了正常细胞的特点，而获得了无限增值的能力。4、融合细胞系：两个或两个以上的细胞合并成一个细胞的过程。5、重组工程细胞系14、基因载体导入动物细胞的方法？答：融合法化学法物理法病毒法细胞融合法DNA-磷酸钙电穿孔法重组逆转病毒介导法脂质体融合法DEAE-葡聚糖法显微注射法重组DNA病毒介导法微生物介导法染色体介导法基础枪法多瘤病毒样颗粒介导法原生质融合法鬼影红细胞介导法15、动物细胞培养基的分类，无血清培养基的优点答：1、天然培养基；2、合成培养基；3、无血清培养基无血清培养基优点：提高细胞培养的可重复性，避免了由于血清批次之间差异的影响减少了由血清带来病毒、真菌和支原体等微生物的危险供应充足、稳定。细胞产品易于纯化避免了血清中某些因素对有些细胞的毒性减少了血清中蛋白对某些生物测定的干扰，便于对实验结果的分析。16、动物细胞产品分离纯化高成本的原因是什么？答：工程细胞表达的产物，通常和细胞内容物、培养及成分，特别是当采用有血清培养基时小牛血清中的各种蛋白成分等都将与产物混杂在一起，而这些成分的物化性质又常常和目的产物非常相似，因此很难将它们分离开由于产品多数用于人体，为防止杂质对人体的有害作用，因此对产品的纯度要求很高大多数动物细胞表达的产物产量低、生物活性很不稳定，因此要求纯化过程中所有的操作都应该非常温和、精细，包括溶液的温度、PH和盐离子强度等都需要严格控制，这就需要有相当精密的设备和检测仪器由于细胞产品多种多样，它们的氨基酸组成、结构、相对分子质量大小和等电点等都不尽相同，因此分离纯化技术的通用性差，必须根据每一种产品的特点研究开发出适合于该产品的专用的分离纯化技术。17、单克隆抗体的概念及其基本制备流程答：单克隆抗体：由一种抗原决定簇刺激机体，由一个B淋巴细胞接受该抗原所产生的抗体。单克隆抗体具有高度特异性、均一性、来源稳定、可大量生产等特点。制备流程：淋巴细胞（致敏动物的脾细胞）+骨髓瘤细胞（腹水癌型浆细胞） 把融合细胞选择出来使成单个细胞，培养杂交瘤细胞 使能产生抗体的杂交瘤细胞克隆化把已克隆化的杂交瘤 把已克隆化的杂交瘤细胞细胞进行大量培养 注入纯系小鼠腹腔内 培养液中含单克隆抗体 小鼠腹水中含单克隆抗体18、单克隆抗体存在的两大问题是什么？答：单克隆抗体均是鼠源性抗体，应用于人体内可产生人鼠抗体，加速了排斥反应，在人体内半衰期只有56h，难以维持有效药物作用靶组织时间。完整的抗体分子，即Ig的相对分子质量过大，难以穿透实体肿瘤组织，达不到有效的治疗浓度。改造：降低单克隆抗体的免疫原性。降低单克隆抗体的相对分子质量。19、单克隆抗体及其结构答：一、 人-鼠嵌合抗体将鼠单克隆抗体（MAb）的可变区和人抗体的恒定区组成嵌合二、 改形抗体在嵌合抗体的基础上进一步将鼠单克隆抗体（MAb）可变区中相对保守的FR替换成人的FR，保留与抗原结合的CDR部位（即CDR移植）三、 Fab和Fv抗体Fab抗体：Fab段由重链V区及CH1功能区与整个轻链以二硫键形式连接而成，主要发挥抗体的抗原结合功能。Fab抗体相对分子量只有完整lgG的1/3。Fv抗体：由VH和VL组成的具有完整抗原结合位点的最小抗体片段，表现出与完整抗体相似的结合活性，它的发现推动了抗体的体外重组技术的发展。四、 单链抗体单链抗体（scFv）是由VH和VL 通过连接肽（接头）重组并表达而成的另外一种小分子抗体，是具有亲代抗体全部抗原结合特意性的最小功能结构单位。五、单域抗体和分子识别单位抗体与抗原的结合主要是由lg的V区决定，因此只含V区基因片段的小分子抗体，即只有VH或VL 一个功能结构域，也能保持原克隆抗体的特异性。这种小分子的抗体片段就称为单域或单区抗体，其分子量仅为整个lg分子的1/12，故称之为小抗体。抗体抗原的结合是经过互补决定区（CDR）而实现的。因此，CDR是构成抗原抗体的最小结构单位，根据这一特点，可以设计出那些在抗原识别及亲和力方面有重要意义的CDR多肽，直接用于诊断或治疗，可望获得理想的结果。这种只含有一个CDR多肽的抗体，称为超变区多肽（HRP），亦称为最小识别单位。20、双功能抗体、多功能抗体答：双功能抗体就是双特异性单链抗体。将两条不同来源的scFv组合成具有两种不同抗原结合特征的新型抗体即为双特异单链抗体。多功能抗体：在scFv的基础上，可以把两个或两个以上的scFv重组在一起，由此可制备成多价小分子抗体即微型抗体（简称多价微抗）。其中包括双链抗体，三链抗体，微型抗体及四链抗体等。21、植物细胞的全能型、分化、再分化、次级代谢及次级代谢产物答：全能型：植物体中任何一个具有完整细胞核（完整染色体组）的细胞，在一定条件下都可以重新再分化形成原来的个体。分化：可以分为胚胎发生和器官发生两个阶段。前者从精子与卵细胞结合开始，分化为幼胚，进而发育为成熟胚和种子。种子在适宜条件下萌发，通过器官分化过程，形成根、茎、叶、花和果实。再分化：通过脱分化诱导形成的愈伤组织在适宜的培养条件下可再分化成为胚状体或直接分化出器官。次级代谢：是由特异性蛋白质调控产生的内源化合物的合成、代谢及分解作用的综合过程。次级代谢产物：具有如下特征的成分称为次级代谢产物（1）有明显的分类学区域界限（2）其合成需要在一定条件下才能进行（3）缺乏明显的生理功能（4）是生命过程的多余成份。22、植物细胞的结构特征答：基本特征是含有刚性的细胞壁和大的液泡。23、影响植物细胞次级代谢产物的积累的因素？答：影响因素：（1）生物条件-外植体、取材季节、休眠、分化。（2）物理条件-温度、光照、氧气、PH值、渗透压。（3）化学条件-无机盐（N、P、K），碳源、植物生长调节剂、维生素、氨基酸、核酸、抗生素、天然物质、前体。（4）工业培养条件-培养罐类型、通气、搅拌、培养方法。24、诱导子：PPT：触发植物细胞开始合成次级代谢产物的信号物质就是诱导子（书上：是植物抗病生理过程中诱发植物产生植物抗毒素和引起植物过敏反应）分类：（1）内源性诱导子（2）外源性诱导子：多糖类，糖蛋白类，蛋白质类和不饱和脂肪酸类。25、酶工程研究的主要内容？酶工程：从应用的目的出发研究酶、应用酶的特异性催化功能并通过工程将相应原料转化为有用物质。答：a. 酶的分离纯化、大批量生产及新酶和酶的应用开发；b. 酶和细胞的固定化及酶反应器的研究，包括酶传感器、反应监测；c. 酶生产中基因工程技术的应用及遗传修饰酶的研究；d. 酶的分子改造和化学修饰，结构与功能的研究；e. 有机相中没反应的研究；f. 酶的抑制剂、激活剂的开发与应用研究；g. 抗体酶、核酸酶的研究；h. 模拟酶、合成酶及酶分子的人工设计、合成研究。26、酶的固定化方法，各自的优缺点？答：指限制或固定于特定空间位置的酶，具体来说，是指经物理或化学方法处理，使酶变成不易随水流失即运动受到限制，而又能发挥催化作用的酶制剂，制备固定化酶的过程称为酶的固定化。一、载体结合法： 物理吸附法 离子结合法 共价结合法二、交联法三、包埋法 微囊型 胶囊型物理吸附法：用物理方法将酶吸附于不溶性载体的一种固定方法优点：操作简单，可选用不同电荷和不同形状的载体；固定化过程可与纯化过程同时实现；酶失活后载体仍可再生。缺点：吸附酶量无规律可循，对不同载体和不同酶的吸附条件不同，吸附量与酶活力不一定呈平行关系；酶与载体之间结合力不强，酶易于脱落，导致酶活力下降并污染产物 离子结合法：离子结合法是酶通过离子键结合于具有离子交换的水不溶性载体上的固定化方法优点：操作简单、处理条件温和，酶的高级结构和活性中心的氨基酸残基不易被破坏，能得到酶活回收率较高的固定化酶。缺点：载体和酶的结合力比较弱，容易受缓冲液种类或pH的影响，在离子强度高的强度下进行反应时，往往会发生酶从载体上脱落的现象。共价结合法：共价结合法使酶以共价结合于载体上的固定化方法优点：酶与载体结合牢固，稳定性好，一般不会因底物浓度高或存在盐类等原因而轻易脱落。缺点：反应条件苛刻，操作复杂，而且由于采用了比较强烈的反应条件，会引起酶蛋白高级结构的变化，破坏部分活性中心，所以往往不能得到比活高的固定化酶，甚至底物的专一性等酶的性质也会发生变化。二、交联法：是用双功能或多功能试剂使酶与酶或微生物的细胞与细胞之间交联的固定化方法。交联法与共价结合法一样也是利用共价键固定酶的，所不同的是它不使用载体优缺点：交联法的反应条件比较激烈，固定化酶的酶活回收率一般比较低，但是尽可能降低交联剂的浓度和缩短反应时间将有利于固定化酶比活的提高。一般用交联法所得到的固定化酶颗粒小、结构性能差、酶活性低，故常与吸附法或包埋法联合使用。如：先用明胶包埋，在用戊二醛交联。三、包埋法：将酶或细胞包埋在高分子凝胶细微网格中的称为网络型，将酶或细胞包埋在高分子半透膜中的称为微囊型。适于：小分子的底物和酶优缺点：包埋法制备固定化酶的条件温和，不改变酶的结构，操作时保护剂及稳定剂均不影响酶的包埋率，适用于多种酶、粗酶制剂、细胞器和细胞的固定化。27、酶固定化后有哪些变化？为什么？答： 酶活力的变化 ：酶经过固定化之后活力大都下降。其原因主要是酶活性中心的重要氨基酸与载体发生结合，酶的空间结构发生变化或酶与底物结合时存在空间位阻效应。包埋法中还有底物与产物扩散阻力增大。 酶稳定性的变化包括对温度、pH、蛋白酶变性和抑制剂的耐受程度。固定化后，稳定性提高，有效寿命延长。其原因是限制了酶分子之间的相互作用，阻止了其自溶，增加了酶构型的牢固程度。操作稳定性B、贮藏稳定性C、热稳定性D、对蛋白酶的稳定性 酶学特性的变化：A、底物专一性下降。B、最适pH：最适pH可能变大，也可能变小pH-酶活曲线可能发生变化，其变化与酶蛋白和载体的带电性质有关。C、最适温度：一般升高，原因是固定化后空间结构更为稳定。D、米氏常数（Km）：Km值均发生变化，有的增加很小，有的增加很大，但不会变小。E、最大反应速度（Vm）：变化很小或不定。28、主客体酶、胶束酶、分子印记酶，分子印记酶的操作流程？答：主客体酶模型：可提供一个疏水的结合部位并能与一些无机和有机分子形成包结络合物，以此影响和催化一些反应胶束酶模型：胶束在水溶液中提供了疏水微环境，可以对底物束缚，如果将催化基团如羟基、咪唑基、巯基和一些辅酶共价或非共价地连接或吸附在胶束上，就有可能提供活性中心部位，使胶束成为具有酶活力或部分酶活力的胶束模拟酶。分子印记酶模型：通过分子印迹技术可以产生类似于酶的活性中心的空腔，对底物产生有效的结合作用，并可以在结合部位的空腔内诱导产生催化基团，并与底物定向排列。过程：1、选定印迹分子和功能单位，让它们之间发生互补作用，形成印迹分子功能单位复合物。2、用交联剂在印迹分子功能单位复合物周围发生聚合反应，形成交联的聚合物。3、从聚合物中除去印迹分子，得到对印迹分子具有选择